Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

Zusammenfassung

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Zusammenfassung

Die jüngste Entwicklung der menschlichen induzierten erwies sich pluripotente Stammzellen (hiPSCs), dass reife somatische Zellen zu einem undifferenzierten, pluripotenten Zustand zurückkehren kann. Nun Umprogrammierung ist mit verschiedenen Arten von adulten somatischen Zellen durchgeführt: Keratinozyten, Urin - Zellen, Fibroblasten usw. Frühe Experimente wurden in der Regel mit dermalen Fibroblasten durchgeführt. Jedoch benötigt dies eine invasive chirurgische Verfahren Fibroblasten von Patienten zu erhalten. Daher Suspensionszellen, wie Blut und Urin-Zellen wurden für eine Neuprogrammierung ideal angesehen wegen der Bequemlichkeit die primären Zellen zu erhalten. Hier berichten wir ein effizientes Protokoll zur iPSC Erzeugung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Durch Plattieren der transduzierten PBMCs seriell zu einer neuen, matrix-beschichtete Platte unter Verwendung von Zentrifugation kann dieses Protokoll leicht iPSC Kolonien bereitzustellen. Dieses Verfahren ist auch anwendbar auf Nabelschnurblut mononukleäre Zellen (CBMC). Diese Studie stellt eine einfache und effiziente ProtOcol für die Reprogrammierung von PBMCs und CBMC.

Einleitung

Stammzellen haben in den letzten Jahrzehnten ^ein in der klinischen Therapie einer der attraktivsten Materialien gewesen. Die attraktiven Eigenschaften von Stammzellen sind pluripotent und die Fähigkeit zur Selbsterneuerung. 1981 wurden die ersten embryonalen Stammzellen ( ES- Zellen) von der Maus - Embryo isoliert ^2. Wenn jedoch die Technik, um menschliche Embryonen angewendet wurde, stand es mehreren ethische Fragen.

Im Jahr 2006, als Dr. Yamanaka und sein Team die erste pluripotenten Zelle aus der Maus somatischen Zellen umprogrammiert, wieder die Stammzellfeld seine Möglichkeit und Interesse wurde ³ neu entfacht. Durch die Bereitstellung von mehreren definierten Faktoren waren pluripotente Stammzellen erfolgreich "induziert" aus adulten somatischen Zellen und wurden so genannt "induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen)." Im Jahr 2007 wurde diese Technik auf menschliche Zellen angewendet ⁴ - Zellen mit den genauen Eigenschaften der WSR aber keiner der ethischen Diskussion ergibt. Theoretisch iPSCs kann aus jedem Individuum oder Patienten erhalten von jedem Zelltyp erzeugt werden. Patientenspezifische iPSCs als potentielles Werkzeug steigen, dass die Krankheit Phänotypen und epigenetische Bedingungen jedes einzelnen Patienten zu simulieren. Mit Gen - Bearbeitung oder andere Methoden , die können umkehren können die pathogenen Zustand, patientenspezifischen iPS auch ⁵ in der personalisierten Medizin verwendet werden. Außerdem sind iPSCs weniger mit Immunabstoßung verbunden , weil sie dieselbe Immunidentität als Donor haben, so dass die automatische Transplantation führbarer ^6. Deshalb haben iPSCs die vielversprechendste Plattform in Krankheit Modellierung, Wirkstoff-Screening werden und regenerative Therapien. In Anbetracht dieser Vorteile, verbesserte Protokolle, die reinere und höhere Erträge in der geringsten Menge an Zeit, von der kleinsten Zellquelle geben kann ständig in der Entwicklung. Ein wichtiger Aspekt der effizientesten Protokoll für die künftige Anwendung finden, ist die primäre Zelltyp. Die meisten der frühen iPSC Generation protocols für anhaftenden Zellen optimiert , da die ursprünglichen iPSC Linien von Fibroblasten der Haut ⁴ induziert wurden. Jedoch sind die Isolierung und Herstellung dieser Zellen arbeitsintensiv. Auch schließt die Isolierung von Haut-Fibroblasten-invasive chirurgische Verfahren, die ein großes Manko für eine breitere Anwendung werden kann.

Daher wird für die weitere Verwendung von iPS-Zellen wird eine Zellquelle mit bequemen Erwerb erforderlich. Blut wird als ideale Zellquelle angesehen , da es durch eine eher minimal - invasive Verfahren ^7-9 erhalten wird. In dieser Studie haben wir eine einfache Modifikation des Protokolls hiPSCs aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu erzeugen. Ohne die schwierige Expansionsprozesses eines bestimmten Zelltyp, wie beispielsweise CD34 + Zellen wurden Vollblutzellen oder PBMCs seriell überzogen auf einer Matrix beschichteten Platten durch Zentrifugation nach der Transduktion mit Sendai-Virus enthält, Yamanaka Faktoren. Dieses Verfahren reduziert die Zeit für die erforderlicheBefestigung von transduzierten schwebenden Zellen und verringert den Verlust von umprogrammiert Zellen, die auf ihren eigenen nicht in der Lage zu befestigen waren.

Protokoll

Ethik-Erklärung: Diese Studienprotokoll vom Institutional Review Board der Katholischen Universität von Korea (KC12TISI0861) genehmigt wurde.

1. Isolierung von monozytären Zellen aus Blut

1. Isolierung von Monozyten (Tag -5)
   1. Erhalten Sie mindestens 10 ml frisches Blut aus einer Blutabnahme in einer Zellpräparation Röhre (CPT).
   2. Übertragen, um das Blut zu einem neuen 50-ml konischen Röhrchen und verdünnte es mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei einem 1: 4-Verhältnis.
      HINWEIS: Ein höheres Verhältnis von Verdünnungs für höhere Reinheit verwendet werden.
   3. 10 ml Dichtegradientenmedien auf eine neue 50-ml konischen Röhrchen und sorgfältig das verdünnte Blut auf der Oberseite der Dichtegradient Medienschicht. Zentrifuge bei 750 × g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Zentrifugieren Bremse.
   4. übertragen Sie vorsichtig die buffy Schicht auf ein neues 50-ml konischen Röhrchen, 30 ml PBS in das Röhrchen, und die Zellen zu waschen.
   5. Zentrifugieren der Zellen bei 515 xg für 5 min bei RT.
   6. Entsorgen Sie die PBS und Resuspendieren der Zellen in 0,5 ml Blut Zellmedien.
   7. Zählen Sie die Zellen und die Platte 1 x 10 ⁶ Zellen pro Vertiefung einer 24-Well - Platte. Hinzufügen PBS zu den umgebenden Vertiefungen Verdampfung zu verhindern.
   8. Stabilisierung der Zellen für 5 Tage bei 37 ° C in 5% CO ₂ vor der Transduktion. Fügen Sie weitere 0,5 ml frisches Blut Zellmedien an den Tagen 3-4, ohne die Zellen zu stören.

2. Transduction von Sendai-Virus

1. Transduction (Tag 0)
   1. Sammeln Sie und übertragen Sie die Blutzellen zu einer 15-ml konischen Röhrchen und zähle sie eine Zählkammer.
   2. Bereiten Sie 3 x 10 ⁵ Zellen pro Übertragung und Zentrifugieren der Zellen bei 515 g für 5 min bei RT.
   3. Entsorgen Sie den Überstand durch Absaugen und Resuspendieren der Zellen in 0,5 ml Blut Zellmedien.
   4. Übertragen, um die Zellen in eine Vertiefung einer nicht-beschichteten 24-Well-Platte.
   5. Auftauen Mischung Sendai-Virus in Eis und fügen Sie es dem suspended Zellen. In Sendai-Virus in den Zellen basiert auf den Empfehlungen des Herstellers.
   6. Verschließen Sie die Platte mit einer Siegelfolie und Zentrifuge bei 1150 × g für 30 min bei 30 ° C.
   7. Nach der Zentrifugation inkubiert , die Zellen bei 37 ° C ₂ über Nacht in 5% CO (O / N).
2. Zellübertragung auf Feeder-Matrix (Tag 1)
   1. Am nächsten Tag Mantel eine 24-Well-Platte mit Vitronectin. Verdünne die Vitronectin-Lösung in PBS für eine abschließende 5 ug / ml-Konzentration. 1 ml Vitronectin an eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und Inkubation es bei RT für mindestens 1 Stunde. Entfernen Sie die Beschichtungslösung vor dem Gebrauch. Beschichteten Platten können für 3 Tage RT gelagert werden.
   2. Übertragen alle Medien die Zellen und das Virus in die gut beschichtet enthält.
   3. Sammeln Sie die restlichen Zellen mit zusätzlichen 0,5 ml frisches Blut Zellmedien und fügen Sie ihn in die Zellen enthaltende gut.
   4. Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.150 × g für 10 min bei 35 ° C.
   5. Nach Centrifugation, entfernen Sie den Überstand, 1 ml iPSC Medien und erhalten die Zellen bei 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.
3. Zweite Zelltransfer (Tag 2)
   1. Bestreichen Sie die Vertiefungen einer neuen 24-Well-Platte mit 5 ug / ml Vitronectin, wie in Schritt 2.2.1 beschrieben. Verwenden Sie eine Vertiefung der Platte für jede Übertragung.
   2. Übertragen Sie die Zellsuspension aus der ersten Platte in die neu beschichteten Vitronectin Platte.
      HINWEIS: Wenn nicht benötigt, Suspensionszellen verworfen werden können. Das Verfahren in Schritt 2.3 erwähnt kann 2-3 mal mit den Suspensionszellen wiederholt werden. Wenn die Schritte wiederholt werden, ernten die Zellen.
   3. Inzwischen 1 ml iPSC Medien zum Brunnen der ersten Platte, für die Wartung, und Inkubation bei 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.
   4. Pflegen Sie die anhaftenden Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ und führen Sie eine tägliche Medienwechsel mit frischen iPSC Medien. Die Kolonien werden 14-21 nach Transduktion an den Tagen erscheinen.
   5. Centrifuge die neu beschichteten Platte, die Suspensionszellen bei 1.150 xg und 35 ° C für 10 min enthält.
   6. Nach der Zentrifugation inkubiert , die Zellen bei 37 ° C in 5% CO ₂ O / N.
   7. Am nächsten Tag, entfernen Sie den Überstand und ersetzen Sie es mit frischen iPSC Medien.
      HINWEIS: Das Verfahren erwähnt in Schritt 2.3 kann 2-3 mal mit den Suspensionszellen wiederholt werden. Wenn die Schritte wiederholt werden, Ernte der Zellen im Überstand und wiederholen Schritt 2.3.
   8. Pflegen Sie die anhaftenden Zellen mit täglichen Medien Änderungen bis 80% Konfluenz erreicht ist.

3. Reprogrammierte Zelle Wartung

1. Frühe Wartung nach der 24-Well-Platte Kultur
   1. 7-10 Tage nach Transduktion, sobald die Zellen konfluent sind, bereiten Sie einen Vitronectin-beschichtet, 60-mm-Schale. Verdünnte Vitronectin Lösung in PBS für eine abschließende 5 ug / ml-Konzentration. 1 ml Vitronectin an der Schale und inkubieren es bei RT für mindestens 1 Std.
   2. Wasch denZellen mit PBS und 1 ml PBS / 1 mM EDTA hinzu, die Zellen zu lösen.
   3. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 2 min.
   4. Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge sie bei 250 xg und RT für 2 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in 3 ml frischem iPSC Medien.
   5. Platte alle resuspendierten Zellen auf dem neu beschichteten 60-mm-Schale.
   6. Zugabe von 10 mM RHO - Kinase - Inhibitor zu den Zellen und halten sie bei 37 ° C in 5% CO ₂ , bis die Zellen 80% konfluent sind.
2. Split für Kolonie Aussehen (Subklonierung Vorbereitung)
   1. Bereiten Sie eine Vitronectin beschichtet, 100-mm-Schale, wie in Schritt 3.1.2 beschrieben.
   2. Waschen der Zellen mit PBS und 1 ml PBS / 1 mM EDTA die Zellen zu lösen.
   3. Inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 2 min.
   4. Ernten Sie die Zellen und Zentrifuge sie bei 250 xg und RT für 2 min.
   5. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und bereiten 1 x 10 ⁴ Zellen pro Schale.
   6. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 250 xg und RT für 2 min.
   7. Resuspendieren 1 x 10 ⁴ Zellen in 6 ml iPSC Medien, plattieren sie auf die beschichtete 100-mm - Schale, und 10 mM RHO - Kinase in den Medien Inhibitor hinzuzufügen.
   8. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO ₂ für eine Woche bis zu großen Kolonien erscheinen.
      HINWEIS: Pflegen und die Kolonien für die Subklonierung erweitern. Subklonierung wird in der Regel in weniger als 5 Passagen durchgeführt.
3. Colony Kommissionierung iPSC Kolonie unter Verwendung von Löse Lösung
   1. Eine Woche vor Kolonie Kommissionierung, Samen 1 x 10 ⁴ Zellen in einer Vitronectin beschichtet, 100-mm - Schale, wie in Schritt 3.2.7 erwähnt.
   2. Vorbereiten eines Vitronektin beschichtet, 60-mm-Schale in 2 ml von Vitronectin Lösung zugegeben und bei RT Inkubation für mindestens 1 Std.
   3. Durch die Beobachtung durch ein Mikroskop (40-fache oder 100-facher Vergrößerung), markieren Kolonien mit klaren Grenzen einen Markierungsstift. Entfernen Sie die Vitronectin-Lösung aus der neuen Platte gemacht in Schritt 3.3.2 und 6 mlMedien mit 10 mM RHO-Kinase ergänzt von iPS.
   4. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den Zellen und waschen Sie sie mit 3 ml PBS.
   5. 1 ml der iPSC Kolonie Ablösen Lösung und inkubieren für 30 s bei RT.
   6. Entfernen Sie die Lösung von der Platte und Inkubation es bei RT für weitere 30 sec.
   7. Mit Hilfe einer Pipette P200, ziehen 200 ul Medium von der Platte und lösen die gezielte Kolonien durch Pipettieren. Übertragen Sie die verstreuten Kolonien auf den neuen 100-mm-Schale.
   8. Inkubieren und die Zellen bei 37 ° C in 5% CO _{2 erhalten.}
      Hinweis: Nach einem reinen iPSC Kolonie zu erhalten, wurden die Zellen gehalten, bis sie Passage 10. Charakterisierung erreicht wurde nach mindestens 10 Passagen getan. Antikörperverdünnungen und Primer Informationen sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.

Ergebnisse

Dieses Protokoll stellt eine einfache Methode PBMCs aus dem Blut isoliert neu zu programmieren. Mit der Kombination von seriellen Plattierung und Zentrifugation wurden iPSCs erfolgreich generiert. Mit dieser Methode konnte iPSCs mit einer geringen Menge an Vollblutzellen erzeugt werden ohne Isolierung oder einen bestimmten Zelltyp zu erweitern. Wir erzielten erfolgreich iPSCs von nur 1x10 ⁴ Zellen in einer kleinen Zellkulturplatte.

Diskussion

Da embryonale Stammzellen (ES-Zellen) mehrere Mängel zeigte, wurde die Notwendigkeit eines alternativen Werkzeug erforderlich. Daher kam die Entwicklung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von Yamanaka im Rahmen des internationalen Rampenlicht. Es ist schon seit fast einem Jahrzehnt Yamanaka entdeckt, dass Pluripotenz, indem nur vier Gene in adulten somatischen Zellen induziert werden kann. Da iPSCs "induziert" von reifen somatischen Zellen sind, können sie ethische Fragen ausweichen, die ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer