最大急性非致死肺損傷における急性肺損傷の結果のオープン気管切開胃酸吸引マウスモデル

要約

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

要約

酸性肺炎、ヒトにおける無菌の急性肺損傷（ALI）の主要な原因です。酸性肺炎は、好中球肺胞炎を特徴とする急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、無症候性、および損傷からの肺胞上皮と血管内皮の両方に臨床スペクトルに及びます。臨床的には、ARDSは低酸素血症の急性発症、二国間の斑状肺浸潤と非心原性肺水腫によって定義されます。ヒトでの研究は、下っ端のメカニズムについて様々な仮説につながっているARDSによって引き起こされる肺の生理学的および炎症性変化、についての貴重な情報をご提供しています。残念ながら、ARDSの病因、ならびに病態生理の広い範囲を決定する難しさは、治療戦略を開発するのに有用である可能性があり、重要な情報の不足をもたらしています。

ときに、その病因と病態生理を正確にreproduc翻訳動物モデルは価値がありますEAのコンセプトは、in vitroおよび臨床設定の両方で証明します。人間の気管・気管支樹の解剖学の大動物モデル（ 例えば 、羊）共有特性が、マウスモデルは、以下を含む他の利点のホスト提供：低コストを。より大きなデータ収集に自分自身を貸し短い生殖サイクル;よく理解免疫学的システム。そして十分に特徴付けゲノムは遺伝子欠失およびトランスジェニック株の様々な利用可能性につながります。低pH誘発されるARDSの堅牢なモデルは、主に肺胞上皮、二次血管内皮、ならびに肺胞につながる小さな気道を標的とネズミALIが必要です。また、別の有害および非有害侮辱の間に大きな違いが再現可能な損傷が重要です。

塩酸を用いて、ここで提示したマウス胃酸吸引モデルはオープン気管切開を採用し、低pH pneumonを再現病原シナリオを再現しますヒトでのITISけが。さらに、このモデルは、他の肺傷害（ 例えば 、食物粒子、病原性細菌）エンティティと低pH傷害の相互作用を調べるために使用することができます。

概要

ARDSは、広範囲の肺の炎症を特徴とし、臨床的に低酸素血症との息の急性息切れとして見られています。これらの症状は、多くの場合、このような外傷、敗血症、輸血関連反応または吸引などの扇動イベント後24時間未満が起こります。これは、肺胞上皮およびタンパク質漏出し、その後硝子膜形成につながる血管内皮に局在好中球肺胞炎（ すなわち 、広範囲の炎症）によって組織病理学的特徴としています。吸い込んで化学性肺炎や誤嚥性肺炎に分類されます。 ¹胃吸引の酸性成分は、二次的細菌性肺炎を発症する肺炎と偏愛の両方に貢献しています。誤嚥性肺炎はALIとARDSのその後の発展のための主要な危険因子の一つです。 ²

胃吸引がトンからの物質の吸入のように定義された急性事象であります彼は声帯を越えて気道に口腔咽頭細菌叢の有無にかかわらず胃。吸引内容は低pH胃液、細菌、血液、または食物粒子を含んでいてもよいです。胃の吸引は、多くの場合、絶食状態で典型的に集中治療室（ICU）の患者に発生し、このようにして酸性化し、胃内容物の吸引を制限するために、プロトンポンプ阻害剤上に置きました。一般の患者集団に比べて5倍高い - 米国のICU集団におけるALIの発生率は2.5です。胃の吸引は、二次細菌性肺炎（SBP）の開発のための独立した危険因子であるとして³残念ながら、これらの素因の条件は、多くの場合、吸引イベント後の肺においてより深刻な後遺症につながる可能性が胃の中で細菌異常増殖の状態につながります、ALIとARDS。

塩酸および胃内容物、または細菌を含んでも含まなくてもよい：胃の吸引は、2つの主要コンポーネントがありますまたは食品粒子。げっ歯類モデルにおいて単独で胃吸引の酸成分は、気道上皮上の低pHの直接苛性損傷の結果として、初期の炎症反応を生成します。 6時間 - これは、好中球浸潤および4での炎症反応が続いています。 ⁴これらの2つの要因が、最終的にこのように肺胞および気道への流体およびタンパク質の血管外漏出につながる肺微小血管の完全性の破壊につながります。この病態生理を理解するために、さらに可能な治療介入を調査するために、関係する基礎となるメカニズムを解明する動物モデルを開発し、特徴づけることが重要です。単独の酸性吸引は膨大または呼吸樹の緩衝能力をバイパスし、肺胞に到達するのに十分な低pHである必要があります。これが発生しない場合は、唯一の一過性の上部、誘導気道損傷はARDSの重症後遺症につながるしにくい起こります。 ^{5 <}/ SUP>

負傷した肺胞上皮で正確に吸引イベントをエミュレートするためには、動物の自然な防御を迂回することが重要です。ヒトで見られる胃酸傷害を模倣ALIを生成するために、マウスの吸引モデルを使用して、1は、気管、気管支樹の違いを考慮する必要があります。この方法は利用オープン気管切開技術は両方の生理学的および組織学的にALIを再現する方法で、マウスおよびヒトの呼吸器木とモデルの違いけがをバイパスします。気管内挿管は、ALIを生成するために使用された歴史的に、しかし喉頭損傷することなく、マウスで行うことは困難と考えられています。したがって、この方法は、複数の研究者を横断し、最小限の手順起因する死亡率との一貫性のある結果が得られた潜在的な代替手段を提供しています。

プロトコル

すべての資機材は、収集され、適切に手続きの前に編成する必要があります。手順は、一貫した、再現可能なデータを提供するために、次の1つのステップからのシームレスな移行で行われるべきです。このプロトコルは、バッファロー退役軍人医療センターの施設内動物管理使用委員会によって設定された制度の方針に従っています。
注：雄および雌C57BL / 6マウスの両方がこのプロトコルのために使用しました。男女間のアルブミン漏出の有意な差は存在しません。

1.塩酸準備

1. 4.72 mLの無菌生理食塩水（SNS）に1 N HClを281μLを添加することにより、56.2 mMのHClを_滅菌してください。 1NのHCl（ - 50μL≈0）でpH 1.25に滴定します。
2. 損傷前にこの準備が新鮮ください。低pH SNSがバッファリングされていないとして、それは、塩酸傷害侮辱が一時的である保証します。

2.麻酔および気管露光技術

注意：傷害手順は麻酔ガス掃気用の木炭フィルター付きドラフト内で行われていることを確認。これは生存手術であるとして、無菌状態の維持が不可欠です。滅菌手袋を使用し、それぞれの動物に手術前にガラスビーズ手術器具の滅菌器内のすべての機器を滅菌します。手術部位を隔離するためにドレープの使用は、無菌性を維持することをお勧めします。それは麻酔の迅速な誘導、ならびに損傷後の急速な回復を可能にする比較的低い血液ガス溶解性を提供するように麻酔ガスとして、イソフルランを使用してください。

1. 2リットル/分の流量で酸素中2.75％イソフルランとチャンバ内麻酔を誘導することによって開始します。
2. マウスが適切に（皮膚を破るまたは深部組織損傷を引き起こさないために十分に強いピンチつま先に反応しない）に麻酔されると、60に仰臥位で1-0編組絹縫合糸の長さ15cmと優れた切歯によるマウスを一時停止^O解剖ボードを傾けます。
3. 麻酔はノーズコーンを介してイソフルランを提供することにより、手術を通じて維持されていることを確認してください。乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医の軟膏を適用します。
4. 電動トリマーで首の腹側部分を剃るおよび局所消毒液（ すなわち 、ポビドンヨード）を適用します。ガーゼで余分な防腐剤を取り外し、乾燥させてください（〜15から30秒）。
5. （、前閉経期、および術後鎮痛を提供するために）100μLの0.5％ブピバカインと顎の下部に胸骨切痕から首の正中線を潜入。
6. メスまたは湾曲した微細なハサミで首さ1.5cm縦正中切開 - 1を加えます。 （白軟骨リングによって識別される）気管を露出させるために2湾曲した鋸歯状の鉗子で鈍的切開により唾液腺の間の筋膜の膜を貫通しています。
7. まだ2鋸歯状の鉗子を使用して、三菱UFJ証券との間で解剖しながら、傍気管筋組織の片側を把握し、側にそれを引っ張ります気管の長手方向に次のCLE繊維。
8. 切開面が確立されると、鉗子の第二の対は、気管の下で働いされているよう傍気管筋を後退させる続けます。鉗子の先端に1-0編組絹縫合糸の15cmのストランドを配置し、気管の後ろに縫合糸を配置するために乗り越えるために、これらの鉗子を使用してください。

3.気管内点滴注入手順

1. 塩酸3.6 mLの/ kgで続いた空気の0.2 mLで22 G針に取り付けられた0.5 mLシリンジを充填することによって傷害点滴注射器を準備します。空気は、車両の分散を助けるように作用するだけでなく、麻酔の投与中無気肺を受けていてもよいものを肺胞のための肺胞リクルートメント手技ます。
   注：術後鎮痛に関するローカルIACUCガイドラインに従って、あなたの地元の獣医師に相談してください。採用前に抗炎症特性を有する任意の鎮痛薬の使用には注意してください無菌の肺傷害のこのモデルをる。
2. けがを管理するには、最初のイソフルラン投与を中止。それは鉗子つま先のピンチに反応し始めるまで15秒 - マウスの麻酔深度は、約10のために上昇することを可能にします。
3. すぐに怪我の点滴注入ステップを始めます。麻酔深度が深すぎる場合、動物は、塩酸を含む負傷者に特に当てはまる傷害点眼、後に自発呼吸はありません。
4. アシスタントは肺活量を追放するために胸郭を絞る必要があります。
5. 上方に引っ張ってトラクションを提供した後、1 ^番目と2 ^番目の喉頭下の軟骨環の間の気管内に注射針を挿入する気管の周りに以前に置か1-0編組絹縫合糸を使用してください。ベベルはちょうどできるだけ気管と平行として針で気管を過ぎるまで、針のベベルは、外科医、事前に直面している必要があります。
6. ただのボーラス投与の前に胸をリリース遠位気道と肺胞の中に分散し、堆積を確保するために塩酸。 0.75秒 - およそ0.5にボーラスを堆積させます。最初の自発呼吸の全体傷害ボーラス量が肺に吸入されることを保証するために取られるまで、気管内に針を保管してください。
7. 2皮膚ステープルまたは縫合糸 - 1のいずれかを使用して閉じる切開。

4.回復

1. 26 G針を5 mLの注射器を使用して、輸液蘇生のための首筋に皮下1mLのSNSを注入。最小限の流体損失が処置中にありますが、手術後のマウスは飲まないようにし、潜在的に脱水することができる傾向があります。また、腹腔内注射を介して SNSを提供しています。
2. 100％のO ₂で灌流し、37℃で加熱したチャンバー内にマウスを置きます。マウスが十分に戻ってハウジング内に配置される前に回収されることを確認してください。動物を監視し、歩行と完全にRまで、この時間の間に無人のままにしないでくださいecovered。

5.気管支肺胞洗浄および肺処理

1. ステップ2.1およびステップ2.2で説明したようにイソフルラン麻酔を誘導し、維持します。ステップ2.2で説明したつま先のピンチ方式を使用して麻酔の適切な面を確認してください。
2. 解剖ボード上の仰臥位に固定し、首を拡張するために、優れた切歯に引っ掛け1-0編組絹縫合糸のループを使用します。乾燥を防ぐために、目に獣医の軟膏を適用します。
3. 首の皮膚ステープルを除去した後、ハサミで下顎の前の首の切開部を介して下部腹壁から皮膚を通して正中縦切開を行います。
4. ハサミで腹膜筋肉組織における正中切開を行い、後腹膜腔を露出するためにスポンジで腹部臓器を撤回。血液が必要な場合は、この時点で腹部大動脈または下大静脈から収集します。
5. abdomを横断することにより放血を経由して動物を安楽死させますinal大動脈と下大静脈。 IACUCガイドラインによって確立され、次のステップで二国間の開胸術を利用することにより安楽死の二次確認方法は人道的に完了します。
6. 肺の虚脱を起こす振動板を穿孔。その後、はさみを切断骨を使用して、ダイアフラムを離れてカットし、胸骨の両側にし、上の胸郭の並列を切断。肺血管系をフラッシュするために右心室へのカルシウムとマグネシウムと5 mLの温かい（37℃）ハンクス液を注入容易にするために、胸骨のフラップを後退させるために、ロック止血剤を使用してください。
   1. 大動脈から血液を前に、この論文に記載されている手順と周辺サイトカインレベルを評価するために得られるように、血液を取得していない場合は、十分なフラッシュに肺血管系の循環を残すために、血液のために必要な流出を提供するために、左心室に小さな切開を作ります。
7. 60°傾斜に解剖ボードをプロップと目を使用E手順は、気管内20 Gのx½ "のステンレス鋼カニューレを挿入促進し、1-0縫合糸で固定するためにステップ2.2で説明しました。
8. 水平解剖ボードを置き、気管支肺胞洗浄（BAL）を行います。
   1. BALを実行するには、3方活栓に2つの5 mLの注射器を取り付けます。 SNSの5 mLで1注射器を記入し、コックのポートにねじ込みます。 2 ^番目のポートに空の5 mLシリンジを取り付け、最後にステップ5.6に配置された気管内カニューレに活栓のオープンポートを接続します。第2のシリンジと、肺や洗浄にNSの1ミリリットルを植え付けます。
   2. 5合計1 mLのNSの点滴は、それが気管を引き裂くないように気管カニューレが保護されたと気管と平行に残っていることを注意しながら手順を繰り返します。
9. 組織学的分析のために、ステップ5.7のように気管にカニューレを挿入。 24時間、20センチH ₂ Oで10％中性緩衝ホルマリンで吹き込むことにより、肺を修正しました。
10. 各肺葉を削除carefully門の近くに気管支を横断することにより、ハサミやピンセットを使用して。前パラフィン中に包埋されることに組織学カセット内の各肺葉（5合計）を配置します。ミクロトームを用いて5μmの組織切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン、標準組織学的技術を用いて染色します。 ⁶形態計測はまた、重症度、炎症を定量するために、組織学的スライド上で行うことができます。 ⁴
11. 4℃で3分間、1500×gで遠心分離することにより回収BALを処理します。将来の分析のために2.0 mlのマイクロ遠心チューブに等量で無細胞BAL上清を等分。 -80℃で保管してください。
12. ELISAによるアルブミン濃度、または目的の任意の他の生物学的製品のBALを分析します。 BALから¹¹ペレット化した細胞をcytoslide標本が生成され、カウント、および肺を評価するための白血球差分カウントの決意」のため、ライトギムザベースの染料で染色することができます炎症反応。

結果

酸吸引性肺炎のマウスモデルの肺組織病理学

上記の肺が（ 図1）切片にし、H＆E染色し、24時間後に低pH侮辱を除去した。としてマウスが負傷しました壊死細胞は、肺実質アーキテクチャ、細胞デブリ気腔内と有意なPMN浸潤の損失が明確に観察されています。臨床的に吸引と同様に、斑状PMN浸潤および線維性タン?...

ディスカッション

目的は密接酸肺炎とその後のARDSの開発中に、ヒトに起こる病態生理学に似ている胃酸吸引を使用して、ALIの動物モデルを開発することでした。モデルの開発では、我々は、その低コスト、短生殖サイクル、および調査ツール（ すなわち 、モノクローナル抗体、トランスジェニック株）の豊富な、よく理解免疫系に高スループットのデータ収集を提供しています動物種を選択しま?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1 cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5 cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1 x 2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 gauge x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator