센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

요약

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

초록

인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)의 최근의 발전은 성숙한 체세포는 미분화, 만능 상태로 돌아갈 수 있음을 증명했다. 초기 실험은 일반적으로 피부 섬유 아세포로 행해졌 등 각질 세포, 소변 세포, 섬유 아세포, : 지금, 프로그래밍 다양한 성인 체세포의 종류 이루어집니다. 그러나 이는 환자의 섬유 아세포를 수득 침습 수술이 필요했다. 따라서, 혈액 및 소변 세포와 같은 세포 현탁액이 때문에 일차 세포를 얻는 편리함 프로그래밍 이상적으로 간주 하였다. 여기서, 우리는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 IPSC 생성하는 효율적인 프로토콜을보고한다. 새로운 매트릭스 도장 판하여 원심 직렬로 형질 도입 된 PBMC를 도금함으로써,이 프로토콜은 쉽게 IPSC 콜로니를 제공 할 수있다. 이 방법은 또한 제대혈 단핵구 (CBMCs)에 적용 가능하다. 본 연구는 간단하고 효율적인 PROT를 제시PBMC를하고 CBMCs의 재 프로그래밍에 대한 ocol.

서문

줄기 세포는 최근 몇 년간 ^한 임상 치료에서 가장 매력적인 물질 중 하나이었다. 줄기 세포의 분화능 매력적인 특성과 자기 갱신 할 수있는 기능이다. 1981 년, 제 배아 줄기 세포 (는 ESC)는 마우스 배아 ^(2)로부터 분리 하였다. 이 기술은 인간 배아에 적용된 때, 그것은 여러 윤리적 문제에 직면했다.

박사 야마나카와 그의 팀이 마우스 체세포에서 첫 번째 만능 세포를 재 프로그램 할 때 2006 년, 줄기 세포 분야는 가능성을 회복하고 관심은 ³ 재연했다. 여러 정의 요소를 제공함으로써, 다 능성 줄기 세포가 성공적으로 성숙한 체세포에서 "유도"이었고, 따라서 지명되었다 "(iPSCs)를 유도 만능 줄기 세포." 2007 년,이 기술은는 ESC의 정확한 특성을 가진 세포를 산출, 인간 세포 ^4에 적용되었지만 윤리적 논쟁 없음. 이론적으로 유도 만능 줄기CS는 개인 또는 환자로부터 얻은 세포 유형에서 생성 될 수있다. 환자 별 iPSCs는 질병 표현형 및 각 개별 환자의 후생 유전 학적 조건을 시뮬레이션 할 수있는 잠재적 인 도구로 상승하고있다. 유전자 편집 또는 병원성 상태를 반전 할 수있는 다른 방법을 사용하여 환자 별 iPSCs 또한 개인화 된 약 ^5에서 사용될 수있다. 그들은 ⁶ 자동 이식을 더욱 가능하게, 도너와 같은 면역 ID를 가지고 있기 때문에 또한 iPSCs 덜 면역 거부 반응과 연관된다. 따라서, iPSCs 질병 모델링, 약물 검사, 및 재생 치료에서 가장 유망한 플랫폼이되었다. 이러한 혜택, 지속적으로 개발 중에있는 작은 셀 소스에서 시간의 최소 금액에서 순수하고 높은 수율을 줄 수있는 개선 된 프로토콜을 감안할 때. 미래의 애플리케이션에 가장 효율적인 프로토콜을 찾는 하나의 중요한 고려 사항은 일차 전지 유형이다. 초기 IPSC 생성 프로토 대부분의COLS은 원래 IPSC 라인은 피부 섬유 아세포 ^(4)로부터 유도 된 이후 부착 세포에 최적화되어 있습니다. 그러나, 이들 세포의 분리 및 제조는 노동 집약적이다. 또한, 피부 섬유 아세포의 분리는 광범위한 응용 프로그램의 주요 단점이 될 수 침습 수술 절차가 포함되어 있습니다.

따라서, iPSCs의 추가 사용, 편리한 수집과 셀 소스가 필요합니다. 그것은 오히려 최소 침습 절차 ^7-9 통해 획득하기 때문에 혈액 이상적인 셀 소스로서 간주된다. 본 연구는 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에서 hiPSCs 발생 프로토콜에 대한 간단한 수정을 개발 하였다. 예컨대 CD34 + 세포와 같은 특정 세포 유형의 어려운 팽창 과정없이 전혈 세포 또는 PBMC를 직렬 야마나카 인자 함유 센다이 바이러스 형질 도입 한 후 원심 분리하여 매트릭스 - 코팅 된 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. 이 방법은 요구되는 시간을 단축형질 도입 부유 세포의 부착과 자신에 부착 할 수 없었다 재 프로그래밍 셀의 손실을 감소시켰다.

프로토콜

윤리 진술 : 본 연구 프로토콜 가톨릭 대학교 (KC12TISI0861)의 기관 검토위원회에 의해 승인되었다.

혈액에서 단핵구 세포의 분리 (1)

1. 단핵구 세포의 분리 (일 -5)
   1. 셀 준비 튜브 (CPT)에서 혈액 추첨에서 신선한 혈액의 10 ml의를 얻습니다.
   2. 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 혈액을 전송하고 하나의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 희석 : 4 비율.
      주 : 희석 높은 비율은 더 높은 순도를 위해 사용될 수있다.
   3. 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 밀도 구배 배지 10 ㎖를 첨가하고 신중 밀도 구배 매체 위에 희석 혈액 층을 포함한다. 원심 브레이크없이, 실온 (RT)에서 30 분 동안 750 × g으로 원심 분리기.
   4. 조심스럽게 새로운 50ml의 원뿔형 튜브에 버피 층 전송 튜브를 PBS 30 mL를 넣고 세포를 세척 하였다.
   5. RT에서 5 분 동안 515 XG에 세포를 원심 분리기.
   6. PBS를 폐기하고 혈액 세포 배지 0.5 ml의 세포를 재현 탁.
   7. 세포를 카운트하고, 24 웰 플레이트의 웰 당 1 × 10 ⁶ 세포를 접시. 증발을 방지하기 위해 주변의 우물에 PBS를 추가합니다.
   8. 전달 전에 5 %에서 37 ° C에서 CO _{2 5} 일 동안 세포를 안정화. 세포를 방해하지 않고 일 3-4에 신선한 혈액 세포 미디어의 추가 0.5 ML을 추가합니다.

센다이 바이러스 2. 형질

1. 전달 (0 일)
   1. 모아서 15 ml의 원추형 튜브에 혈액 세포를 전송하여 혈구를 사용하여 계산.
   2. 전달 당 3 × 10 ⁵ 세포를 준비하고 실온에서 5 분 동안 515 XG에서 세포를 원심 분리기.
   3. 흡인함으로써 상층 액을 제거하고 혈액 세포 배지 0.5 ml의 세포를 재현 탁.
   4. 비 코팅 24- 웰 플레이트의 웰에 세포를 옮긴다.
   5. 얼음 센다이 바이러스 액을 해동하고, SU에 추가spended 세포. 제조업체의 권장 사항에 따라 세포에 센다이 바이러스를 추가합니다.
   6. 밀봉 막 접시를 밀봉하고 30 ℃에서 30 분 동안 1150 × g으로 원심 분리하여 그것을.
   7. 원심 분리 후, 5 % CO ₂ 밤새 (O / N)으로 37 ℃에서 세포를 배양한다.
2. 공급 매트릭스 셀 전송 (1 일)
   1. 다음 날, 코트 비트로 넥틴과 24 웰 플레이트. 최종 5 μg의 / ㎖ 농도에 대한 PBS의 비트로 넥틴 솔루션을 희석. 24- 웰 플레이트의 웰에 비트로 넥틴 1 ㎖를 첨가하고, 적어도 1 시간 동안 RT에서이를 부화. 사용 전에, 코팅 용액을 제거한다. 코팅 된 플레이트 3 일 동안 실온에서 저장 될 수있다.
   2. 잘 코팅에 세포와 바이러스를 포함하는 모든 미디어를 전송합니다.
   3. 신선한 혈액 세포 미디어의 추가 0.5 ㎖의 나머지 세포를 수집하고 세포를 함유 웰에 추가한다.
   4. 35 ° C에서 10 분 동안 1,150 XG에서 접시를 원심 분리기.
   5. 센트 후rifugation, 상층 액을 제거 IPSC 미디어 1 ㎖를 추가하고, 5 % CO ₂ O / N 37 ° C에서 세포를 유지한다.
3. 제 2 셀 트랜스퍼 (주 2)
   1. 코팅 단계 2.2.1에 기술 된 바와 같이 5 μg의 / ㎖ 비트로 넥틴과 새로운 24- 웰 플레이트의 웰. 각 형질에 대한 플레이트 잘 하나를 사용합니다.
   2. 새롭게 코팅 된 비트로 넥틴 플레이트에 상기 제 1 플레이트로부터 세포 현탁액을 전송.
      주의 : 필요하지 않으면, 현탁 세포는 폐기 될 수있다. 단계 2.3에서 설명한 절차는 현탁 세포를 2-3 회 반복 할 수있다. 단계가 반복 될 경우, 세포를 수확.
   3. 한편, 5 % CO ₂ O / N에서 37 ℃를 유지 관리를 위해, 제 1 플레이트의 웰에 IPSC 배지 1 mL를 넣어 배양한다.
   4. 37 ° C에 부착 된 세포를 유지하고 5 % CO _2와 신선한 IPSC 미디어와 함께 매일 미디어 변경을 수행합니다. 식민지는 전달 후 일에 14-21 나타납니다.
   5. CentrifugE 1150 XG 10 분간 35 ℃에서 현탁 세포를 포함하는 새로 도장 판.
   6. 원심 분리 후, CO ₂ O / N이 5 %에서 37 ℃에서 세포를 배양한다.
   7. 다음날, 상층 액을 제거하고 신선한 IPSC의 용지로 교체합니다.
      주의 : 단계 2.3에서 설명한 절차는 현탁 세포를 2-3 회 반복 할 수있다. 단계가 반복 될 경우, 상층 액에 세포를 수확 단계 2.3를 반복합니다.
   8. 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 매일 미디어 변화에 부착 된 세포를 유지한다.

3. 재 프로그래밍 셀 유지 보수

1. 24 웰 플레이트 배양 후 조기 유지 보수
   1. 세포가 합류 일단 7-10일 전달 후하는 비트로 넥틴 코팅, 60-mm 요리를 준비합니다. 최종 5 μg의 / ㎖ 농도에 대한 PBS에서 비트로 넥틴 솔루션을 희석. 접시에 비트로 넥틴의 1 ML을 추가하고 적어도 1 시간 동안 실온에서 그것을 품어.
   2. 씻어PBS로 세포와 세포를 분리 PBS / 1 mM의 EDTA 1 ㎖를 추가합니다.
   3. 2 분 동안 CO _2, 37 ℃에서 인큐베이션을 5 %.
   4. 세포를 수확하고 2 분 동안 250 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 신선한 IPSC 미디어의 3 ml의 세포를 재현 탁.
   5. 새로 코팅 된 60 mm 접시에 모든 재현 탁 세포를 플레이트.
   6. 세포가 80 % 컨 플루 언트 될 때까지 5 % CO _2에서 37 ° C에서 그들 세포에 10 mM의 Rho 키나아제 억제제를 추가하고 유지한다.
2. 식민지 모양에 대한 분할 (서브 클로닝 준비)
   1. 단계 3.1.2에 설명 된대로 비트로 넥틴 코팅, 100-mm 요리를 준비합니다.
   2. PBS로 세포를 세척하고 세포를 분리 PBS / 1 mM의 EDTA 1 ㎖를 추가합니다.
   3. 2 분 동안 CO _2, 37 ℃에서 인큐베이션을 5 %.
   4. 세포를 수확하고 2 분 동안 250 XG와 RT에서 그들을 원심 분리기.
   5. 혈구를 사용하여 세포를 세어 접시 당 1 × ¹⁰⁴ 세포를 준비합니다.
   6. 250 XG에서 세포를 원심 분리기 및 RT 2 분.
   7. IPSC 배지 6 ㎖, 재현 탁에 1 × ¹⁰⁴ 세포가 도포 100 mm 접시에 입혀, 미디어에 10mM의 Rho 키나아제 억제제를 추가한다.
   8. 큰 식민지가 나타날 때까지 일주일 동안 5 %에서 37 ° C에서 CO ₂ 세포를 품어.
      참고 : 유지 및 서브 클로닝을 위해 식민지를 확장합니다. 서브 클로닝은 일반적으로 5 구절 아래에 이루어집니다.
3. 식민지 용액을 분리 IPSC 식민지를 사용하여 따기
   1. 식민지 따기, 씨앗 단계 3.2.7에서 언급 한 바와 같이 비트로 넥틴 코팅, 100 mm 접시에 1 × ¹⁰⁴ 세포, 전에 일주일.
   2. 비트로 넥틴 용액 2 ㎖를 추가하고 적어도 1 시간 동안 실온에서 배양하여 비트로 넥틴 코팅, 60-mm 요리를 준비합니다.
   3. 현미경 (40X 또는 100X 배율)을 통해 관찰함으로써, 마커 펜을 사용하여 명확한 경계와 식민지를 표시합니다. 단계 3.3.2에서 만든 새로운 판에서 비트로 넥틴 솔루션을 제거하고 6 ml에 추가IPSC의 매체는 10 mM의 Rho 키나아제 보충.
   4. 세포에서 배양 배지를 제거하고 PBS 3 ㎖로 씻는다.
   5. IPSC 식민지 분리 액 1ml를 추가하고 RT에서 30 초 동안 그들을 품어.
   6. 플레이트에서 솔루션을 제거하고 추가로 30 초 동안 RT에서 그것을 품어.
   7. P200 피펫을 사용하여 판에서 미디어 200 μl를 그리는 피펫 팅하여 대상 식민지를 분리합니다. 새로운 100 mm 접시에 흩어져있는 식민지를 전송합니다.
   8. 부화 및 5 % CO _2에서 37 ℃에서 세포를 _{유지한다.}
      참고 : 그들이 10 특성이 적어도 10 구절 이후에 이루어졌다 통로에 도착할 때까지 순수한 IPSC 식민지를 획득 한 후, 세포를 유지 하였다. 항체 희석 및 프라이머 정보는 표 1 및 표 2에 나타낸다.

결과

이 프로토콜은 혈액에서 분리 된 PBMC를 재 프로그램 할 수있는 간단한 방법을 제시한다. 직렬 원심 도금의 조합을 사용 iPSCs 성공적으로 생성되었다. 이 방법은 iPSCs 단리 또는 특정 세포 유형을 확장하지 않고 전체 혈액 세포의 적은 양으로 생성 될 수있다. 우리는 성공적으로 작은 세포 배양 접시 만 1 × ¹⁰⁴ 세포에서 iPSCs를 생성합니다.

토론

배아 줄기 세포 (는 ESC)는 여러 단점을 보였다 때문에, 다른 도구의 필요성이 요구되었다. 따라서 야마나카에 의해 유도 된 다 능성 줄기 세포의 발달 (iPSCs)은 국제 주목 받게되었다. 야마나카는 만능 성인이 체세포에 네 개의 유전자를 추가로 유도 될 수 있다는 것을 발견한지 거의 10이었다. iPSCs 성숙한 체세포에서 "유도"된다 때문에, 한번는 ESC 관련된 문제이었던 윤리적 문제를 회피 할 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer