Akut Akciğer Hasarı Açık Trakeostomi Gastrik Asit Aspirasyon Fare Modeli Maksimal Akut Ölümcül olmayan Akciğer Hasarı Sonuçlar

Özet

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Özet

Asit pnömoni insanlarda steril akut akciğer hasarı (ALI) önemli bir nedenidir. Asit pnömoni asemptomatik gelen alveol epitel ve damar endoteli hem akut solunum sıkıntısı nötrofilik alveolit ​​ile karakterize sendromu (ARDS), ve yaralanma klinik spektrumu kapsar. Klinik, ARDS hipoksemi akut başlangıçlı, bilateral yamalı pulmoner infiltrasyonlar ve non-kardiyojenik pulmoner ödem ile tanımlanır. İnsan çalışmaları ast mekanizmaları hakkında çeşitli hipotezler yol açmıştır ARDS nedeniyle akciğer fizyolojik ve inflamatuar değişiklikler hakkında değerli bilgiler bize sağladı. Ne yazık ki, ARDS etyolojisi yanı sıra patofizyoloji geniş bir yelpazede belirleyen zorluklar tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde yararlı olabilir kritik bilgi eksikliği neden olmuştur.

onların patogenezi ve patofizyolojisi doğru çoğalır zaman Translational hayvan modelleri değerlidirea kavramı hem in vitro ve klinik ortamlarda kanıtlanmış. Büyük hayvan modellerinde (örneğin, koyun), insan trakea-bronş ağacının anatomisi payı özellikleri, fare modelleri de dahil olmak üzere diğer avantajları bir dizi sağlasa da: düşük maliyetli; büyük veri toplama kısa üreme döngüsü kredi kendisini; Bir iyi anlaşılmış immünolojik sistem; ve iyi karakterize edilmiş genom gen silinmesi ve transjenik suşların çeşitli geçerliliğini temin etmelidir. düşük pH kaynaklı ARDS sağlam bir model esas alveol epitel, ikincil vasküler endoteli, yanı sıra küçük hava yolları alveoller giden hedefleyen bir sıçangillere ALI gerektirir. Ayrıca farklı zararlı olmayan zararlı hakaret arasındaki geniş farklılıklar tekrarlanabilir yaralanma önemlidir.

hidroklorik asit kullanılarak Burada sunulan fare gastrik asit aspirasyon modeli açık bir trakeostomi istihdam ve düşük pH pneumon üretir patojenik senaryo yenidenİnsanlarda itis yaralanması. Buna ek olarak, bu model, diğer pulmoner zararlı (örn gıda parçacıkları, patojenik bakteri) elemanlar ile düşük pH hasara etkileşimini incelemek için kullanılabilir.

Giriş

ARDS yaygın akciğer iltihabı ile karakterizedir ve klinik hipoksemi ile nefes darlığı, akut olarak görülüyor. Bu belirtiler genellikle travma, sepsis, kan transfüzyonu ile ilgili reaksiyonlar veya aspirasyon gibi bir kışkırtmaktan olaydan sonra en az 24 saat oluşur. Alveoler epitel ve protein kaçağı ve sonradan hyalin membran oluşumuna yol açan vasküler endotele lokalize nötrofilik alveolit (yani, yaygın inflamasyon) ile histopatolojik karakterizedir. Aspirasyon kimyasal pnömoni veya aspirasyon pnömonisi olarak kategorize edilir. ¹ mide aspirasyon asidik bileşeni ikincil bakteriyel zatürre geliştirmek pnömoni ve tercih hem katkıda bulunur. Aspirasyon pnömonisi ALI ve ARDS sonraki gelişimi için önde gelen risk faktörlerinden biridir. ²

Mide aspirasyon t malzemelerin inhalasyon olarak tanımlanan akut bir olaydırO ya da ses tellerinin ötesine solunum yollarına orofaringeal floranın olmadan mide. aspire içeriği düşük pH mide sıvısı, bakteriler, kan veya gıda parçacıkları içerebilir. Mide aspirasyon genellikle tipik bir açlık durumunda ve böylece asitlendirilmiş gastrik içeriğin aspirasyonu sınırlamak için bir proton pompa inhibitörü yerleştirilir olan Yoğun Bakım Ünitesinde hastalar (YBÜ), oluşur. genel hasta popülasyonuna göre 5 kat daha yüksek - ABD'de YBÜ popülasyonda ALI sıklığı 2.5 olduğunu. ³ Ne yazık ki, bu hazırlayıcı koşulları genellikle mide aspirasyon ikincil bakteriyel pnömoni gelişimi için bağımsız bir risk faktörü olduğu gibi, bir aspirasyon olayın ardından akciğerde daha ağır sekel neden olabilir midede bakteriyel aşırı çoğalma durumuna (SKB) kurşun ALI ve ARDS.

hidroklorik asit ve mide içeriği ya da bakteri içeren olmayabilir: mide aspirasyon iki önemli bileşeni vardırya da gıda parçacık. kemirgen modelinde, tek başına mide aspirasyon asit bileşeni, hava yolu epiteli üzerinde düşük pH doğrudan kostik yaralanma sonucu bir ilk inflamatuar yanıt üretir. 6 saat - Bu bir nötrofilik infiltrasyonu ve 4 bir inflamatuar yanıt takip eder. ⁴ Bu iki faktör sonuçta böylece alveol ve solunum yollarına sıvı ve protein ekstravazasyonu yol açan pulmoner mikrovasküler bütünlüğünün bozulmasına yol açar. Bu patofizyolojisi anlamak ve daha fazla olası terapötik girişimlerin araştırılması, geliştirilmesi ve ilgili altta yatan mekanizmaları elucidates bir hayvan modeli karakterize etmek önemlidir. Asidik bir aspirat tek başına hacimli veya solunum ağacının tamponlama kapasitesini atlamak ve alveolleri ulaşmak için yeterince düşük pH olmalıdır. Bu oluşmazsa, sadece geçici bir üst, iletken hava yolları yaralanma ARDS ağır sekel neden daha az muhtemel olduğu ortaya çıkar. ^{5 <}/ Sup>

doğru yaralı alveol epitel ile bir aspirasyon olayını taklit etmek için, bir hayvanın doğal savunmasını aşmak için önemlidir. İnsanlarda görülen mide asit hasarı taklit bir ALI üretmek için bir fare aspirasyon modeli kullanarak, bir trakea-bronş ağacının farklılıkları hesaba katmalısınız. Bu yöntem kullanır açık trakeostomi tekniği hem fizyolojik ve histolojik ALI yeniden üreten bir şekilde fare ve insan solunum ağaçlar ve modeller arasındaki farkları yaralanma atlar. Tarihsel, zor entübasyon ancak laringeal yaralanma olmadan farelerde gerçekleştirmek için zor kabul edilir, ALI oluşturmak için kullanıldı. Bu nedenle, bu yöntem birden araştırmacılar arasında ve en az işlem atfedilen mortalite ile tutarlı sonuçlar vermiştir potansiyel bir alternatif sunuyor.

Protokol

Tüm malzemeler ve ekipman toplandı ve yeterince prosedüre önce organize edilmesi gerekir. prosedür tutarlı, tekrarlanabilir veri sağlamak amacıyla sonraki bir adımda sorunsuz geçişler ile yapılan olmaktır. Bu protokol Buffalo Veterans Affairs Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurumsal politikalar izlemektedir.
NOT: erkek ve kadın Hem C57BL / 6 fareler bu protokol için kullanıldı. cinsiyetler arasında albümin kaçağı anlamlı bir fark yoktur.

1. Hidroklorik Asit Hazırlık

1. 4.72 ml steril serum fizyolojik (SNS), 1 N HCI 281 uL eklenmesiyle 56.2 mM HCI _{kısırlığa.} 1 N HCI (- 50 uL ≈ 0) ile pH 1.25 titre edilir.
2. yaralanma bu hazırlık taze önce yapın. Düşük pH SNS, hidroklorik asit yaralanma hakaret geçici olmasını sağlar tamponlu değildir.

2. Anestezi ve Trakeal Pozlama Tekniği

NOT:yaralanma prosedürü anestezik gaz atma için kömür filtreleme ile davlumbaz yapılır emin olun. Bu sağkalım ameliyat gibi steril koşullar kurulması gereklidir. Steril eldiven kullanın ve öncesinde her hayvan cerrahi bir cam boncuk cerrahi alet sterilizatör tüm aletleri sterilize. cerrahi alan izole etmek için örtülerin kullanımı, sterilitesini sağlamak için önerilir. anestezi hızlı indüksiyonunun yanı sıra, yaralanma sonrası hızlı bir düzelme sağlayan, nispeten düşük bir kan gazı çözünürlük temin anestezik gaz olarak izofluran kullanın.

1. 2 L / dakika akış oranı ile oksijen 2.75% izofluran ile bir bölme içinde anestezi uyararak başlayın.
2. Fare yeterince (cilt kırmak ya da derin doku hasarına neden yeterince güçlü tutam ayak tepkisiz) anestezi sonra, bir 60 üzerinde bir yatar pozisyonda 1-0 örgülü ipek sütür 15 cm uzunluğu ile üstün kesici ile fare askıya ^o eğim diseksiyon kurulu.
3. Emin olun anestezi burun konisi ile izofluran sunarak ameliyat boyunca korunur. kuruluğunu önlemek için farenin gözü veteriner merhem sürün.
4. Elektrikli düzeltici boyun ventral kısmı Tıraş ve topikal antiseptik solüsyon (yani, povidon-iyot) uygulanır. gazlı bez ile aşırı antiseptik çıkarın ve kurumaya bırakın (~ 15-30 sn).
5. 100 uL% 0.5 bupivakain ile çene alt kısmına sternal çentik gelen boyun orta hattı Infiltrate (öncesi peri ve post-operatif analjezi sağlamak için).
6. Bir neşter veya kavisli ince makasla boyun 1,5 cm boyuna orta hat kesi - 1 yapın. (Beyaz kıkırdak halkaları tarafından tanımlanan) trakea maruz 2 kavisli tırtıklı forseps ile künt diseksiyon ile tükürük bezlerinin arasında fasya membran nüfuz.
7. Hala 2 tırtıklı forseps kullanarak mus arasındaki diseksiyon sırasında, paratrakeal kas bir tarafını kavramak ve kenara çekintrakea uzunlamasına bir sonraki döngü lifleri.
8. Diseksiyon düzlemi kurulduktan sonra, forseps ikinci çifti trakea altında çalışmış gibi paratrakeal kas geri çekilmeden devam edin. forseps ucu içine 1-0 örgülü ipek sütür 15 cm iplikçik yerleştirin ve trakea arkasında dikiş yerleştirmek yoluyla çekmek için bu forseps kullanabilir.

3. İçi trakeal damlatma Prosedürü

1. hidroklorik asit 3.6 mL / kg ve ardından hava 0.2 mL bir 22 G iğne takılı bir 0.5 mL şırınga doldurma yaralanma instilasyon şırınga hazırlayın. Hava anestezi uygulaması sırasında atelektazisine geçirmiş olabilir, bu alveoller aracın dağılım, hem de bir diş yuvalı alımları manevra yardım etmek için hareket edecektir.
   NOT: post-operatif analjezi ile ilgili yerel IACUC yönergeleri izleyin ve yerel veteriner danışın. istihdam önce anti-inflamatuar özelliklere sahip herhangi bir analjezik kullanma konusunda dikkatli olunSteril akciğer hasarının bu modeli ing.
2. yaralanma yönetmek için ilk olarak izofluran yönetimini durdurma. Bir forseps ayak tutam tepki başlayana kadar 15 sn - farenin anestezi derinliği yaklaşık 10 yükselmesine izin verir.
3. Hemen yaralanma instilasyon adımlarını başlar. anestezi derinliği çok derin ise hayvan hidroklorik asit içeren yaralanmalar için özellikle doğrudur yaralanma damlatılması, sonra kendiliğinden nefes olmaz.
4. asistan vital kapasite sınırdışı göğüs kafesi sıkmak zorunda.
5. Superior çekerek çekiş sağlar ve daha sonra 1 ^st ve 2 ^nci gırtlak altında kıkırdak halkalar arasındaki trakea içine şırınga iğnesi eklemek için trakea etrafında önceden yerleştirilmiş 1-0 örgülü ipek sütür kullanın. konik sadece mümkün olduğunca trakea paralel olarak iğne ile trakea geçmiş kadar iğne konik cerrah ve peşin bakmalıdır.
6. sadece bolus uygulamadan önce göğüs bırakınDistal hava yolu ve alveol içine dağılmasını ve birikimini sağlamak amacıyla hidroklorik asit. 0.75 s - kabaca 0.5 bolus yatırınız. İlk spontan nefes tüm yaralanma Kapsül hacmi akciğerlere inhale emin olmak için alınıncaya kadar trakea iğne tutun.
7. 2 cilt zımba veya sütür - 1 kullanarak yakın kesi.

4. Kurtarma

1. 26 G iğne ile 5 ml şırınga kullanarak, sıvı resüsitasyon için ensesinden deri altından 1 ml SNS enjekte edilir. cerrahi sonrası prosedür sırasında minimal sıvı kaybı, olmasına rağmen fare içmeyin eğilimindedir ve potansiyel kurutmak olabilir. Seçenek olarak ise, bir intraperitoneal enjeksiyon yoluyla SNS sağlar.
2. 37 ° C'de ısıtılmış odasında Yeri fare% 100 O ₂ ile perfüze. Fare yeterince yuva içine geri konulmadan önce kurtarıldı emin olun. Hayvanları izlemek ve ayaktan ve tam r kadar bu süre içinde sahipsiz bırakmayınecovered.

5. Bronkoalveoler Lavaj ve Akciğer İşleme

1. Neden ve Adım 2.1 açıklandığı gibi izofluran anestezisi korumak ve 2.2 adım. Adım 2.2 açıklanan ayak tutam yöntemi kullanılarak anestezi yeterli uçağı onaylayın.
2. diseksiyon gemide bir sırtüstü pozisyonda sabitleyin ve boyun uzatmak için üstün kesici üzerine bağladım 1-0 örgülü ipek sütür bir döngü kullanmak. kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner merhem sürün.
3. boyun derisi Zımba çıkardıktan sonra, makasla mandibula önceki boyun kesiden alt abdominal duvardan deri yoluyla orta hat boyuna kesi yapmak.
4. makasla periton kas bir orta hat kesi yapmak ve retroperitoneal boşluk ortaya çıkarmak için sünger ile karın organları geri çekin. Kan gerekiyorsa, bu noktada abdominal aort veya inferior vena kava toplamak.
5. abdom bölücü ile kan kaybından yoluyla hayvan Euthanizeinal aort ve vena kava inferior. IACUC kurallarına göre kurulan sonraki adımda ikili torakotomi faydalanmak ötenazi ikincil doğrulayıcı yöntem insanca tamamlanacaktır.
6. akciğer çökmesine neden diyaframın Perfore. Sonra diyaframı kesip ve ve sternumun her iki tarafında göğüs kafesi paralel kesti, kesme makası kemik kullanarak. akciğer vaskülatürünün yıkamak için sağ ventriküle, kalsiyum ve magnezyum ile 5 ml sıcak (37 ° C), Hank'in dengeli tuz çözeltisinin enjekte kolaylaştırmak için sternal kapağı geri çekecek bir kilitleme hemostat kullanın.
   1. aorta kan Bu yazıda anlatılan prosedüre önce periferik sitokin düzeylerini değerlendirmek için elde edilir gibi, kan kanı elde değilse, yeterli floş akciğer damarsal dolaşım bırakmak için sol ventrikül küçük bir kesi gerekli çıkışını sağlamak için yapmak .
7. 60 ° eğime diseksiyon kurulu Prop ve inci kullanımıe prosedürü 1-0 sütür ile 20 G x ½ "paslanmaz çelik trakea kanül ve güvenli takmadan kolaylaştırmak için Adım 2.2 tarif.
8. Yatay diseksiyon kurulu yerleştirin ve bir bronkoalveoler lavaj (BAL) gerçekleştirin.
   1. BAL 3-yollu iki 5 ml şırınga eklemek gerçekleştirmek için. SNS 5 ml tek şırınga doldurun ve vana limanına vida. Bir ^2. bağlantı noktasına boş bir 5 ml şırınga takın ve nihayet Adım 5.6 yerleştirilen içi trakeal kanül vana açık port takın. İkinci şırınga ile akciğer ve lavaj içine NS 1 ml aşılamak.
   2. o trakea gözyaşı değil bu yüzden trakeal kanül trakea güvenli ve paralel kalmasını 5 toplam 1 ml NS instilasyonları dikkatli olmak için tekrarlayın.
9. histolojik analiz için Adım 5.7 gibi trakea kanüle. 24 saat süre ile 20 cm _H2O% 10 nötr tamponlu formalin ile insufflating akciğerleri sabitleyin.
10. Her akciğer lobu Dikkatli kaldırully hilusta yakın bronşu bölücü ile makas ve forseps kullanarak. önceki parafin içine gömülmüş olan bir histoloji kasetinde her akciğer lobu (5 toplam) yerleştirin. Bir mikrotom ile 5 mikron doku bölümleri kesmek ve hematoksilen ve eozin standart histolojik teknikler kullanarak leke. ⁶ Morfometri da şiddet iltihabı ölçmek için histolojik slaytlar üzerinde yapılabilir. ⁴
11. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleme ile geri kazanılmış BAL işleyin. gelecekteki analiz için 2.0 mL mikrosantrifüj tüpleri içine eşdeğer miktarlarda hücreden bağımsız BAL süpernatantlar kısım. -80 ° C'de saklayın.
12. albümin ELISA ile konsantrasyon, ya da ilgi herhangi bir başka biyolojik ürün için BAL analiz edin. BAL ¹¹ tanelenmiş hücreler sayılır cytoslide numuneleri üretilir, ve akciğerler ölçmek, beyaz kan hücresi farklılaşma sayımı tayini için Wright-Giemsa göre boyası ile boyanmış olabiliriltihabi reaksiyon.

Sonuçlar

Asit aspirasyon pnömonisi murin Modeli Pulmoner Histopatolojisi

Yukarıda açıklanan ve akciğerler, 24 saat sonrası düşük pH hakaret kaldırıldı kesitli ve H & E (Şekil 1) boyandı olarak fareler yaralandı. Nekrotik hücreler, akciğer parankim mimarisi, hücreler ve enkaz hava sahasındaki içinde ve önemli PMN infiltrasyonu kaybı açıkça görülmektedir. klinik aspirasyon benzer şekilde, yam...

Tartışmalar

Amaç yakından asit pnömoni ve sonraki ARDS gelişimi sırasında insanlarda meydana patofizyolojisi benzeyen mide asidi aspirasyon kullanarak ALİ hayvan modeli geliştirmektir. Bir model geliştirirken, biz nedeniyle düşük maliyet, kısa üreme döngüsü ve araştırma araçları (yani, monoklonal antikorlar, transgenik suşlar) bir bolluk ile iyi anlaşılmış bağışıklık sistemine yüksek kapasiteli veri toplama sunan bir hayvan türleri seçti.

ALI insanlar ac?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1 cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5 cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1 x 2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 gauge x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator