Abrir traqueostomia ácido gástrico aspiração Modelo murino de lesão pulmonar aguda Resultados em Maximal aguda não-letal Lung Injury

Resumo

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Resumo

pneumonite de ácido é uma das principais causas de lesão pulmonar aguda estéril (ALI) em seres humanos. pneumonite ácido abrange o espectro clínico de assintomática à síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), caracterizada por alveolite neutrofílica e ferimentos a ambos epitélio alveolar e endotélio vascular. Clinicamente, ARDS é definido pelo início agudo de hipoxemia, infiltrados pulmonares irregulares bilaterais e edema pulmonar não cardiogênico. Estudos em humanos têm nos forneceu informações valiosas sobre as alterações fisiológicas e inflamatórias no pulmão causados ​​por ARDS, o que levou a várias hipóteses sobre os mecanismos subalterno. Infelizmente, as dificuldades que determinam a etiologia da SDRA, bem como uma ampla gama de fisiopatologia resultaram em uma falta de informação crítica de que poderiam ser úteis no desenvolvimento de estratégias terapêuticas.

modelos animais translacionais são valiosas quando sua patogênese e fisiopatologia reproduc precisãoEA conceito comprovado em estudos in vitro e cenários clínicos. Apesar de grandes modelos animais (por exemplo, ovelhas) compartilham características da anatomia da árvore traqueia-brônquica humana, modelos murinos fornecer uma série de outras vantagens, incluindo: baixo custo; empréstimos curto ciclo reprodutivo em si a uma maior aquisição de dados; um sistema imunológico bem compreendida; e um genoma bem caracterizados levando à disponibilidade de uma variedade de estirpes de deleção do gene e transgénicos. Um modelo robusto da SDRA induzida de pH baixos requer uma murino ALI que tem como alvo principalmente o epitélio alveolar, secundariamente, o endotélio vascular, bem como as pequenas vias que conduz aos alvéolos. Além disso, uma lesão reprodutível com grandes diferenças entre os diferentes insultos prejudiciais e não prejudiciais é importante.

O modelo de aspiração de ácido gástrico murino aqui apresentada usando ácido clorídrico emprega uma traqueostomia aberta e recria um cenário patogênico que reproduz o baixo pH pneumonitis ferimentos em seres humanos. Além disso, este modelo pode ser usado para examinar a interacção de um insulto baixo pH com outras entidades pulmonares prejudiciais (por exemplo, partículas de alimentos, as bactérias patogénicas).

Introdução

SDRA é caracterizado por inflamação pulmonar disseminada e é clinicamente visto como falta de ar aguda com hipoxemia. Estes sintomas geralmente ocorrem menos de 24 horas após um evento incitar tais como trauma, sepsis, reações relacionadas transfusão de sangue ou aspiração. É caracterizada histologicamente por alveolite neutrofílica (isto é, inflamação generalizada) localizada ao epitélio alveolar e endotélio vascular que conduz à fuga de proteínas e a formação de membrana hialina posteriormente. A aspiração é classificado como pneumonia química ou pneumonia por aspiração. ¹ O componente ácido da aspiração gástrica contribui tanto para a pneumonite e predilecção para desenvolver uma pneumonia bacteriana secundária. A pneumonia por aspiração é um dos principais fatores de risco para ALI e subsequente desenvolvimento de ARDS. ²

aspiração gástrica é um evento agudo definido como a inalação de materiais de tele estômago com ou sem flora da orofaringe para as vias aéreas para além das cordas vocais. O conteúdo aspirado pode conter reduzido de líquido do estômago pH, bactérias, sangue, ou partículas de alimentos. aspiração gástrica ocorre frequentemente em pacientes de Unidade de Terapia Intensiva (UTI), os quais são tipicamente em um estado de jejum e, assim, colocada sobre um inibidor da bomba de protões para limitar aspiração do conteúdo gástrico acidificado. A incidência de LPA na população UTI em os EUA é de 2,5 - 5 vezes maior em comparação com a população em geral do paciente. ³ Infelizmente, estas condições predisponentes muitas vezes levam a um estado de crescimento excessivo de bactérias no estômago que pode levar a sequelas mais graves no pulmão após um evento aspiração, como aspiração gástrica é um fator de risco independente para o desenvolvimento de pneumonia bacteriana secundária (PAS) , ALI e ARDS.

aspiração gástrica tem dois componentes principais: o ácido clorídrico e o conteúdo gástrico, os quais podem ou não podem conter bactériasou em partículas de alimentos. No modelo de roedor do componente ácido sozinho de aspiração gástrica produz uma resposta inflamatória inicial, como resultado da lesão cáustica directa de pH baixo no epitélio das vias aéreas. Esta é seguida por uma infiltração de neutrófilos e de uma resposta inflamatória em 4-6 h. ⁴ Estes dois factores em última análise, levar à destruição da integridade microvascular pulmonar levando ao extravasamento de líquidos e proteínas em alvéolos e vias aéreas. Para entender essa fisiopatologia e para investigar possíveis intervenções terapêuticas, é importante desenvolver e caracterizar um modelo animal que elucida os mecanismos subjacentes envolvidos. Um aspirado ácida só deve ser volumosa ou com um pH baixo o suficiente para ignorar a capacidade de tamponamento da árvore respiratória e atingir os alvéolos. Se isso não ocorrer, apenas transitória superior, a realização de lesões das vias aéreas ocorre que é menos provável de levar à sequelas graves de SDRA. ^{5 <}/ Sup>

Para emular um evento aspiração com precisão com epitélio alveolar lesionado, é importante para ignorar as defesas naturais do animal. Usando um modelo de ratinho de aspiração para produzir um ALI que imita a lesão gástrica ácida visto nos seres humanos, um deve levar em conta as diferenças na árvore brônquica-traqueia. A técnica de traqueostomia aberta que este método utiliza ignora as diferenças entre murino e árvores respiratórias humanas e modelos a lesão de uma forma que reproduz ALI tanto fisiologicamente e histologicamente. Historicamente, a intubação intratraqueal foi usada para gerar ALI, no entanto, considera-se difícil de realizar em ratinhos sem ferimento da laringe. Portanto, este método oferece uma alternativa potencial que produziu resultados consistentes em vários pesquisadores e com procedimento de mortalidade mínima atribuída.

Protocolo

Todos os materiais e equipamentos devem ser recolhidos e adequadamente organizado antes do procedimento. O procedimento deve ser realizado com transições suaves de uma etapa para a próxima, a fim de fornecer dados consistentes e reprodutíveis. Este protocolo segue políticas institucionais estabelecidos pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal no Centro Médico Buffalo Veterans Affairs.
NOTA: ambos os sexos masculino e feminino camundongos C57BL / 6 foram utilizados para este protocolo. Não há nenhuma diferença significativa de perda de albumina entre os sexos.

1. Preparação de Ácido Clorídrico

1. Adicione HCl 56,2 mM _estéril por adição de 281 mL de HCl 1 N a 4,72 ml de solução salina normal esterilizada (SNS). Titula-se a pH 1,25 com HCl a 1 N (≈ 0-50 uL).
2. Faça esta preparação fresco antes da lesão. A partir pH SNS não é tamponado assegura a clorídrico insulto lesão ácido é transitória.

2. Anestesia e traqueal técnica de exposição

NOTA:Certifique-se de que o procedimento de lesão é conduzida em um exaustor com filtro de carvão vegetal para a eliminação de gás anestésico. Manutenção de condições estéreis é essencial, pois esta é uma cirurgia sobrevivência. Use luvas estéreis e esterilizar todos os instrumentos em uma conta de vidro instrumento cirúrgico de esterilização antes da cirurgia em cada animal. A utilização de cortinas de isolar o local cirúrgico é recomendado para manter a esterilidade. Use isoflurano como o gás anestésico, pois proporciona uma solubilidade relativamente baixa gás de sangue permitindo rápida indução da anestesia, bem como a rápida recuperação após a lesão.

1. Começar pela indução de anestesia em uma câmara com 2,75% de isoflurano em oxigénio com uma taxa de fluxo de 2 L / min.
2. Uma vez que o mouse está devidamente anestesiados (que não responde aos pés beliscar forte o suficiente para não quebrar a pele ou causar danos de tecidos profundos), suspender o mouse, os incisivos superiores com um comprimento de 15 cm de 1-0 sutura de seda trançada em decúbito dorsal em uma 60 ^o prancha inclinada dissecção.
3. Certifique-se de que a anestesia é mantida durante toda a cirurgia, fornecendo isoflurano através de um cone do nariz. Aplicar pomada veterinária no olho do rato para prevenir o ressecamento.
4. Raspar a porção ventral do pescoço com um aparador eléctrico e aplicar a solução anti-séptica tópica (isto é, a povidona-iodo). Retire o excesso de anti-séptico com gaze e deixe secar (~ 15 - 30 s).
5. Infiltrar-se na linha média do pescoço do entalhe esternal com a parte inferior da mandíbula com 100 mL bupivacaína a 0,5% (para fornecer analgesia pré, peri e pós-operatório).
6. Adicione de 1 - 1,5 centímetros incisão na linha média longitudinal no pescoço com um bisturi ou tesouras finas curvas. Fascial penetrar a membrana entre as glândulas salivares por dissecção romba com 2 pinças curvas serrilhadas para expor a traqueia (identificados pelos anéis de cartilagem branco).
7. Ainda usando os 2 pinças serrilhadas, segure um lado da musculatura paratraqueal e puxe-o para o lado enquanto dissecando entre o musfibras cle longitudinalmente próximos à traqueia.
8. Uma vez plano de dissecção é estabelecida, continuar retracção do músculo paratraqueais como o segundo par de pinças é trabalhado sob a traqueia. Usar estas pinças para colocar uma 15 centímetros cadeia de 1-0 sutura de seda trançada para a ponta do fórceps e puxar por meio de colocação do fio de sutura por trás da traqueia.

3. Intra-traqueal Procedimento instilação

1. Preparar a seringa lesão instilação por enchimento de uma seringa de 0,5 mL ligada a uma agulha de 22 G, com 0,2 mL de ar, seguido de 3,6 ml / kg de ácido clorídrico. O ar irá actuar para auxiliar na dispersão do veículo, bem como uma manobra de recrutamento alveolar para os alvéolos que podem ter sido submetidos a anestesia durante a administração atelectasia.
   NOTA: Siga as orientações locais IACUC em relação a analgesia pós-operatória e consulte o seu veterinário local. Tenha cuidado ao usar quaisquer analgésicos com propriedades anti-inflamatórias antes de empregaring este modelo de lesão pulmonar estéril.
2. Para administrar a lesão, primeiro interromper a administração de isoflurano. Permitir que a profundidade da anestesia do mouse para subir para cerca de 10 - 15 s até que comece a reagir a uma pitada toe fórceps.
3. começar imediatamente passos instilação de lesão. Se a profundidade da anestesia é muito profundo o animal não irá respirar espontaneamente após a instilação lesão, o que é especialmente verdadeiro para lesões contendo ácido clorídrico.
4. Ter um assistente apertar a caixa torácica para expulsar capacidade vital.
5. Use o fio de seda 1-0 trançado colocado anteriormente em torno da traquéia para fornecer tração puxando-superiormente e, em seguida, inserir a agulha da seringa na traqueia entre o 1 ^° e 2 ^° anéis cartilaginosos, abaixo da laringe. O bisel da agulha deve enfrentar o cirurgião e avançar até o cone é apenas passado a traqueia com a agulha como paralelo com a traqueia possível.
6. Solte o peito imediatamente antes da administração bolus deácido clorídrico, a fim de assegurar a dispersão e a deposição nas vias respiratórias distais e alvéolos. Depositar o bolus em cerca de 0,5-0,75 s. Manter a agulha na traqueia até que a primeira respiração espontânea é feita para assegurar que todo o volume de bolus lesão é inalado para dentro dos pulmões.
7. Fechar a incisão utilizando ou 1 - 2 grampos de pele ou suturas.

4. Recuperação

1. Usando uma seringa de 5 mL com uma agulha de 26 G, injectam-se 1 mL SNS por via subcutânea na nuca do pescoço para reanimação fluido. Embora não haja perda de fluido mínima durante o procedimento, após a cirurgia o mouse tende a não beber e potencialmente pode desidratar. Em alternativa, fornecer SNS através de uma injecção intraperitoneal.
2. Coloque o rato na câmara aquecida a 37 ° C perfundidos com 100% de _O2. Certifique-se de que o mouse está devidamente recuperados antes de serem colocados de volta para a habitação. Monitorar os animais e não deixar sem vigilância durante este tempo até r ambulatorial e totalmenteecovered.

5. Lavagem Broncoalveolar e Pulmão Processing

1. Induzir e manter anestesia de isoflurano, conforme descrito no Passo 2.1 Passo 2.2. Confirmar plano adequado de anestesia e utilizando o método toe pitada descrito no Passo 2.2.
2. Seguro na posição supina sobre um tabuleiro de dissecação e utilizar um ciclo de 1-0 sutura de seda trançada enganchado sobre os incisivos superiores para estender o pescoço. Aplicar pomada veterinária nos olhos para evitar a secura.
3. Depois de retirar os grampos de pele do pescoço, fazer uma incisão longitudinal na linha média através da pele a partir da parede abdominal inferior através da incisão no pescoço anterior à mandíbula com uma tesoura.
4. Faça uma incisão na linha média na musculatura peritoneal com uma tesoura e retirar os órgãos abdominais com esponjas para expor o espaço retroperitoneal. Se o sangue for necessário, recolha a partir da aorta abdominal ou veia cava inferior, neste ponto.
5. Eutanásia do animal através de sangria, ao seccionar o Abdomaorta inal e veia cava inferior. Através da utilização de uma toracotomia bilateral no passo seguinte um método de confirmação secundário da eutanásia com humanidade vai ser preenchido, tal como estabelecido pelas directrizes IACUC.
6. Perfurar o diafragma para causar o colapso do pulmão. Em seguida, usando uma tesoura de corte de osso, cortar o diafragma e cortar através da caixa torácica paralela e em ambos os lados do esterno. Utilize uma pinça hemostática de bloqueio para retirar a tampa do esterno para facilitar a injecção 5 mL quente (37 ° C) Solução Salina Equilibrada de Hank com cálcio e de magnésio para o ventrículo direito para lavar a vasculatura pulmonar.
   1. À medida que o sangue a partir da aorta é obtido para avaliar os níveis de citocinas periféricas antes do procedimento descrito no presente documento, fazer uma pequena incisão no ventrículo esquerdo, para proporcionar fluxo de saída necessárias para o sangue a sair da circulação de descarga adequado da vasculatura pulmonar, se não a obtenção de sangue .
7. Prop a placa dissecção a uma inclinação de 60 ° e usar the procedimento descrito no passo 2.2 para facilitar a inserção de um 20 G x ½ "cânula de aço inoxidável na traqueia e seguro com uma sutura 1-0.
8. Coloque a placa de dissecção horizontalmente e realizar uma lavagem broncoalveolar (BAL).
   1. Para realizar o BAL anexar dois 5 seringas ml a uma torneira de 3 vias. Encha uma seringa com 5 mL de SNS e parafuso na porta da torneira. Anexar um vazio seringa de 5 mL a uma porta ^2º e finalmente anexar porta aberta da torneira a cânula intra-traqueal colocado no Passo 5.6. Incutir 1 mL de NS para os pulmões e lavado com segunda seringa.
   2. Repita durante 5 total 1 instillations mL NS tendo o cuidado de que a cânula traqueal permanece protegida e paralela à traqueia para que ele não rasgar a traqueia.
9. Para a análise histológica, canular a traqueia como no Passo 5,7. Fixar os pulmões por insuflação com 10% de formalina tamponada neutra a 20 cm de H ₂ O durante 24 h.
10. Remova cada Caref lobo pulmonarully usando tesouras e pinças, ao seccionar brônquio próximo do hilo. Colocar cada lóbulo do pulmão (total 5) em uma cassete histologia antes de serem embebidos em parafina. Corte de 5 mm secções de tecido com um micrótomo, e manchar com hematoxilina e eosina utilizando técnicas histológicas padrão. ⁶ Morfometria também pode ser realizada sobre os cortes histológicos para quantificar a gravidade da inflamação. ⁴
11. Processar a BAL recuperadas por centrifugação a 1500 xg durante 3 minutos a 4 ° C. Alíquota os sobrenadantes LBA livre de células em quantidades equivalentes em 2,0 mL tubos de microcentrífuga para análise futura. Armazenar a -80 ° C.
12. Analisar o LBA para a concentração de albumina por meio de ELISA, ou qualquer outro produto biológico de interesse. ¹¹ As células sedimentadas a partir da BAL pode ser contado, espécimes cytoslide gerado, e coradas com corante Wright-base-Giemsa para determinação da contagem diferencial de glóbulos brancos para avaliar os pulmões 'reacção inflamatória.

Resultados

Pulmonar Histopatologia do modelo murino de ácido aspiração Pneumonite

Os ratinhos foram feridos como descrito acima e os pulmões foram removidos 24 horas após o insulto de pH baixo, seccionadas e coradas com H & E (Figura 1). células necróticas, perda da arquitetura do parênquima pulmonar, as células e os detritos dentro de espaços aéreos e infiltração significativa PMN são claramente observado...

Discussão

O objetivo foi desenvolver um modelo animal ALI por meio de aspiração de ácido gástrico que se assemelha a fisiopatologia que ocorre em seres humanos durante o desenvolvimento de pneumonite ácido e ARDS subsequentes. No desenvolvimento de um modelo, escolhemos uma espécie animal que oferece alta taxa de transferência de aquisição de dados, devido ao seu baixo custo, ciclo reprodutivo curto, e um sistema imunológico bem compreendido com uma abundância de ferramentas de investigação (ou seja, a...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1x2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 ga x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator