Inducida por la generación de células madre pluripotentes a partir de células de la sangre usando el virus Sendai y centrifugación

Resumen

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Resumen

El reciente desarrollo de las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) demostró que las células somáticas maduras pueden volver a un estado indiferenciado, pluripotente. Ahora, la reprogramación se lleva a cabo con varios tipos de células somáticas adultas: queratinocitos, células de orina, fibroblastos, etc. Los primeros experimentos se hace generalmente con fibroblastos dérmicos. Sin embargo, esto requiere un procedimiento quirúrgico invasivo para obtener fibroblastos de los pacientes. Por lo tanto, las células en suspensión, tales como células de sangre y orina, se considera ideal para la reprogramación debido a la comodidad de la obtención de las células primarias. Aquí, se presenta un protocolo eficiente para la generación de IPSC a partir de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Mediante siembra de las PBMCs transducidas en serie a una nueva placa usando centrifugación matriz recubierta, este protocolo puede proporcionar fácilmente colonias IPSC. Este método es aplicable a células mononucleares de sangre de cordón umbilical (CBMC) también. Este estudio presenta una prot simple y eficienteocol para la reprogramación de las PBMC y CBMC.

Introducción

Las células madre han sido uno de los materiales más atractivos de la terapia clínica desde hace varias décadas ^1. Las propiedades atractivas de las células madre son la pluripotencia y la capacidad de auto-renovación. En 1981, se aislaron las primeras células madre embrionarias (CES) a partir del embrión de ratón ^2. Sin embargo, cuando la técnica se aplicó a los embriones humanos, se enfrentó a varios problemas éticos.

En 2006, cuando el Dr. Yamanaka y su equipo reprogramar la primera célula pluripotente de las células somáticas de ratón, el campo de células madre recuperó su posibilidad y el interés se reavivó ^3. Mediante la entrega de varios factores definidos, las células madre pluripotentes fueron correctamente "inducidos" a partir de células somáticas adultas, y por lo tanto se denominan "células madre pluripotentes inducidas (iPS)." En 2007, esta técnica se aplicó a las células humanas ^4, las células con las características exactas de los CES rendimiento pero ninguno de debate ético. Teóricamente, las iPSCs puede generarse a partir de cualquier tipo de célula obtenido de cualquier persona o paciente. iPS específicas de pacientes se están levantando como una herramienta potencial que puede simular los fenotipos de la enfermedad y las condiciones epigenéticas de cada paciente individual. El uso de la edición de genes u otros métodos que pueden revertir la condición patógena, iPSCs específicos del paciente también pueden ser utilizados en la medicina personalizada ^5. Por otra parte, iPSCs están menos asociadas con el rechazo inmunológico debido a que tienen la misma identidad inmune como donante, haciendo auto-trasplante más factible ^6. Por lo tanto, iPSCs se han convertido en la plataforma más prometedora en el modelado de la enfermedad, la detección de drogas y terapias regenerativas. Teniendo en cuenta estos beneficios, la mejora de los protocolos que se dan más puro y mayores rendimientos en el menor tiempo posible de la fuente de células más pequeñas son constantemente en desarrollo. Una consideración importante de encontrar el protocolo más eficiente para la aplicación en el futuro es el principal tipo de células. La mayor parte de los primeros proto generación de IPSCcols están optimizados para las células adherentes ya que las líneas de IPSC originales fueron inducidas a partir de fibroblastos de la piel ^4. Sin embargo, el aislamiento y la preparación de estas células son mano de obra intensiva. Además, el aislamiento de los fibroblastos de la piel incluye procedimientos quirúrgicos invasivos que pueden convertirse en un defecto importante para una aplicación más amplia.

Por lo tanto, para el uso adicional de iPSCs, se requiere una fuente de células con la adquisición conveniente. La sangre se considera como una fuente de células ideal, ya que se obtiene a través de un procedimiento bastante mínimamente invasiva ^7-9. En este estudio, hemos desarrollado una simple modificación al protocolo de generación de hiPSCs a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Sin el proceso de expansión difícil de un tipo específico de célula, como las células CD34 +, las células de sangre entera o PBMCs se sembraron en serie en placas de matriz recubierto por centrifugación después de la transducción con el virus de Sendai que contiene factores de Yamanaka. Este método reduce el tiempo requerido para launión de las células transducidas flotantes y la disminución de la pérdida de células reprogramadas que no eran capaces de unirse por su cuenta.

Protocolo

Declaración de Ética: Este protocolo de estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (KC12TISI0861).

1. Aislamiento de células monocíticas de la sangre

1. El aislamiento de las células monocíticas (Día -5)
   1. Obtener al menos 10 ml de sangre fresca de una extracción de sangre en un tubo de preparación de células (CPT).
   2. La transferencia de la sangre a un nuevo tubo cónico de 50 ml y diluir con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a una proporción de 1: 4.
      NOTA: una mayor proporción de dilución se puede utilizar para una mayor pureza.
   3. Añadir 10 ml de medios de gradiente de densidad a un nuevo tubo cónico de 50 ml y la capa cuidadosamente la sangre diluida en la parte superior de los medios de gradiente de densidad. Centrifugar a 750 xg durante 30 min a temperatura ambiente (RT) sin un freno de centrifugación.
   4. transferir con cuidado la capa leucocitaria a un nuevo tubo cónico de 50 ml, añadir 30 ml de PBS al tubo y lavar las células.
   5. Centrifugar las células a 515 xg durante 5 min a TA.
   6. Desechar el PBS y resuspender las células en 0,5 ml de medio de células sanguíneas.
   7. Contar las células y la placa 1 x 10 ⁶ células por pocillo de una placa de 24 pocillos. Añadir PBS a los pocillos circundantes para evitar la evaporación.
   8. Estabilizar las células durante 5 días a 37 ° C en 5% de CO ₂ antes _de la transducción. Añadir un adicional de 0,5 ml de medio de células de sangre fresca en los días 3-4 sin molestar a las células.

2. La transducción por el virus de Sendai

1. Transducción (Día 0)
   1. Recoger y transferir las células de la sangre a un tubo cónico de 15 ml y contarlos utilizando un hemocitómetro.
   2. Preparar 3 x 10 ⁵ células por transducción y centrifugar las células a 515 xg durante 5 min a TA.
   3. Eliminar el sobrenadante por aspiración y resuspender las células en 0,5 ml de medio de células sanguíneas.
   4. Transferir las células a un pocillo de una placa no recubierta 24 pocillos.
   5. Descongelar la mezcla de virus Sendai en hielo y añadirlo a la Dospended células. Añadir virus Sendai a las células en base a las recomendaciones del fabricante.
   6. Sellar la placa con una lámina de sellado y se centrifuga a 1.150 xg que durante 30 minutos a 30 ° C.
   7. Después de la centrifugación, se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO ₂ durante la noche (O / N).
2. la transferencia de células de matriz de alimentación (Día 1)
   1. Al día siguiente, recubrir una placa de 24 pocillos con vitronectina. Diluir la solución de vitronectina en PBS para una concentración / ml 5 mg final. Añadir 1 ml de vitronectina a un pocillo de una placa de 24 pocillos y se incuba a TA durante al menos 1 hr. Eliminar la solución de recubrimiento antes de su uso. Las placas recubiertas se pueden almacenar en RT durante 3 días.
   2. Transferir todos los medios que contienen las células y el virus al pocillo recubierto.
   3. Recoger las células restantes con un adicional de 0,5 ml de medio de células de la sangre fresca y añadirlo al pozo que contiene células.
   4. Centrifugar la placa a 1.150 xg durante 10 minutos a 35 ° C.
   5. después cientorifugation, eliminar el sobrenadante, añadir 1 ml de medio de IPSC, y mantener las células a 37 ° C en 5% de CO ₂ O / N.
3. En segundo lugar la transferencia de células (Día 2)
   1. Recubrir los pocillos de una nueva placa de 24 pocillos con 5 mg / ml de vitronectina, como se describe en el paso 2.2.1. Utilice un pocillo de la placa para cada transducción.
   2. Transferir la suspensión celular de la primera placa a la placa de vitronectina recién recubierto.
      NOTA: Si no es necesario, las células en suspensión pueden ser descartados. El procedimiento mencionado en el paso 2.3 se puede repetir 2-3 veces con las células en suspensión. Si se repetirán los pasos, recoger las células.
   3. Mientras tanto, añadir 1 ml de medio de IPSC al pozo de la primera placa, para el mantenimiento, e incubar a 37 ° C en 5% de CO ₂ O / N.
   4. Mantener las células unidas a 37 ° C y 5% de _CO2 y realizar un cambio de los medios de comunicación diaria con los medios de IPSC fresco. Las colonias aparecerán en los días 14-21 después de la transducción.
   5. centrifuge la placa recién recubierta que contiene las células en suspensión en 1.150 xg y 35 ° C durante 10 min.
   6. Después de la centrifugación, se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO ₂ O / N.
   7. Al día siguiente, eliminar el sobrenadante y reemplazarlo con medios frescos IPSC.
      NOTA: El procedimiento mencionado en el paso 2.3 se puede repetir 2-3 veces con las células en suspensión. Si se repetirán los pasos, recoger las células en el sobrenadante y repetir el paso 2.3.
   8. Mantener las células unidas con cambios de medio día hasta que se alcanza el 80% de confluencia.

3. Mantenimiento de la célula reprogramadas

1. mantenimiento preventivo después del cultivo en placa de 24 pocillos
   1. 7-10 días después de la transducción, una vez que las células son confluentes, preparar una, antena vitronectina-revestido 60-mm. Diluir la solución de vitronectina en PBS para una concentración / ml 5 mg final. Añadir 1 ml de vitronectina al plato y se incuba que a TA durante al menos 1 hr.
   2. lava ellas células con PBS y se añade 1 ml de PBS / EDTA 1 mM para separar las células.
   3. Incuban a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 2 min.
   4. Recoger las células y centrifugar ellos en 250 xg y TA durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 3 ml de medio de IPSC frescas.
   5. Placa de todas las células se volvieron a suspender en el plato recién recubierto 60-mm.
   6. Añadir RHO mM inhibidor de quinasa 10 a las células y mantenerlas a 37 ° C en 5% de CO ₂ hasta que las células son 80% de confluencia.
2. Dividir para el aspecto de colonias (Subclonación Preparación)
   1. Preparar una, antena vitronectina recubierto de 100-mm, tal como se describe en el paso 3.1.2.
   2. Se lavan las células con PBS y añadir 1 ml de EDTA PBS / 1 mM para separar las células.
   3. Incuban a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 2 min.
   4. Recoger las células y centrifugar ellos en 250 xg y TA durante 2 min.
   5. Contar las células utilizando un hemocitómetro y preparar 1 x 10 ⁴ células por placa.
   6. Centrifugar las células a 250 g y la temperatura ambiente durante 2 min.
   7. Resuspender 1 x 10 ⁴ células en 6 ml de medio de IPSC, la placa de ellas en el revestido placa de 100 mm, y añaden RHO mM inhibidor de quinasa 10 a los medios de comunicación.
   8. Se incuban las células a 37 ° C en 5% de _CO2 durante una semana hasta que aparezcan grandes colonias.
      NOTA: Mantener y ampliar las colonias para la subclonación. Subclonación generalmente se realiza en menos de 5 pasajes.
3. Colonia recogiendo el uso de IPSC colonia solución de desprendimiento
   1. Una semana antes de la recolección de la colonia, las semillas de 1 x 10 ⁴ células en un plato de vitronectina recubiertos de 100 mm, como se menciona en el paso 3.2.7.
   2. Preparar una, antena vitronectina recubiertas de 60 mm mediante la adición de 2 ml de solución de vitronectina e incubando a temperatura ambiente durante al menos 1 hr.
   3. Al observar a través del microscopio (40X o 100X), marcar colonias con límites claros utilizando un rotulador. Eliminar la solución de vitronectina de la nueva placa hecha en el paso 3.3.2 y añadir 6 mlIPSC de los medios de comunicación complementado con 10 mM RHO quinasa.
   4. Retire el medio de cultivo de las células y lavarlos con 3 ml de PBS.
   5. Añadir 1 ml de solución de desprendimiento IPSC colonia y se incuba durante 30 s a temperatura ambiente.
   6. Retirar la solución de la placa e incubar que a TA durante 30 sec adicional.
   7. Con una pipeta P200, dibujar 200 l de los medios de comunicación de la placa y separar las colonias dirigidas por pipeteo. La transferencia de las colonias dispersas a la nueva placa de 100 mm.
   8. Incubar y mantener las células a 37 ° C en 5% de CO _2.
      NOTA: Después de obtener una colonia pura de IPSC, las células se mantuvieron hasta que alcanzaron el paso 10. La caracterización se realiza después de al menos 10 pasajes. Diluciones de anticuerpos y la información de cebadores se muestran en las Tablas 1 y 2.

Resultados

Este protocolo presenta un método simple para reprogramar PBMCs aisladas de la sangre. Utilizando la combinación de las planchas de serie y centrifugación, iPSCs se generaron con éxito. Con este método, iPSCs podrían ser generados con una pequeña cantidad de células de sangre entera sin aislar o expansión de un tipo celular específico. Hemos generado con éxito células iPS a partir de sólo 1x10 ⁴ células en una placa de cultivo de células pequeñas.

Discusión

Dado que las células madre embrionarias (CME) mostraron varias deficiencias, se requiere la necesidad de una herramienta alternativa. Por lo tanto, el desarrollo de las células madre pluripotentes inducidas (iPS) por Yamanaka fue objeto de la atención internacional. Ha sido casi una década desde Yamanaka descubrió que la pluripotencia se puede inducir mediante la adición de sólo cuatro genes en células somáticas adultas. Desde iPSCs son "inducidos" a partir de células somáticas maduras, pueden evadi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 ml Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer