Induzida Geração Stem Cell pluripotentes a partir de células de sangue com o vírus Sendai e centrifugação

Resumo

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Resumo

O recente desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSCs) provou que células somáticas maduras podem voltar a um estado indiferenciado, pluripotentes. Agora, a reprogramação é feito com vários tipos de células somáticas adultas: queratinócitos, células de urina, f ibroblastos, etc. experiências iniciais foram normalmente feito com fibroblastos da derme. No entanto, isto requer um procedimento cirúrgico invasivo para se obter fibroblastos de pacientes. Portanto, as células em suspensão, tais como células de sangue e urina, foram considerados ideais para a reprogramação por causa da conveniência de obtenção de células primárias. Aqui, nós relatamos um protocolo eficiente para a geração de iPSC a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC). Por plaqueamento das PBMC transduzidas em série para um novo, placa utilizando centrifugação revestido de matriz, este protocolo pode facilmente fornecer colónias IPSC. Este método é também aplicável a células mononucleares de sangue do cordão umbilical (CBMCs). Este estudo apresenta um prot simples e eficienteOCOL para a reprogramação de PBMC e CBMCs.

Introdução

As células-tronco têm sido um dos materiais mais atraentes da terapia clínica durante os últimos várias décadas ^1. As propriedades atraentes de células-tronco são pluripotência ea capacidade de auto-renovação. Em 1981, as primeiras células estaminais embrionárias (CES) foram isolados a partir do embrião de rato ^2. No entanto, quando a técnica foi aplicada a embriões humanos, enfrentou vários problemas éticos.

Em 2006, quando o Dr. Yamanaka e sua equipe reprogramou a primeira célula pluripotente a partir de células somáticas de rato, o campo de células-tronco recuperou a sua possibilidade e interesse foi reavivado ^3. Ao entregar vários fatores definidos, as células-tronco pluripotentes foram com sucesso "induzida" a partir de células somáticas adultas, e foram assim chamado "células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)." Em 2007, esta técnica foi aplicada às células humanas ^4, as células com as características exactas do CES rendendo mas nenhum do debate ético. Teoricamente, iPSCs pode ser gerado a partir de qualquer tipo de célula obtido a partir de um indivíduo ou paciente. iPSCs específicos do paciente estão subindo como uma ferramenta potencial que pode simular os fenótipos da doença e condições epigenéticas de cada paciente individual. Usando edição gene ou outros métodos que podem reverter a condição patogénica, iPSCs específicos do paciente também pode ser usado em medicina personalizada ^5. Além disso, são menos iPSCs associada com a rejeição imunitária porque eles têm a mesma identidade imune como doador, tornando auto-transplante mais viável ^6. Portanto, iPSCs tornaram-se a plataforma mais promissora na modelagem de doença, o rastreio de drogas e terapias regenerativas. Tendo em conta estes benefícios, melhores protocolos que podem dar mais puro e rendimentos mais elevados no menor espaço de tempo a partir da fonte de células menores são constantemente em desenvolvimento. Uma consideração importante de encontrar o protocolo mais eficaz para aplicação no futuro é o tipo de célula primária. A maioria dos primeiros geração proto iPSCcols são otimizados para células aderentes uma vez que as linhas de IPSC originais foram induzidas a partir de fibroblastos da pele ^4. No entanto, o isolamento e a preparação destas células são trabalho intensivo. Além disso, o isolamento de fibroblastos da pele inclui procedimentos cirúrgicos invasivos que podem se tornar uma grande falha de aplicação mais ampla.

Portanto, para a continuação da utilização de iPSCs, uma fonte de células com a aquisição conveniente é necessária. O sangue é considerado como uma fonte de células ideal, uma vez que é obtido através de um procedimento minimamente invasivo, em vez ^{de 7-9.} Neste estudo, foi desenvolvida uma modificação simples de gerar o protocolo hiPSCs de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Sem o difícil processo de expansão de um tipo de células específico, tais como as células CD34 +, células de sangue completo ou PBMC foram serialmente plaqueadas em placas revestidas com matriz por centrifugação após transdução com vírus Sendai contendo factores Yamanaka. Este método reduz o tempo necessário para ofixação de células flutuantes transduzidos e diminuiu a perda de células reprogramadas que não foram capazes de anexar por conta própria.

Protocolo

Declaração de Ética: Este protocolo de estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Católica da Coreia (KC12TISI0861).

1. Isolamento de células monocíticas a partir de sangue

1. Isolamento de células monocíticas (dia -5)
   1. Obter pelo menos 10 ml de sangue fresco a partir de uma colheita de sangue em um tubo de preparação de células (CPT).
   2. Transferir o sangue para um novo tubo cónico de 50 ml e dilui-la com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a uma proporção de 1: 4.
      NOTA: Uma maior razão de diluição pode ser usado para uma pureza mais elevada.
   3. Adicionar 10 mL de meio de gradiente de densidade para um novo tubo cónico de 50 ml e cuidadosamente em camadas o sangue diluído em cima dos meios de gradiente de densidade. Centrifugar a 750 xg durante 30 min à temperatura ambiente (TA), sem um freio de centrifugação.
   4. Transferir cuidadosamente a camada Buffy para um novo tubo cónico de 50 ml, adicionar 30 ml de PBS ao tubo, e lavar as células.
   5. Centrifugar as células a 515 xg durante 5 min à TA.
   6. Descartar o PBS e ressuspender as células em 0,5 ml de meio de células de sangue.
   7. Contar as células e placa 1 x 10 ⁶ células por poço de uma placa de 24 poços. Adicionar PBS aos poços circundantes para evitar a evaporação.
   8. Estabilizar as células durante 5 dias a 37 ° C em 5% de CO ₂ antes da transdução. Adicionar um adicional de 0,5 ml de meio de células do sangue fresco nos dias 3-4, sem perturbar as células.

2. A transdução por vírus Sendai

1. Transdução (Dia 0)
   1. Coletar e transferir as células do sangue para um tubo cônico de 15 ml e contá-los usando um hemocitômetro.
   2. Preparar 3 x 10 ⁵ células por transdução e centrifugar as células a 515 xg durante 5 min à TA.
   3. Descartar o sobrenadante por aspiração e ressuspender as células em 0,5 ml de meio de células de sangue.
   4. Transferir as células para um poço de uma placa não-revestido de 24 poços.
   5. Descongelar a mistura de vírus Sendai em gelo e adicioná-lo ao sucélulas spended. Adicionar vírus Sendai para as células com base nas recomendações do fabricante.
   6. Selar a placa com uma película de selagem e centrifugar que a 1.150 xg durante 30 min a 30 ° C.
   7. Após centrifugação, as células incubar a 37 ° C em CO ₂ durante a noite (O / N) 5%.
2. transferência de células de matriz alimentador (Dia 1)
   1. No dia seguinte, revestimento de uma placa de 24 poços com vitronectina. Dilui-se a solução de vitronectina em PBS para uma concentração final / ml 5 ug. Adicionar 1 mL de vitronectina a um poço de uma placa de 24 poços e incuba-se que à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h. Remover a solução de revestimento antes da sua utilização. As placas revestidas podem ser armazenadas em TA durante 3 dias.
   2. Transferir todos os meios contendo as células e os vírus para o poço revestido.
   3. Recolher as células restantes com um adicional de 0,5 ml de meio de células de sangue fresco e adicioná-lo para a célula contendo bem.
   4. Centrifugar a placa a 1150 xg durante 10 min a 35 ° C.
   5. Depois centorifugation, remover o sobrenadante, adicionar 1 ml de meio CIPS, e manter as células a 37 ° C em 5% de CO ₂ O / N.
3. transferência de segunda célula (Dia 2)
   1. Revestir os poços de uma nova placa de 24 cavidades com 5 ug / mL de vitronectina, conforme descrito no passo 2.2.1. Utilize uma das cavidades da placa para cada transdução.
   2. Transferir a suspensão de células a partir da primeira placa de placa de vitronectina recém-revestidos.
      NOTA: Se não for necessário, as células em suspensão podem ser descartados. O procedimento indicado no passo 2.3 pode ser repetido 2-3 vezes com as células em suspensão. Se as etapas serão repetidas, a colheita das células.
   3. Enquanto isso, adicionar 1 ml de meio iPSC ao poço da primeira placa, para manutenção, e incuba-se que a 37 ° C em 5% de CO ₂ O / N.
   4. Manter as células ligadas a 37 ° C e 5% de CO ₂ e efectuar uma mudança de meio ao dia com meios iPSC fresco. Colónias aparecerão nos dias 14-21 após a transdução.
   5. Centrifuge a placa de recém-revestidos contendo as células em suspensão a 1.150 xg e 35 ° C durante 10 min.
   6. Após centrifugação, as células incubar a 37 ° C em 5% de CO ₂ O / N.
   7. No dia seguinte, remover o sobrenadante e substituí-la por meios IPSC frescos.
      NOTA: O procedimento mencionado na etapa 2.3 pode ser repetido 2-3 vezes com as células em suspensão. Se as etapas serão repetidas, a colheita das células do sobrenadante e repetir o passo 2.3.
   8. Manter as células unidas com mudanças de meio dia até 80% de confluência é atingido.

3. Manutenção celular reprogramadas

1. manutenção cedo após a cultura em placa de 24 poços
   1. 7-10 dias após a transdução, uma vez que as células estão confluentes, preparar, um prato de vitronectina-revestido de 60 mm. Diluir solução vitronectina em PBS para uma concentração final / ml 5 ug. Adicionar 1 mL de vitronectina para o prato e incubar-lo à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
   2. Lava-se aas células com PBS e adicionar 1 ml de PBS EDTA / 1 mM para separar as células.
   3. Incubar-los a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 2 min.
   4. Colheita das células e centrifugar a 250 xg los e TA durante 2 min. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 3 ml de meio fresco IPSC.
   5. Placa todas as células ressuspenso para o prato recém-revestida de 60 mm.
   6. Adiciona-se 10 mM de inibidor de cinase RHO para as células e mantê-las a 37 ° C em 5% de CO ₂ até que as células estão 80% confluentes.
2. Dividir para o aparecimento de colónias (Subclonagem Preparação)
   1. Prepare, um prato revestido com vitronectina de 100 mm, tal como descrito no passo 3.1.2.
   2. Lavam-se as células com PBS e adicionar 1 ml de EDTA PBS / 1 mM para separar as células.
   3. Incubar-los a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 2 min.
   4. Colheita das células e centrifugar a 250 xg los e TA durante 2 min.
   5. Contar as células utilizando um hemocitómetro e preparar a 1 x 10 ⁴ células por prato.
   6. Centrifugar as células a 250 xg e TA durante 2 min.
   7. Ressuspender 1 x 10 ⁴ células em 6 ml de meios iPSC, placa-los sobre o prato revestido de 100 mm, e adicionar 10 RHO mM inibidor da quinase para a mídia.
   8. Incubar as células a 37 ° C em 5% de CO ₂ durante uma semana até grandes colónias aparecem.
      NOTA: manter e expandir as colônias para subclonagem. Subclonagem geralmente é feito em menos de 5 passagens.
3. Colony escolher usando iPSC colónia solução destacando
   1. Uma semana antes de picking colônia, semente 1 x 10 ⁴ células em uma, de 100 mm prato revestido de vitronectina, conforme mencionado na etapa 3.2.7.
   2. Prepare, um prato revestido de vitronectina de 60 mm por adição de 2 ml de solução de vitronectina e incubou-se à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
   3. Ao observar através de um microscópio (40X ou 100X), marque as colónias com limites claros usando uma caneta. Remover a solução de vitronectina a partir da nova placa feita no passo 3.3.2 e adicionar 6 mliPSC de meio suplementado com 10 mM de RHO quinase.
   4. Remover o meio de cultura das células e lavá-los com 3 ml de PBS.
   5. Adicionar 1 ml de solução de retirar iPSC colónia e incubar durante 30 segundos a temperatura ambiente.
   6. Remover a solução a partir da placa e incubar-lo à TA durante mais 30 seg.
   7. Com uma pipeta P200, desenhe 200 mL de mídia da placa e retire as colônias alvejados por pipetagem. Transferir as colônias espalhadas ao novo prato de 100 mm.
   8. Incubar e manter as células a 37 ° C em 5% de CO _2.
      NOTA: Depois de obter uma colónia iPSC pura, as células foram mantidas até que chegaram passagem 10. Caracterização foi feito depois de pelo menos 10 passagens. Diluições de anticorpos e informações iniciador são mostrados nas Tabelas 1 e 2.

Resultados

Este protocolo apresenta um método simples para reprogramar CMSPs isolados a partir de sangue. Usando a combinação de chapeamento de série e centrifugação, iPSCs foram geradas com sucesso. Com este método, iPSCs poderia ser gerado com uma pequena quantidade de células de sangue completo, sem isolamento ou a expansão de um tipo de célula específico. Nós com sucesso gerado iPSCs de apenas 1x10 ⁴ células em uma placa de cultura de células pequenas.

Discussão

Dado que as células estaminais embrionárias (CES) mostrou várias deficiências, foi necessária a necessidade de uma ferramenta alternativa. Portanto, o desenvolvimento de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) por Yamanaka ficou sob os holofotes internacionais. Tem sido quase uma década desde Yamanaka descobriu que pluripotência pode ser induzida pela adição de apenas quatro genes em células somáticas adultas. Desde iPSCs são "induzidos" a partir de células somáticas adultas, eles podem f...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer