Индуцированные плюрипотентные поколение стволовых клеток из клеток крови с помощью вируса Сендай и центрифугирование

Резюме

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

Аннотация

Недавнее развитие человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) доказали, что зрелые соматические клетки могут вернуться к недифференцированной, плюрипотентного состояния. Теперь, перепрограммирование осуществляется с различными типами взрослых соматических клеток: кератиноциты, клетки мочи, фибробласты и т.д. Ранние эксперименты обычно с помощью дермальных фибробластов. Тем не менее, это потребовало инвазивной хирургической процедуры, чтобы получить фибробласты от пациентов. Следовательно, подвесные клетки, такие как кровь и моча клетки, считались идеальными для перепрограммирования из-за удобства получения первичных клеток. Здесь мы сообщаем эффективный протокол для генерации иПСК из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Путем покрывать трансдуцированных МНПК последовательно к новой, матрицы с покрытием пластин с помощью центрифугирования, этот протокол может легко обеспечить IPSC колонии. Этот метод также применим к пупочной мононуклеарных клеток пуповинной крови (CBMCs). Это исследование представляет собой простой и эффективный Protocol для перепрограммирования МНПК и CBMCs.

Введение

Стволовые клетки являются одним из наиболее привлекательных материалов в клинической терапии в течение последних нескольких десятилетий ^1. Привлекательные свойства стволовых клеток плюрипотентности и способность к самообновлению. В 1981 году, первые эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) были выделены из эмбриона мыши ^2. Однако, когда техника была применена к эмбрионов человека, она столкнулась с рядом этических проблем.

В 2006 году , когда доктор Яманака и его команда перепрограммировали первый плюрипотентные клетки от мышей соматических клеток, поле стволовых клеток вновь обрела возможность и интерес был реанимирован ^3. Предоставляя несколько определенных факторов, плюрипотентные стволовые клетки были успешно "индуцированные" из взрослых соматических клеток, и, таким образом, были названы "индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК)." В 2007 году этот метод был применен к клеткам человека ^4, получая клетки с точными характеристиками ЭСК , но ни одна из этических дискуссий. Теоретически, плюрипотентныхCs могут быть получены из любого типа клеток, полученной из любого индивидуума или пациента. Специфическая для пациента иПСК растут как потенциальный инструмент, который может имитировать фенотипа заболевания и эпигенетических условия каждого отдельного пациента. Использование редактирования гена или другие методы , которые могут полностью изменить патогенное состояние, иПСК конкретного пациента , также может быть использован в персонифицированной медицины ^5. Кроме того, иПСК менее связаны с иммунным отторжением , потому что они имеют один и тот же иммунный идентичность в качестве донора, что делает автоматической трансплантации более осуществимыми ^6. Поэтому иПСК стали наиболее перспективной платформой в моделировании заболеваний, скрининга лекарственных средств и регенеративной терапии. С учетом этих преимуществ, улучшенные протоколы, которые могут дать более чистым и более высокие урожаи в наименьшее количество времени от самого маленького источника клеток постоянно находятся в стадии разработки. Одним из главных факторов найти наиболее эффективный протокол для будущего применения является тип первичной ячейкой. Большинство ранних иПСК поколения протосмещ_по_столбцам оптимизированы для адгезивных клеток , так как оригинальные IPSC линии были вызваны из фибробластов кожи ^4. Тем не менее, выделение и получение этих клеток являются трудоемкими. Кроме того, выделение фибробластов кожи включает в себя инвазивных хирургических процедур, которые могут стать одним из основных недостатков для более широкого применения.

Таким образом, для дальнейшего использования ИПСК, источник клеток с удобным приобретением требуется. Кровь рассматривается как идеальный источник клеток , так как она получена через довольно минимально инвазивные процедуры ^7-9. В данном исследовании мы разработали простую модификацию протокола генерации hiPSCs из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). Без сложного процесса расширения определенного типа клеток, таких как клетки CD34 +, целые клетки крови или PBMC, серийно высевали на матричных пластинок, покрытых центрифугированием после трансдукции с вирусом Сендай, содержащим Яманака факторы. Этот метод уменьшило время, необходимое дляприсоединение трансдуцированных плавающих клеток и снижение потерь перепрограммировать клетки, которые не смогли прикрепить на свои собственные.

протокол

Заявление по этике: Этот протокол исследования был одобрен этическими комитетами католического университета Кореи (KC12TISI0861).

1. Выделение моноцитов из крови

1. Выделение моноцитов (День -5)
   1. Получают по крайней мере 10 мл свежей крови из взятия крови в препарате клеток трубки (CPT).
   2. Перенести кровь на новый 50-мл коническую пробирку и разбавить его стерильным фосфатно-буферным солевым раствором (PBS) в соотношении 1: 4.
      Примечание: более высокий коэффициент разбавления может быть использовано для более высокой чистоты.
   3. Добавьте 10 мл градиента плотности сред на новый 50-мл коническую пробирку и осторожно слой разбавленного кровь на верхней части градиента плотности сред. Центрифуга при 750 х г в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) без центрифугирование тормоза.
   4. Аккуратно перенести БАФФИ слой на новый 50-мл коническую пробирку, добавляют 30 мл PBS на пробирку, и промыть клетки.
   5. Центрифуга клетки при 515 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
   6. Выбросите PBS и клетки вновь суспендируют в 0,5 мл клеток крови сред.
   7. Граф клеток и пластины 1 × 10 ⁶ клеток на лунку 24-луночного планшета. Добавить PBS в окружающие лунки, чтобы предотвратить испарение.
   8. Стабилизируйте клетки в течение 5 дней при температуре 37 ° С в 5% CO ₂ до того трансдукции. Добавить еще 0,5 мл свежей клеток крови СМИ в дни 3-4, не нарушая клетки.

2. Трансдукция вирус Сендай

1. Трансдукция (день 0)
   1. Собрать и перенести клетки крови в 15-мл коническую трубку и сосчитать их с помощью гемоцитометра.
   2. Подготовьте 3 х 10 ⁵ клеток на трансдукции и центрифугировать клетки при 515 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
   3. Жидкость над осадком сливают отсасыванием и клетки вновь суспендируют в 0,5 мл клеток крови сред.
   4. Передача клеток в лунку без покрытия пластины 24-луночного.
   5. Оттепель вирус Сендай смесь льдом и добавить его к сутовар.Обращайте клетки. Добавить вирус Сендай в клетки, основанные на рекомендациях изготовителя.
   6. Уплотнение пластины с уплотнительной пленкой и центрифугировать его на 1,150 мкг в течение 30 мин при 30 ° С.
   7. После центрифугирования, инкубировать клетки при 37 ° С в 5% CO ₂ в течение ночи (O / N).
2. Передача клеток фидерными матрицы (1 день)
   1. На следующий день, пальто 24-луночного планшета с витронектина. Разбавляют раствор витронектиновый в PBS для конечной 5 мкг концентрации / мл. Добавить 1 мл витронектина в лунку 24-луночного планшета и инкубировать ее при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа. Удалите раствор для нанесения покрытия перед использованием. Покрытые планшеты могут храниться в КТ в течение 3-х дней.
   2. Перенесите все носители, содержащие клетки и вирус к лунке.
   3. Соберите оставшиеся клетки с дополнительными 0,5 мл свежей клеток крови СМИ и добавить его в клетке, содержащей хорошо.
   4. Центрифуга планшет при 1,150 мкг в течение 10 мин при 35 ° С.
   5. После того, как процентаrifugation, удалить супернатант, добавить 1 мл иПСК сред, а также поддерживать клетки при 37 ° С в 5% СО ₂ O / N.
3. Второй перенос клеток (2-й день)
   1. Покрывают лунки нового 24-луночного планшета с 5 мкг / мл витронектина, как описано в пункте 2.2.1. Используйте одну лунку планшета для каждого трансдукции.
   2. Передачи клеточной суспензии от первой пластины на вновь покрытой витронектина пластины.
      Примечание: Если не требуется, в суспензионной могут быть отброшены. Процедура, упомянутая в пункте 2.3 можно повторить 2-3 раза с суспензией клеток. Если будет повторяться шаги, сбора клеток.
   3. В то же время, добавляют 1 мл иПСК сред в скважину первой пластины, для технического обслуживания, и инкубировать при 37 ° С в 5% СО ₂ O / N.
   4. Поддерживать прикрепленные клетки при 37 ° С и 5% СО ₂ и выполнить ежедневное изменение СМИ со свежими иПСК средств массовой информации. Колонии появится в дни 14-21 после трансдукции.
   5. Centrifugе вновь покрытием пластины, содержащий суспензию клеток при 1150 х г и 35 ° С в течение 10 мин.
   6. После центрифугирования, инкубировать клетки при 37 ° С в 5% СО ₂ O / N.
   7. На следующий день, удалить супернатант и заменить его свежей средой IPSC.
      Примечание: Процедура, упомянутая в пункте 2.3 можно повторить 2-3 раза с суспензией клеток. Если будет повторяться шаги, сбора клеток в супернатант и повторите шаг 2.3.
   8. Поддерживать прикрепленные клетки с изменениями ежедневных СМИ до 80% конфлуэнтности пока не будет достигнута.

3. перепрограммировать сотовый техническое обслуживание

1. Раннее обслуживание после культивирования пластины 24-луночного
   1. Через 7-10 дней после трансдукции, как только клетки сливающийся, готовят витронектиновый покрытием, 60-мм блюдо. Развести витронектиновый раствор в PBS для конечной 5 мкг концентрации / мл. Добавить 1 мл витронектина на блюдо и инкубировать ее при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа.
   2. мытьклетки с PBS и добавляют 1 мл PBS / 1 мМ ЭДТА, чтобы отделить клетки.
   3. Выдержите их при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 2 мин.
   4. Сбора клеток и их центрифуге при 250 мкг и КТ в течение 2 мин. Удалить супернатант и клетки вновь суспендируют в 3 мл свежей среды, IPSC.
   5. Пластинчатые все ресуспендировали клетки на вновь покрытую 60-мм блюдо.
   6. Добавляют 10 мМ ингибитор киназы RHO к клеткам и поддерживать их при температуре 37 ° С в 5% CO ₂ до тех пор , пока клетки не являются 80% сплошности.
2. Сплит для внешнего вида колонии (Субклонирование Подготовка)
   1. Приготовьте витронектином с покрытием, 100-мм чашку, как описано в пункте 3.1.2.
   2. Вымойте клеток с PBS и добавьте 1 мл PBS / 1 мМ ЭДТА, чтобы отделить клетки.
   3. Выдержите их при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ в течение 2 мин.
   4. Сбора клеток и их центрифуге при 250 мкг и КТ в течение 2 мин.
   5. Граф клеток с использованием гемоцитометра и подготовить 1 х 10 ⁴ клеток на чашку.
   6. Центрифуга клетки при 250 мкг и комнатной температуре в течение 2 мин.
   7. Ресуспендируют 1 х 10 ⁴ клеток в 6 мл иПСК сред, пластины их на покрытую 100-мм чашку и добавляют 10 мМ ингибитор киназы RHO в средствах массовой информации.
   8. Инкубируйте клетки при 37 ° С в 5% CO ₂ в течение недели до появления крупных колоний.
      Примечание: Поддерживать и расширять колонии для субклонирования. Субклонирование обычно делается в возрасте до 5 проходов.
3. Колонии сбор с использованием IPSC колонии отсоединение решение
   1. За неделю до сбора колонии, семена 1 х 10 ⁴ клеток в витронектина покрытием, 100-мм блюдо, как указано в пункте 3.2.7.
   2. Приготовьте витронектином с покрытием, 60-мм чашку, добавив 2 мл витронектина раствора и инкубирования при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 часа.
   3. Наблюдая под микроскопом (40х или 100х), отметьте колонии с четкими границами, используя маркером. Удалить решение витронектиновый из новой пластинки, изготовленной на этапе 3.3.2 и добавьте 6 млIPSC из средств массовой информации с добавлением 10 мМ RHO-киназы.
   4. Удалите культуральную среду из клеток и промыть их 3 мл ФБС.
   5. Добавляют 1 мл IPSC колонии отсоединении раствора и инкубировать их в течение 30 секунд при комнатной температуре.
   6. Удалить раствор из пластины и инкубировать ее при комнатной температуре в течение еще 30 сек.
   7. Использование P200 пипетки, возьмите 200 мкл среды из пластины и снять целевые колонии пипеткой. Перенесите разбросанные колонии на новый 100-мм блюдо.
   8. Инкубируют и поддержания клеток при 37 ° С в 5% CO _2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После получения чистого IPSC колонии, клетки поддерживали, пока они не достигли прохода 10. Характеристика было сделано после того, как по меньшей мере 10 проходов. Разведений антител и праймер информация приведены в таблицах 1 и 2.

Результаты

Этот протокол представляет собой простой способ перепрограммировать МНПК, выделенные из крови. Используя сочетание последовательного обшивкой и центрифугирования, иПСК были успешно создана. С помощью этого метода, иПСК может быть сгенерирован с небольшим количеств...

Обсуждение

Так как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) показал несколько недостатков, требовалось необходимость альтернативного инструмента. Таким образом, развитие индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) путем Яманака попал под международный центр внимания. Прошло почти десят?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 ml Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
24-well Plate	TPP	92024
PBMC Isolation Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
Ficoll	GE Healthcare	17-1440-03
StemSpan	STEMCELL Technologies	9805	Blood cell media
CC110	STEMCELL Technologies	8697	Blood cell media supplement (100x)
iPSC Generation and Culture Materials
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	iPSC media
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Colony detaching solution
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10X TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	Rinse Buffer
Sodium Chloride	Duchefa Biochemie	S0520.1000	Rinse Buffer
Tween-20	BIOSESANG	T1027	Rinse Buffer
Hydrochloric Acid	Duksan	1129	Rinse Buffer