La traqueostomía abierta ácido gástrico aspiración modelo murino de lesión pulmonar aguda Resultados en máxima no letal aguda lesión pulmonar

Resumen

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Resumen

neumonitis ácido es una causa importante de lesión pulmonar aguda estéril (ALI) en los seres humanos. neumonitis Acid abarca el espectro clínico de asintomática al síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), caracterizado por alveolitis neutrofílica y lesiones a ambos epitelio alveolar y el endotelio vascular. Clínicamente, el SDRA se define por la aparición aguda de la hipoxemia, infiltrados pulmonares bilaterales en parches y edema pulmonar no cardiogénico. Los estudios en humanos nos han proporcionado información valiosa acerca de los cambios fisiológicos e inflamatorias en los pulmones causados ​​por el SDRA, lo que ha dado lugar a diversas hipótesis acerca de los mecanismos que sirven de fundamento. Desafortunadamente, las dificultades que determinan la etiología del SDRA, así como una amplia gama de fisiopatología han dado lugar a una falta de información crítica que podría ser útil en el desarrollo de estrategias terapéuticas.

modelos animales de traslación son valiosos cuando su patogénesis y fisiopatología reproducci precisiónconcepto ea probado en tanto in vitro como entornos clínicos. Aunque los modelos animales de gran tamaño (por ejemplo, ovejas) comparten características de la anatomía del árbol de tráquea-bronquios humanos, modelos murinos proporcionan una serie de otras ventajas que incluyen: bajo costo; que se presta a corto ciclo reproductivo a una mayor adquisición de datos; un sistema inmunológico bien entendida; y un genoma bien caracterizado que conduce a la disponibilidad de una variedad de supresión de genes y cepas transgénicas. Un modelo robusto de SDRA bajos de pH inducido requiere un murino ALI que se dirige principalmente el epitelio alveolar, en segundo lugar, el endotelio vascular, así como las pequeñas vías aéreas que conduce a los alvéolos. Por otra parte, una lesión reproducible con grandes diferencias entre los diferentes insultos perjudiciales y no perjudiciales es importante.

El modelo de la aspiración de ácido gástrico murino se presenta aquí con ácido clorhídrico emplea una traqueostomía abierta y vuelve a crear un escenario que reproduce el patógeno pneumon bajo pHSIIT lesiones en los seres humanos. Además, este modelo se puede utilizar para examinar la interacción de un insulto bajo pH con otros pulmonares perjudiciales entidades (por ejemplo, partículas de comida, bacterias patógenas).

Introducción

SDRA se caracteriza por la inflamación pulmonar generalizada y se observa clínicamente como dificultad respiratoria aguda con hipoxemia. Estos síntomas a menudo se producen menos de 24 horas después de un evento desencadenante, como traumatismo, sepsis, reacciones relacionadas con la transfusión de sangre o aspiración. Se caracteriza histológicamente por alveolitis neutrofílica (es decir, inflamación generalizada) localizado en el epitelio alveolar y el endotelio vascular que conduce a la pérdida de proteínas y la formación de la membrana hialina posteriormente. La aspiración se clasifica como neumonitis química o la neumonía por aspiración. ¹ El componente ácido de la aspiración gástrica contribuye tanto a la neumonitis y predilección para desarrollar una neumonía bacteriana secundaria. La neumonía por aspiración es uno de los principales factores de riesgo para la LPA y el posterior desarrollo de SDRA. ²

aspiración gástrica es un evento agudo se define como la inhalación de materiales de tque el estómago con o sin flora orofaríngea en las vías respiratorias más allá de las cuerdas vocales. El contenido de aspirado pueden contener fluido bajo pH del estómago, las bacterias, sangre, o partículas de alimentos. la aspiración gástrica se produce a menudo en los pacientes en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI), los cuales son por lo general en un estado de ayuno y, por tanto colocados en un inhibidor de la bomba de protones para limitar la aspiración del contenido gástrico acidificadas. La incidencia de ALI en la población ICU en los EE.UU. es de 2,5 - 5 veces mayor en comparación con la población general de pacientes. ³ Desafortunadamente, estas condiciones que predisponen a menudo conducen a un estado de sobrecrecimiento bacteriano en el estómago que puede dar lugar a secuelas más graves en el pulmón después de un evento aspiración, como la aspiración gástrica es un factor de riesgo independiente para el desarrollo de la neumonía bacteriana secundaria (PAS) , LPA y el SDRA.

la aspiración gástrica tiene dos componentes principales: el ácido clorhídrico y el contenido gástrico, que puede o no puede contener bacteriaso partículas de alimentos. En el modelo de roedor del componente de ácido solo de aspiración gástrica produce una respuesta inflamatoria inicial como resultado de la lesión cáustica directa de bajo pH en el epitelio de las vías respiratorias. Esto es seguido por una infiltración neutrofílica y una respuesta inflamatoria en 4-6 h. ⁴ Estos dos factores en última instancia conducir a la destrucción de la integridad microvascular pulmonar lo que conduce a la extravasación de fluido y proteínas en los alvéolos y las vías respiratorias. Para entender esta fisiopatología y para investigar más a fondo las posibles intervenciones terapéuticas, es importante desarrollar y caracterizar un modelo animal que aclara los mecanismos subyacentes implicados. Un aspirado ácida solo debe ser de gran volumen o con un pH suficientemente bajo como para pasar por alto la capacidad de amortiguación del árbol respiratorio y llegar a los alvéolos. Si esto no ocurre, solamente una, la realización de la lesión superior transitoria de las vías respiratorias se produce, que es menos probable que conduzca a la grave secuelas de SDRA. ^{5 <}/ Sup>

Para emular un evento aspiración con precisión con epitelio alveolar lesionado, es importante para eludir las defensas naturales de un animal. Utilizando un modelo de ratón de aspiración para producir una ALI que imita la lesión de ácido gástrico en los seres humanos, hay que tener en cuenta las diferencias en el árbol tráquea-bronquial. La técnica de traqueotomía abierta que utiliza este método no pasa por las diferencias entre murino y árboles respiratorias humanas y modelos de la lesión en una forma que reproduce ALI tanto fisiológica como histológicamente. Históricamente, la intubación intratraqueal se utilizó para generar ALI, sin embargo se considera difícil de realizar en ratones sin lesión laríngea. Por lo tanto, este método ofrece una alternativa potencial que ha dado resultados consistentes a través de varios investigadores y con la mortalidad atribuida procedimiento de mínima.

Protocolo

Todos los materiales y equipos deben ser recogidos y adecuadamente organizado antes del procedimiento. El procedimiento se lleve a cabo con transiciones de una etapa a la siguiente con el fin de proporcionar datos reproducibles, consistentes. Este protocolo sigue las políticas institucionales establecidas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional en el Centro Médico de Asuntos de Veteranos de Buffalo.
NOTA: ratones C57BL / 6 Tanto hombres como mujeres se utilizaron para este protocolo. No hay ninguna diferencia significativa de la pérdida de albúmina entre sexos.

1. clorhídrico preparación de ácido

1. Hacer HCl 56,2 mM _estéril mediante la adición de 281 l de HCl 1 N a 4,72 ml de solución salina normal estéril (SNS). Valorar a pH 1,25 con HCl 1 N (≈ 0 - 50 l).
2. Hacer esta preparación fresca antes de la lesión. A medida que baja el pH del SNS no es amortiguada que asegura el insulto lesión de ácido clorhídrico es transitorio.

2. La anestesia y la técnica de exposición traqueal

NOTA:Asegúrese de que el procedimiento se lleva a cabo una lesión en una campana de ventilación con filtro de carbón vegetal para la recogida de gases anestésicos. El mantenimiento de condiciones estériles es esencial, ya que se trata de una cirugía de supervivencia. Utilizar guantes estériles y esterilizar todos los instrumentos en una cuenta de vidrio instrumento quirúrgico de esterilización antes de la cirugía en cada animal. Se recomienda el uso de cortinas para aislar la zona quirúrgica para mantener la esterilidad. Utilice isoflurano como gas anestésico, ya que proporciona una solubilidad relativamente baja de gases en sangre lo que permite una rápida inducción de la anestesia, así como la recuperación rápida después de la lesión.

1. Iniciar mediante la inducción de la anestesia en una cámara con 2,75% de isoflurano en oxígeno con velocidad de flujo de 2 L / min.
2. Una vez que el ratón se anestesia adecuada (que no responde a los pies pellizcar lo suficientemente fuerte como para no romper la piel o causar daños en el tejido profundo), suspender el ratón por los incisivos superiores con una longitud de 15 cm de 1-0 sutura de seda trenzada en una posición supina en un 60 ^{placa con} la inclinación de la disección.
3. Asegúrese de que la anestesia se mantiene durante toda la cirugía mediante la entrega de isoflurano a través de un cono de la nariz. Aplique un ungüento veterinaria en el ojo del ratón para evitar la sequedad.
4. Afeitarse la parte ventral del cuello con un condensador de ajuste eléctrico y aplique la solución antiséptico tópico (es decir, povidona yodada). Eliminar el exceso de antiséptico con una gasa y dejar secar (~ 15 - 30 s).
5. Infiltrarse en la línea media del cuello de la horquilla esternal a la parte inferior de la mandíbula con 100 l 0,5% de bupivacaína (para proporcionar analgesia pre, peri y post-operatorio).
6. Hacer de 1 - 1,5 cm de la línea media longitudinal de la incisión en el cuello con un bisturí o tijeras finas curvas. Penetrar la membrana fascial entre las glándulas salivales por disección roma con 2 pinzas dentadas curvadas para exponer la tráquea (identificado por los anillos de cartílago blancas).
7. Aún utilizando los fórceps 2 dentadas, agarre un lado de la musculatura paratraqueal y tire de ella hacia un lado, mientras que la disección entre el musCLE fibras longitudinalmente próximos a la tráquea.
8. Una vez establecida plano de disección, continúe retraer el músculo paratraqueal como el segundo par de pinzas se trabajó bajo la tráquea. Utilice estas pinzas para colocar una hebra 15 cm de 1-0 sutura de seda trenzada en la punta de las pinzas y tire a través de colocar la sutura detrás de la tráquea.

Procedimiento La instilación intratraqueal 3.

1. Preparar la jeringa instilación lesión por llenar una jeringa 0,5 ml unida a una aguja 22 G con 0,2 ml de aire seguido de 3,6 ml / kg de ácido clorhídrico. El aire actuará para ayudar en la dispersión del vehículo, así como una maniobra de reclutamiento alveolar para los alvéolos que pueden haber sido sometidos atelectasia durante la administración de anestesia.
   NOTA: Siga las directrices locales IACUC cuanto a la analgesia postoperatoria y consultar con su veterinario local. Tenga cuidado al usar cualquier analgésicos con propiedades anti-inflamatorias antes de empleoing este modelo de lesión pulmonar estéril.
2. Para la administración de la lesión, deje de primera administración de isoflurano. Deje que la profundidad anestésica del ratón para crecer durante unos 10 - 15 s hasta que comienza a reaccionar a una pizca dedo del pie fórceps.
3. Inmediatamente empezar los pasos de la instilación de la lesión. Si la profundidad de la anestesia es demasiado profundo el animal no respirar espontáneamente después de la instilación lesión, que es especialmente cierto para las lesiones que contienen ácido clorhídrico.
4. Tiene un asistente exprimir la caja torácica para expulsar la capacidad vital.
5. Utilice la sutura de seda trenzada 1-0 colocada previamente alrededor de la tráquea para proporcionar la tracción tirando de ella en sentido superior y luego insertar la aguja de la jeringa en la tráquea entre el 1 ^y 2 ^de los anillos cartilaginosos por debajo de la laringe. El bisel de la aguja debe mirar hacia el cirujano y el avance hasta el bisel es un poco más allá de la tráquea con la aguja como en paralelo con la tráquea como sea posible.
6. Soltar el pecho justo antes de la administración en bolo deácido clorhídrico con el fin de asegurar la dispersión y deposición en la vía aérea distal y alvéolos. Depositar el bolo en aproximadamente 0,5 - 0,75 s. Mantener la aguja en la tráquea hasta que se toma la primera respiración espontánea para asegurar que todo el volumen del bolo lesión es inhalado en los pulmones.
7. Cerrar la incisión ya sea utilizando 1 - 2 grapas o suturas de la piel.

4. recuperación

1. Usando una jeringa de 5 ml con una aguja de 26 G, inyectar 1 ml por vía subcutánea en el SNS piel del cuello para la reanimación con líquidos. A pesar de que hay una pérdida de líquido mínima durante el procedimiento, después de la cirugía el ratón tiende a no beber y potencialmente puede deshidratar. Alternativamente, proporcionar SNS a través de una inyección intraperitoneal.
2. Coloque el ratón en la cámara climatizada a 37 ° C a perfusión con 100% de _O2. Asegúrese de que el ratón se recupera adecuadamente antes de ser colocado de nuevo en la vivienda. Observar a los animales y no dejar sin vigilancia durante este tiempo hasta ambulatoria y totalmente recovered.

5. Lavado broncoalveolar y Procesamiento de pulmón

1. Inducir y mantener la anestesia con isoflurano como se describe en el paso 2.1 y Paso 2.2. Confirmar plano de anestesia adecuado, utilizando el método del dedo del pie sujetador descrito en el paso 2.2.
2. Asegure en posición supina sobre una tabla de disección y utilizar un bucle de 1-0 sutura de seda trenzada enganchado en los incisivos superiores para extender el cuello. Aplique un ungüento veterinaria en los ojos para evitar la sequedad.
3. Después de quitar las grapas de piel del cuello, hacer una incisión longitudinal en la línea media a través de la piel de la pared abdominal inferior a través de la incisión en el cuello anterior de la mandíbula con unas tijeras.
4. Hacer una incisión en la línea media en la musculatura peritoneal con unas tijeras y retraer los órganos abdominales con esponjas para exponer el espacio retroperitoneal. Si se necesita la sangre, recoger de la aorta abdominal o vena cava inferior en este punto.
5. La eutanasia a los animales a través de desangramiento por transección del abdominal aorta y la vena cava inferior. Mediante la utilización de una toracotomía bilateral en el siguiente paso se completará un método de confirmación secundaria de la eutanasia humanitariamente según lo establecido por las directrices del IACUC.
6. Perforar el diafragma para causar el colapso pulmonar. Luego, utilizando hueso tijeras de corte, cortar el diafragma y cortar a través de la jaula paralelo a la costilla y en ambos lados del esternón. Use una pinza hemostática de bloqueo para retraer el colgajo esternal para facilitar la inyección de 5 (37 ° C) solución salina tibia ml equilibrada de Hank con calcio y magnesio en el ventrículo derecho para eliminar la vasculatura pulmonar.
   1. Como se obtiene la sangre de la aorta para evaluar los niveles de citoquinas periféricas antes del procedimiento descrito en este documento, hacer una pequeña incisión en el ventrículo izquierdo para ofrecer un flujo de salida necesario para que la sangre deje la circulación a ras adecuada la vasculatura pulmonar si no es la obtención de la sangre .
7. Apuntalar la junta disección de inclinación de 60 ° y el uso de THprocedimiento E descrito en el paso 2.2 para facilitar la inserción de un 20 G x ½ "cánula de acero inoxidable en la tráquea y seguro con una sutura 1-0.
8. Coloque la placa de disección horizontal y realizar un lavado broncoalveolar (LBA).
   1. Para llevar a cabo el BAL adjuntar dos jeringas de 5 ml de una llave de paso de 3 vías. Llene una jeringa con 5 ml de SNS y el tornillo en el puerto de la llave de paso. Adjuntar un vacío jeringa de 5 ml a un puerto de ^2ª y, finalmente, coloca puerto abierto de la llave de paso de la cánula endotraqueal colocado en el paso 5.6. Inculcar 1 ml de NS en los pulmones y el lavado con segunda jeringa.
   2. Repetir para 5 un total de 1 ml de NS instilaciones teniendo cuidado de que la cánula traqueal se mantiene segura y paralela a la tráquea de modo que no se rompa la tráquea.
9. Para el análisis histológico, canular la tráquea como en el paso 5.7. Fijar los pulmones mediante la insuflación con 10% de formalina tamponada neutra al 20 cm H ₂ O durante 24 h.
10. Retire cada lóbulo pulmonar Carefully usando tijeras y pinzas por transección bronquios cerca del hilio. Coloque cada lóbulo pulmonar (5 en total) en un casete de histología antes de ser incluidos en parafina. Cortar 5 micras secciones de tejido con un micrótomo, y se tiñen con hematoxilina y eosina usando técnicas histológicas estándar. Morfometría ⁶ también se pueden realizar en los cortes histológicos para cuantificar la gravedad de la inflamación. ⁴
11. Procesar la BAL recuperado por centrifugación a 1.500 xg durante 3 min a 4 ° C. Alícuota de los sobrenadantes libres de células BAL en cantidades equivalentes a 2,0 ml tubos de microcentrífuga para futuros análisis. Almacenar a -80 ° C.
12. Analizar el BAL para la concentración de la albúmina por ELISA, o cualquier otro producto biológico de interés. ¹¹ Las células sedimentadas desde el BAL se pueden contar, especímenes cytoslide generados, y se tiñeron con colorante a base de Wright-Giemsa para la determinación de sangre diferencial de células de glóbulos blancos para evaluar los pulmonesreacción inflamatoria.

Resultados

La histopatología pulmonar del modelo murino de la aspiración de ácido neumonitis

Los ratones fueron heridas como se describió anteriormente y los pulmones se retiraron 24 h después de pH bajo insulto, seccionadas y teñidas con H & E (Figura 1). Las células necróticas, se observan claramente la pérdida de la arquitectura del parénquima pulmonar, las células y los residuos dentro de los espacios aé...

Discusión

El objetivo era desarrollar un modelo animal ALI usando la aspiración de ácido gástrico que se parece mucho a la fisiopatología que se produce en los seres humanos durante el desarrollo de neumonitis ácido y el SDRA posteriores. En el desarrollo de un modelo, se optó por una especie animal que ofrece alta de adquisición de datos de rendimiento debido a su bajo coste, ciclo reproductivo corto, y un sistema inmunológico bien entendida con una gran cantidad de herramientas de investigación (es decir,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1x2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 ga x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator