Sendai Virüs ve santrifüj kullanılarak Kan Hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücre Üretimi

Özet

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Özet

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) son gelişme olgun somatik hücreler farklılaşmamış bir, pluripotent duruma geri kanıtladı. İlk deneyler, genellikle deri fibroblast ile yapıldı vb keratinositler, idrar hücreler, fibroblastlar, Şimdi, yeniden programlama çeşitli yetişkin somatik hücre tipleri ile yapılır. Ancak, bu hastaların fibroblastlar elde etmek için invazif cerrahi prosedür gerekli. Bu nedenle, kan ve idrar hücreleri gibi süspansiyon hücreleri, çünkü birincil hücreler elde rahatlık yeniden programlama için ideal olarak kabul edildi. Burada, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için iPSC üretilmesi için etkili bir yöntem sunulmaktadır. Yeni, matris kaplı plaka kullanılarak santrifüj seri olarak transduced PBMC'ler kaplama olarak, bu protokol kolayca iPSC koloniler sağlayabilir. Bu yöntem aynı zamanda göbek kordonu kan tek-çekirdekli hücreleri (CBMCs) için de geçerlidir. Bu çalışma, basit ve etkili bir Prot sunarPBMC'ler ve CBMCs yeniden programlanmasını ocol.

Giriş

Kök hücreleri, son birkaç on yıl ¹ Klinik terapisinde en cazip malzemelerden biri olmuştur. Kök hücrelerin çekici özellikleri Pluripotency ve kendini yenilemek yeteneği vardır. 1981 yılında ilk embriyonik kök hücrelerin (ESCs) fare embriyo ² izole edilmiştir. teknik insan embriyosunun uygulanmıştır Ancak, birkaç etik konuları karşılaştı.

Dr. Yamanaka ve ekibi fare somatik hücrelerden ilk pluripotent hücre reprogrammed zaman 2006 yılında, kök hücre alanı kendi imkanı kazanmış ve faiz ³ canlanan edildi. Birkaç tanımlanmış faktörleri teslim ederek, pluripotent kök hücreler başarıyla yetişkin somatik hücrelerden "uyarılmış" olduğunu ve böylece adlandırılmıştır "(iPSCs) uyarılmış pluripotent kök hücreler." 2007 yılında, bu teknik EKH kesin özelliklere sahip hücreler üreterek, insan hücrelerinde ⁴ uygulanmış fakat etik tartışmaların hiçbiri. Teorik olarak, iPSCs herhangi bir birey veya hastadan elde edilen herhangi bir hücre tipinden oluşturulabilir. Hastaya özel iPSCs hastalık fenotipleri ve her hastanın epigenetik koşullarını taklit edebilirsiniz potansiyel bir araç olarak artıyor. Gen düzenleme veya patojenik durumu tersine çevirmek için başka yöntemler kullanılarak, hastaya özel iPSCs, kişiselleştirilmiş ilaç ⁵ kullanılabilir. Bunlar ⁶ otomatik nakli daha uygun hale verici ile aynı bağışıklık kimliğe sahip çünkü Ayrıca, iPSCs az bağışıklık reddi ile ilişkilidir. Bu nedenle, iPSCs hastalık modelleme, ilaç tarama ve rejeneratif tedaviler en umut verici bir platform haline gelmiştir. Bu faydaları, sürekli geliştirilmekte olan küçük hücre kaynağından zaman az miktarda daha saf ve daha yüksek verim verebilir geliştirilmiş protokoller göz önüne alındığında. Gelecekteki uygulama için en verimli protokol bulma biri önemli unsurlardan primer hücre tipidir. Erken iPSC üretimi proto çoğucols orijinal iPSC hatları deri fibroblastları ⁴ indüklenen beri yapışık hücreler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin izole edilmesi ve hazırlanması, emek yoğun işlemlerdir. Ayrıca, cilt fibroblast izolasyonu daha geniş bir uygulama için büyük bir eksiklik olabilir invaziv cerrahi prosedürleri içermektedir.

Bu nedenle, iPSCs ve daha fazla kullanım için, uygun edinimi ile bir hücre kaynağı gereklidir. Bu oldukça minimal invaziv prosedür ^7-9 ile elde edilir çünkü kan ideal bir hücre kaynağı olarak kabul edilir. Bu çalışmada, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için hiPSCs üreten protokole basit modifikasyon geliştirdi. Bu CD34 + hücreleri gibi belirli bir hücre tipi, zor genişletme işlemi olmadan, tam kan hücreleri veya PBMC'ler seri Yamanaka faktörleri içeren Sendai virüsü ile transdüksiyon sonra santrifüjleme ile matris kaplı plakalar üzerine kaplandı. Bu yöntem için gerekli süre azalırtransduse yüzen hücreleri bağlanma ve kendi eklemek mümkün değildi yeniden programlanan hücrelerin kaybı azalmıştır.

Protokol

Etik Beyanı: Bu çalışma protokolü Kore Katolik Üniversitesi (KC12TISI0861) kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır.

Kandan Monositik Hücreleri 1. İzolasyon

1. monositik hücrelerin izolasyonu (Gün -5)
   1. Bir hücre hazırlama borusu (CPT) ve kan alımı taze kan, en az 10 ml elde etmek.
   2. Yeni 50-ml'lik konik tüpe kan transferi ve 1 steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilmiş: 4 oranında.
      NOT: seyreltme oranının daha yüksek daha yüksek bir saflık için kullanılabilir.
   3. Yeni 50-ml'lik konik tüpe yoğunluk gradyanlı ortam 10 ml ilave edilir ve dikkatli bir şekilde yoğunluk gradyan medyanın üstüne seyreltilmiş kan tabaka. bir santrifüjleme fren oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 750 x g'de santrifüjleyin.
   4. Dikkatle, yeni bir 50 ml konik tüp buffy tabaka transferi tüp PBS 30 ml ekleyin ve hücreleri yıkayın.
   5. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 515 x g'de santrifüjleyin hücreleri.
   6. PBS atın ve kan hücre medya 0.5 ml hücreleri tekrar süspansiyon.
   7. Hücre sayımı ve 24 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu için 1 x 10 ⁶ hücre plaka. Buharlaşmayı önlemek için çevre gözlere PBS ilave edin.
   8. Transdüksiyon önce% 5, 37 ° C'de _CO2 5 gün boyunca hücrelerle stabilize. hücreleri bozmadan gün 3-4 taze kan hücre ortamının bir ek 0.5 ml ilave edilir.

Sendai Virüs tarafından 2. İletimi

1. İletimi (Gün 0)
   1. Toplayın ve 15 ml konik tüp kan hücreleri transferi ve hemasitometre kullanarak onları saymak.
   2. Transdüksiyon başına 3 x 10 ⁵ hücre hazırlanması ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 515 x g'de santrifüj hücreleri.
   3. Emme ile Süpernatantı atın ve kan hücre medya 0.5 ml hücreleri tekrar süspansiyon.
   4. olmayan bir kaplı 24 oyuklu plaka iyi hücreleri aktarın.
   5. buz Sendai virüsü karışımı çözülme ve su eklemekspended hücreleri. imalatçının tavsiyelerine göre hücrelere Sendai virüsü ekleyin.
   6. bir sızdırmaz film ile plaka kapatılır ve 30 ° C'de 30 dakika boyunca 1,150 x g'de da santrifüj.
   7. Santrifüj işleminden sonra,% 5 bir gece boyunca _CO2 (O / N) 37 ° C'de inkübe hücreleri.
2. besleyici matris hücre transferi (Gün 1)
   1. Sonraki gün, kaplama vitronektin ile 24 oyuklu plaka. bir son 5 ng / ml arasında bir konsantrasyonda PBS içinde vitronektin çözeltisi ile seyreltilir. 24-iyi plaka iyi vitronektin 1 ml ilave edilir ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. Kullanmadan önce Kaplama çözeltisini çıkarın. Kaplanmış plakalar, 3 gün boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
   2. iyi kaplanmış hücreleri ve virüs içeren tüm medya aktarın.
   3. Taze kan hücre ortamının bir ek 0.5 ml kalan hücreleri toplamak ve hücre ihtiva eden bir oyuğa ekleyin.
   4. 35 ° C'de 10 dakika boyunca 1,150 x g'de plaka santrifüjleyin.
   5. yüzde sonrarifugation, süpernatant kaldırmak iPSC ortam 1 ml ekleyin ve% 5 _CO2 göre O / N 37 ° C 'de hücreleri korumak.
3. Ikinci hücre transferi (Gün 2)
   1. Kat aşama 2.2.1 tarif edildiği gibi 5 ug / ml, vitronektin ile yeni bir 24-yuvalı plakanın yuvalarına. Her transdüksiyon için plakanın bir kuyu kullanın.
   2. yeni kaplanmış vitronektin plakaya ilk plaka hücre süspansiyonu aktarın.
      Not: gerekli değilse, süspansiyon hücreleri iptal edilebilir. Aşama 2.3 açıklanan prosedüre süspansiyon hücreleri ile 2-3 kez tekrarlanabilir. adımlar tekrarlanır edilecek olursa, hücreler hasat.
   3. Bununla birlikte,% 5 _CO2 göre O / N 37 ° C 'de muhafaza edilmesi için, ilk plaka oyuğuna iPSC ortam 1 ml ekleyin ve inkübe edilir.
   4. 37 ° C'de eklenmiş hücreleri korumak ve% 5 _CO2 ve taze iPSC ortamı ile günlük ortam değişikliği yapılması. Koloniler transdüksiyon sonra günlerde 14-21 görünecektir.
   5. Centrifuge 1,150 x g'de 10 dakika süre ile 35 ° C 'de süspansiyon hücreleri ihtiva eden yeni kaplanmış plaka.
   6. Santrifüj işleminden sonra, _CO2 O / N,% 5, 37 ° C'de inkübe hücreleri.
   7. Ertesi gün, süpernatant kaldırmak ve taze iPSC ortam ile değiştirin.
      Not: Aşama 2.3 açıklanan prosedüre süspansiyon hücreleri ile 2-3 kez tekrarlanabilir. adımlar tekrarlanır olacaksa, süpernatant hücrelerin hasat ve adım 2.3 tekrarlayın.
   8. % 80 kaynaşma elde edilene kadar her gün ortam değişiklikleri ile bağlı hücreleri korumak.

3. yeniden programlandı hücre bakım

1. 24-plaka kültürden sonra erken bakım
   1. Hücreler birleştiklerinde kez 7-10 gün transdüksiyon sonra, bir vitronektin kaplamalı, 60 mm yemek hazırlamak. bir son 5 ng / ml arasında bir konsantrasyonda PBS içinde vitronektin çözeltisi ile seyreltilir. çanak vitronektin 1 ml ilave edilir ve en az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
   2. yıkaPBS ile hücre ve hücreleri ayırmak için PBS / 1 mM EDTA 1 ml.
   3. 2 dakika için _CO2, 37 ° C'de inkübe ve% 5.
   4. hücreler hasat ve 2 dakika boyunca 250 x g'de ve oda sıcaklığında santrifüj. Süpernatantı ve taze iPSC medya 3 ml hücreleri tekrar süspansiyon.
   5. yeni kaplanmış 60 mm çanak üzerine tüm yeniden süspanse hücreleri Plate.
   6. Hücreler% 80 birleşmeye kadar% 5 _CO2 içinde 37 ° C sıcaklıkta tekrar hücrelere 10 mM RHO kinaz inhibitörü ekleyin ve korur.
2. koloni görünümü Split (Altklonlaması Hazırlık)
   1. Aşama 3.1.2 de tarif edildiği gibi, bir vitronektin kaplı, 100 mm tabak için hazırlayın.
   2. Hücrelerin PBS ile yıkayın ve hücreleri ayırmak için PBS / 1 mM EDTA 1 ml.
   3. 2 dakika için _CO2, 37 ° C'de inkübe ve% 5.
   4. hücreler hasat ve 2 dakika boyunca 250 x g'de ve oda sıcaklığında santrifüj.
   5. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve çanak başına 1 x 10 ⁴ hücre hazırlamak.
   6. 250 xg'de hücreleri Santrifüj ve RT 2 dakika süreyle.
   7. IPSC medya 6 ml, yeniden süspanse 1 x 10 ⁴ hücre kaplamalı 100 mm çanak üzerine onları plaka ve medyaya 10 mM RHO kinaz inhibitörü ekleyin.
   8. Büyük koloniler görünene kadar hafta% 5 37 ° C'de _CO2 hücreleri inkübe edin.
      NOT: Bakım ve alt klonlama için koloniler genişletin. Alt-klonlama genellikle 5 pasajlar altında yapılır.
3. Koloni çözümü ayrılmakta iPSC koloni kullanarak toplama
   1. Koloni toplama, tohum aşamasında 3.2.7 de belirtildiği gibi bir vitronektin kaplı, 100 mm çanak 1 x 10 ⁴ hücre, bir hafta önce.
   2. Vitronektin 2 ml solüsyon eklenmesi ve en az 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek bir vitronektin kaplanmış 60 mm çanak hazırlayın.
   3. Bir mikroskop (40X veya 100X büyütme) aracılığıyla gözlemleyerek, bir işaretleyici kalem kullanarak kesin sınırlarla koloniler işaretleyin. Adım 3.3.2 yapılan yeni plakadan vitronektin çözüm çıkarın ve 6 ml ekleyinIPSC ortam, 10 mM RHO kinaz ile takviye edilmiştir.
   4. hücrelerin kültür ortamı çıkarın ve PBS 3 ml ile yıkayın.
   5. iPSC koloni ayırma çözeltisi 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 s için inkübe.
   6. plakadan çözüm kaldırmak ve ilave bir 30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe.
   7. P200 pipet kullanarak, plakadan medya 200 ul çizin ve pipetle hedef koloniler ayırmak. Yeni 100 mm çanak dağınık koloniler aktarın.
   8. Inkübe ve% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de hücreleri _korumak.
      NOT: onlar 10. Karakterizasyonu en az 10 pasajlar sonra yapıldığını geçit ulaşıncaya kadar saf iPSC koloni elde ettikten sonra, hücreler muhafaza edilmiştir. Antikor seyreltikleri, ve primer bilgiler Tablo 1 ve 2'de gösterilmektedir.

Sonuçlar

Bu protokol kanından izole PBMC'ler yeniden programlamak için basit bir yöntem sunar. Seri kaplama ve santrifüj kombinasyonu kullanılarak, iPSCs başarıyla üretildi. Bu yöntemle, iPSCs izole edilmesi ya da belirli bir hücre tipi genişletmeden tam kan hücrelerinin küçük bir miktar ile oluşturulabilir. Başarıyla küçük hücre kültürü plakasının sadece 1x10 ⁴ hücrelerinden iPSCs oluşturulur.

Tartışmalar

Embriyonik kök hücreler (ESCs) birçok takım eksiklikler göstermiştir için, alternatif bir araca gerek gerekmiştir. Bu nedenle, Yamanaka tarafından uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin gelişimi (iPSCs) uluslararası mercek altına geldi. Yamanaka Pluripotency yetişkin somatik hücre içine sadece dört gen ekleyerek uyarılan edilebileceğini keşfetti beri neredeyse on yıl olmuştur. iPSCs olgun somatik hücrelerden "uyarılmış" olduklarından, bir zamanlar EKH ilgili endişe olmuştu etik...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer