فتح القصبة الهوائية المعدة حمض الطموح فأري موديل الحاد الرئة إصابة النتائج في القصوى الحاد غير قاتل الرئة الإصابات

Summary

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Abstract

التهاب رئوي الحمضي هو أحد الأسباب الرئيسية لمعقمة إصابة الرئة الحادة (علي) في البشر. التهاب رئوي حمض يمتد الطيف السريري من أعراض متلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS)، وتتميز الأسناخ العدلات، وإصابة كل من ظهارة السنخية وبطانة الأوعية الدموية. سريريا، ويعرف ARDS من بداية حادة من نقص الأكسجة، تتسرب الرئوية غير مكتمل الثنائية وذمة رئوية غير قلبية. وقد وفرت الدراسات الإنسانية لنا معلومات قيمة عن التغيرات الفسيولوجية والتهابات في الرئة الناجمة عن ARDS، وهو ما أدى إلى ظهور عدة فرضيات حول آليات تلميذه. للأسف، أدت الصعوبات تحديد مسببات ARDS، فضلا عن مجموعة واسعة من الفيزيولوجيا المرضية في نقص المعلومات الهامة التي يمكن أن تكون مفيدة في تطوير استراتيجيات علاجية.

نماذج حيوانية متعدية ذات قيمة عندما reproduc المرضية والفيزيولوجيا المرضية بدقةمفهوم عصام ثبت في كل من في المختبر والسريرية. على الرغم من أن النماذج الحيوانية الكبيرة (على سبيل المثال، الأغنام) خصائص حصة تشريح شجرة القصبة الهوائية الشعب الهوائية الإنسان، وتقدم نماذج الفئران مجموعة من المزايا الأخرى بما في ذلك: تكلفة منخفضة؛ القصير الإقراض دورة التناسلي نفسه إلى مزيد من الحصول على البيانات. نظام مناعي مفهومة جيدا. والجينوم تتميز بشكل جيد يؤدي إلى توافر مجموعة متنوعة من حذف الجينات والسلالات المعدلة وراثيا. نموذج قوي من درجة الحموضة الناجمة ARDS منخفضة يتطلب الفئران ALI الذي يستهدف بشكل رئيسي ظهارة السنخية، ثانوي بطانة الأوعية الدموية، وكذلك الشعب الهوائية الصغيرة التي تؤدي إلى الحويصلات الهوائية. وعلاوة على ذلك، بسبب اصابة في استنساخه مع وجود اختلافات واسعة بين مختلف الإهانات الضارة وغير الضارة هو المهم.

نموذج طموح حمض المعدة الفئران المقدمة هنا باستخدام حمض الهيدروكلوريك توظف القصبة الهوائية مفتوحة وبإعادة سيناريو الممرضة أن يستنسخ انخفاض الرقم الهيدروجيني pneumonإصابة يتيس في البشر. بالإضافة إلى ذلك، وهذا النموذج يمكن استخدامها لدراسة تفاعل منخفضة إهانة درجة الحموضة مع الكيانات الأخرى الرئوية الضارة (على سبيل المثال، جزيئات الطعام والبكتيريا المسببة للأمراض).

Introduction

يتميز ARDS التهاب الرئة على نطاق واسع وينظر سريريا ضيق حاد في التنفس مع نقص الأكسجة. هذه الأعراض غالبا ما تحدث أقل من 24 ساعة بعد الحدث التحريض على مثل الصدمات النفسية، وتعفن الدم، عمليات نقل الدم أو ردود فعل الطموح. ويتميز هذا histopathologically من الأسناخ العدلات (أي التهاب واسع النطاق) المترجمة إلى ظهارة السنخية وبطانة الأوعية الدموية مما يؤدي إلى تسرب البروتين وتكوين غشاء زجاجي في وقت لاحق. يتم تصنيف الطموح باسم الالتهاب الرئوي الكيميائية أو الالتهاب الرئوي التنفسي. ¹ عنصر الحمضية من المعدة طموح يساهم في كل من التهاب رئوي والميل إلى تطوير الالتهاب الرئوي الجرثومي الثانوي. مرض الالتهاب الرئوي التنفسي هي واحدة من عوامل الخطر المؤدية للALI والتطور اللاحق للARDS. ²

طموح المعدة هو حدث الحاد الذي يعرف بأنه استنشاق المواد من رانه المعدة مع أو بدون النباتات الفم والبلعوم إلى الشعب الهوائية وراء الحبال الصوتية. قد يحتوي على محتويات نضح منخفض السائل درجة الحموضة في المعدة، والبكتيريا، والدم، أو جزيئات الطعام. غالبا ما يحدث طموح المعدة في المرضى في وحدة العناية المركزة (ICU)، الذي عادة ما تكون في حالة الصيام، وبالتالي وضعت على مثبطات مضخة البروتون للحد تطلع محتويات المعدة المحمض. الإصابة ALI في عدد السكان وحدة العناية المركزة في الولايات المتحدة هو 2.5 - أعلى 5 مرات بالمقارنة مع السكان المريض العامة. ³ لسوء الحظ، غالبا ما تؤدي هذه الظروف المهيئة لحالة من النمو الزائد للبكتريا في المعدة والتي قد تؤدي إلى عواقب أكثر خطورة في الرئة بعد الحدث الطموح، كما تطلع المعدة هو عامل خطر مستقل لتطوير الالتهاب الرئوي الجرثومي الثانوي (متوسط ضغط الدم الانقباضي) ، ALI وARDS.

طموح المعدة من عنصرين رئيسيين هما: حمض الهيدروكلوريك ومحتويات المعدة، التي قد تكون أو لا تحتوي على البكتيرياأو جسيمات المواد الغذائية. في نموذج القوارض المكون الحمضي وحده تطلع المعدة تنتج الاستجابة الالتهابية الأولية نتيجة للإصابة الكاوية مباشرة لانخفاض الرقم الهيدروجيني على ظهارة الهوائية. ويلي ذلك عملية تسلل العدلات واستجابة التهابية في 4-6 ساعة. ⁴ هذان العاملان تؤدي في نهاية المطاف إلى تدمير سلامة الاوعية الدموية الدقيقة في الرئة مما يؤدي إلى تسرب السوائل والبروتينات إلى الحويصلات الهوائية والشعب الهوائية. لفهم هذا الفيزيولوجيا المرضية ومواصلة التحقيق التدخلات العلاجية الممكنة، فمن المهم تطوير وتوصيف نموذج حيواني أن يلقي ضوءا الآليات الكامنة المعنية. ونضح الحمضية يجب أن تكون وحدها ضخمة أو مع انخفاض الرقم الهيدروجيني بما فيه الكفاية لتجاوز قدرة التخزين المؤقت من الجهاز التنفسي وتصل إلى الحويصلات الهوائية. إذا كان هذا لا يحدث، يحدث فقط العليا، وإجراء إصابة المجاري التنفسية العابرة التي ليس من المرجح أن تؤدي إلى مضاعفات شديدة من ARDS. ^{5 <}/ سوب>

لمحاكاة حدث طموح بدقة مع ظهارة السنخية المصابة، فمن المهم لتجاوز الدفاعات الطبيعية للحيوان. باستخدام نموذج طموح الماوس لإنتاج ALI الذي يحاكي إصابة حمض المعدة ينظر في البشر، يجب على المرء أن يفسر الاختلافات في شجرة القصبة الهوائية الشعب الهوائية. تقنية القصبة الهوائية المفتوحة التي تستخدم هذه الطريقة لتجاوز الخلافات بين الفئران والأشجار الجهاز التنفسي الإنسان ونماذج إصابة بطريقة يستنسخ ALI على حد سواء من الناحية الفسيولوجية وتشريحيا. تاريخيا، كان يستخدم التنبيب داخل الرغامى لتوليد ALI، ومع ذلك يعتبر من الصعب القيام بها في الفئران دون وقوع إصابات الحنجرة. لذلك، هذا الأسلوب يوفر بديلا محتملا أسفرت عن نتائج متسقة عبر الباحثون متعددة ومع الحد الأدنى من الإجراءات الوفيات المنسوبة.

Protocol

لا بد من جمعها وتنظيمها قبل إجراء كاف جميع المواد والمعدات. هذا الإجراء هو أن تتم مع الانتقال السلس من خطوة واحدة إلى أخرى من أجل توفير بيانات استنساخه متسقة. هذا البروتوكول يتبع سياسات مؤسسية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في المركز الطبي لشؤون المحاربين القدماء الجاموس.
ملاحظة: استخدمت كل من الذكور والإناث C57BL / 6 الفئران لهذا البروتوكول. ليس هناك اختلاف كبير في تسرب الزلال بين الجنسين.

1. إعداد حمض الهيدروكلوريك

1. جعل 56.2 ملم حمض الهيدروكلوريك _عقيمة وذلك بإضافة 281 ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك إلى 4.72 مل محلول ملحي معقم (SNS). عاير لدرجة الحموضة 1.25 مع 1 N حمض الهيدروكلوريك (≈ 0-50 ميكرولتر).
2. جعل هذا المستحضر قبل طازجة للإصابة. كما لا مخزنة انخفاض الرقم الهيدروجيني SNS فإنه يضمن الهيدروكلوريك إصابة حمض إهانة عابرة.

2. التخدير والقصبة الهوائية التعرض تقنية

ملحوظة:ضمان أن تتم إجراءات إصابة في غطاء الدخان مع تصفية الفحم لمسح الغاز المخدر. الحفاظ على ظروف معقمة ضرورية لأن هذا هو عملية جراحية البقاء على قيد الحياة. استخدام القفازات المعقمة وتعقيم جميع الأدوات في كوب حبة أداة جراحية معقم قبل الجراحة على كل حيوان. من المستحسن استخدام الستائر لعزل موقع الجراحة للحفاظ على عقم. استخدام الأيزوفلورين مثل غاز مخدر، حيث أنه يوفر ذوبان منخفضة نسبيا غازات الدم مما يسمح للتحريض السريع للتخدير، وكذلك الانتعاش السريع بعد وقوع الضرر.

1. تبدأ من خلال إحداث التخدير في غرفة مع 2.75٪ الأيزوفلورين في الأكسجين مع معدل تدفق 2 لتر / دقيقة.
2. مرة واحدة يتم تخدير الماوس بشكل كاف (لا تستجيب إلى أخمص القدمين قرصة قوية بما يكفي لعدم كسر الجلد أو يسبب تلف الأنسجة العميقة)، تعليق الماوس عن طريق القواطع متفوقة بطول 15 سم من 1-0 خياطة الحرير مضفر في موقف ضعيف على 60 ^س مجلس انحدر تشريح.
3. ويحتفظ ضمان التخدير طوال الجراحة عن طريق تقديم الأيزوفلورين من خلال مخروط الأنف. تطبيق مرهم البيطرية على العين الماوس لمنع جفاف.
4. حلق جزء بطني من الرقبة مع الانتهازي الكهربائية وتطبيق محلول مطهر موضعي (أي بوفيدون اليود). إزالة مطهر الزائد مع الشاش والسماح الجافة (~ 15-30 ق).
5. اختراق خط الوسط في الرقبة من الشق القصية للجزء السفلي للالفك مع 100 ميكرولتر 0.5٪ بوبيفكين (لتوفير تسكين ما قبل، peri-، وبعد الجراحة).
6. جعل 1 - 1.5 سم شق خط الوسط الطولي في الرقبة مع مشرط أو مقص غرامة المنحنية. اختراق الغشاء اللفافي بين الغدد اللعابية عن طريق تشريح حادة مع 2 ملقط مسنن المنحنية لفضح القصبة الهوائية (التي حددتها حلقات الغضروف البيضاء).
7. لا تزال تستخدم 2 ملقط مسنن، فهم جانب واحد من العضلات المجاورة للرغامى وتسحبه إلى الجانب بينما تشريح بين المصحفالألياف شركة كلي طوليا القادمة إلى القصبة الهوائية.
8. مرة واحدة يتم تأسيس طائرة تشريح، تواصل التراجع في العضلات المجاورة للرغامى كما عملت الزوج الثاني من ملقط تحت القصبة الهوائية. استخدام هذه ملقط لوضع حبلا 15 سم من 1-0 خياطة الحرير مضفر إلى غيض من ملقط والجذب من خلال وضع خياطة وراء القصبة الهوائية.

الإجراءات تقطير 3. البينية القصبة الهوائية

1. تحضير حقنة إصابة تقطير عن طريق ملء حقنة 0.5 مل تعلق على إبرة 22 G مع 0.2 مل من الهواء تليها 3.6 مل / كغ من حمض الهيدروكلوريك. سوف الهواء تعمل للمساعدة في تشتت للسيارة، فضلا عن مناورة تجنيد السنخية لتلك الحويصلات الهوائية التي قد خضعوا لانخماص خلال إدارة التخدير.
   ملاحظة: اتبع إرشادات IACUC المحلية بشأن تسكين بعد العملية والتشاور مع الطبيب البيطري المحلي. كن حذرا حول استخدام أي المسكنات مع خصائص مضادة للالتهابات قبل توظيفجي هذا النموذج من إصابة الرئة معقمة.
2. لإدارة الإصابة، أولا التوقف عن إدارة الأيزوفلورين. السماح عمق مخدر الماوس لترتفع لحوالي 10 - 15 ثانية حتى يبدأ للرد على قرصة اصبع القدم الملقط.
3. تبدأ على الفور خطوات تقطير الاصابة. إذا عمق مخدر عميق جدا والحيوان لا يتنفس من تلقاء أنفسهم بعد تقطير إصابة، وهو صحيح خاصة بالنسبة للإصابات حمض الهيدروكلوريك تحتوي على.
4. هل لديك مساعد ضغط على القفص الصدري لطرد القدرة الحيوية.
5. استخدام 1-0 مضفر خياطة الحرير وضعت سابقا حول القصبة الهوائية لتوفير الجر عن طريق سحبها متفوق ومن ثم إدراج إبرة حقنة في القصبة الهوائية بين ^الحادي و1 و 2 ^{الثانية} حلقات غضروفية تحت الحنجرة. شطبة إبرة يجب ان يواجه الجراح والتقدم حتى شطبة هو مجرد الماضي القصبة الهوائية مع الإبرة كما بالتوازي مع القصبة الهوائية ممكن.
6. الافراج عن الصدر قبل إدارة البلعة منحمض الهيدروكلوريك من أجل ضمان تشتت وترسب في مجرى الهواء القاصي والحويصلات الهوائية. إيداع بلعة في ما يقرب من 0،5 حتي 0،75 الصورة. الحفاظ على إبرة في القصبة الهوائية حتى يتم أخذ أول نفس العفوي للتأكد من أن حجم الإصابة البلعة بأكمله يتم استنشاق إلى الرئتين.
7. انهيار شق باستخدام إما 1-2 المواد الغذائية الجلد أو الغرز.

4. استعادة

1. باستخدام 5 مل حقنة بإبرة 26 G، حقن 1 مل SNS تحت الجلد في القفا من الرقبة لإنعاش السوائل. على الرغم من أن هناك فقدان السوائل الحد الأدنى من خلال الإجراء، في أعقاب عملية جراحية الماوس يميل إلى عدم شرب ويحتمل أن يذوى. بدلا من ذلك، توفير SNS عن طريق الحقن داخل الصفاق.
2. مكان الماوس في غرفة ساخنة عند 37 درجة مئوية مع perfused 100٪ O _2. تأكد من أن الفأر هو تعافى بشكل كاف قبل وضعها مرة أخرى في السكن. مراقبة الحيوانات ولا تترك دون معالجة خلال هذا الوقت حتى الإسعافية وتماما صecovered.

5. الشعبى الغسل ومعالجة الرئة

1. حمل والحفاظ على التخدير الأيزوفلورين كما هو موضح في الخطوة 2.1 و 2.2 الخطوة. تأكيد طائرة كافية من التخدير باستخدام طريقة قرصة أخمص قدميه هو موضح في الخطوة 2.2.
2. تأمين في موقف ضعيف على لوحة تشريح واستخدام حلقة من 1-0 خياطة الحرير مضفر مدمن مخدرات على القواطع متفوقة على تمديد الرقبة. تطبيق مرهم البيطرية على العينين لمنع جفاف.
3. بعد إزالة المواد الغذائية جلد الرقبة، وجعل شق طولي خط الوسط من خلال الجلد عن جدار البطن السفلي من خلال شق الرقبة السابق إلى الفك السفلي مع المقص.
4. جعل شق خط الوسط في الجهاز العضلي البريتوني مع مقص وسحب أعضاء البطن مع الإسفنج لفضح الفضاء خلف الصفاق. إذا كانت هناك حاجة الدم، وجمع من الشريان الأورطي البطني أو الوريد الأجوف السفلي عند هذه النقطة.
5. الموت ببطء الحيوان عن طريق استنزاف من قبل transecting وabdomالشريان الأورطي إينال والوريد الأجوف السفلي. من خلال الاستفادة من بضع الصدر الثنائي في الخطوة التالية سيتم الانتهاء طريقة مؤكدة الثانوي القتل الرحيم إنسانية على النحو المحدد من قبل الإرشادات IACUC.
6. خرم الحجاب الحاجز للتسبب انهيار الرئة. ثم استخدام العظام قطع مقص، وقطع بعيدا الحجاب الحاجز وقطع طريق القفص الصدري مواز لوعلى جانبي القص. استخدام مرقئ قفل لسحب رفرف القصية لتسهيل ضخ 5 مل دافئ (37 درجة مئوية) هانك في محلول الملح المتوازن مع الكالسيوم والمغنيسيوم إلى البطين الأيمن إلى تدفق الأوعية الدموية في الرئة.
   1. كما يتم الحصول على الدم من الشريان الأورطي لتقييم مستويات خلوى الطرفية قبل الإجراء الموضح في هذه الورقة، وجعل شق صغير في البطين الأيسر لتوفير تدفق الضروري للدم لمغادرة تعميمها على تدفق كاف الأوعية الدموية الرئوية إن لم يكن الحصول على الدم .
7. دعم مجلس تشريح لانحدر 60 درجة واستخدام الالإجراء البريد الوارد وصفها في الخطوة 2.2 لتسهيل إدخال 20 G س ½ "قنية الفولاذ المقاوم للصدأ في القصبة الهوائية وآمنة مع خياطة 1-0.
8. وضع مجلس تشريح أفقيا وإجراء غسل القصبات (نال).
   1. لأداء نال إرفاق اثنين من 5 المحاقن مل إلى 3 في اتجاه ومحبس. ملء حقنة واحدة مع 5 مل من SNS والمسمار في ميناء محبس. إرفاق فارغة 5 مل حقنة لميناء 2 ^{الثانية،} وأخيرا إرفاق فتح منفذ من محبس لقنية داخل القصبة الهوائية وضعها في الخطوة 5.6. غرس 1 مل من NS إلى الرئتين وغسيل مع حقنة الثانية.
   2. كرر لمدة 5 مجموع 1 instillations مل NS الحرص على أن قنية القصبة الهوائية لا تزال آمنة وموازية للالقصبة الهوائية حتى لا تمزق القصبة الهوائية.
9. للتحليل النسيجي، يقني؛ يدخل القنية القصبة الهوائية كما في الخطوة 5.7. إصلاح الرئتين عن طريق insufflating مع 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة في 20 سم H ₂ O لمدة 24 ساعة.
10. إزالة كل الرئة الفص carefully باستخدام مقص وملقط بواسطة transecting القصبات الهوائية بالقرب من نقير. وضع كل فص الرئة (المجموع 5) في كاسيت الأنسجة قبل أن يتم تضمينها في البارافين. قطع 5 ميكرومتر أقسام الأنسجة مع مشراح، وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين باستخدام تقنيات النسيجية القياسية. ⁶ Morphometrics يمكن أيضا أن يؤديها على الشرائح النسيجية لقياس التهاب الخطورة. ⁴
11. معالجة بال استردادها عن طريق الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. قسامة supernatants بال خالية من الخلايا في المبالغ المعادلة إلى 2.0 مل أنابيب microcentrifuge لتحليل المستقبل. تخزين في -80 درجة مئوية.
12. تحليل بال للتركيز الزلال بواسطة ELISA، أو أي منتج البيولوجية الأخرى المثيرة للاهتمام. ¹¹ الخلايا مكعبات من BAL يمكن عدها، عينات cytoslide ولدت، وملطخة وصمة عار على أساس رايت بالغيمزا للأبيض تقرير خلايا الدم التفريقي لتقييم الرئتينرد فعل للالتهابات.

النتائج

التشريح المرضي الرئوي من نموذج الفئران من حمض الطموح التهاب الرئة

أصيب الفئران كما هو موضح أعلاه وأزيلت الرئتين 24 ساعة بعد انخفاض درجة الحموضة إهانة، مقطوع وH & E الملون (الشكل 1). الخلا...

Discussion

وكان الهدف من تطوير نموذج حيواني ALI باستخدام طموح حمض المعدة التي تشبه الفيزيولوجيا المرضية التي تحدث في البشر خلال تطوير التهاب رئوي الحمضي وARDS اللاحقة. في وضع نموذج، اخترنا الأنواع الحيوانية التي توفر عالية للحصول على البيانات الإنتاجية بسبب انخفاض تكلفته، ال?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1x2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 ga x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator