להרחיב הנשמת קיבת חומצה שאיפת Murine הדגם של פגיעה החריפה ריאות תוצאות ב מקסימלי חריפה קטלנית פגיעת ריאות

Summary

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Abstract

דלקת ריאות חומצה הוא גורם עיקרי של פגיעת ריאות החריפה סטרילי (ALI) בבני אדם. דלקת ריאות חומצה משתרעת על פני הספקטרום הקליני מן אסימפטומטית לתסמונת מצוקה נשימתית חריפה (ARDS), מאופיינת alveolitis neutrophilic ופציעה הוא האפיתל מכתשיים ו האנדותל של כלי דם. מבחינה קלינית, ARDS מוגדר על ידי התפרצות חריפה של היפוקסמיה, מחלחל ריאתי הבילטרליים בלתי סדיר ובצקת ריאות שאינם קרדיוגני. מחקרים בבני אדם ספקו לנו מידע רב ערך על השינויים הפיסיולוגיים דלקתיים הריאות הנגרמים על ידי ARDS, אשר הוביל להשערות שונות על המנגנונים הזוטרים. למרבה הצער, הקשיים בקביעת האטיולוגיה של ARDS, כמו גם מגוון רחב של פתופיזיולוגיה גרמו חוסר מידע קריטי שיכול להיות שימושי בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

במודלים של בעלי חיים Translational הם בעלי ערך כאשר בפתוגנזה והפתופיזיולוגיה שלהם במדויק ברפרודוקציהמושג ea מוכח הן במבחנה במסגרות קליניות. למרות במודלים של בעלי חיים גדולים (למשל, כבשים) מאפיינים חלקים של האנטומיה של עץ קנה נשימה-סימפונות אדם, מודלים בעכברים לספק שורה של יתרונות נוספים כולל: עלות נמוכה; הלוואות מחזור קצרות רבייה עצם רכישת נתונים גדולה; מערכת אימונולוגית מובנת היטב; ו גנום מאופיין היטב שמוביל את הזמינות של מגוון רחב של מחיקת גני זנים מהונדסים. מודל חזק של ARDS מושרה pH הנמוך דורש murine ALI שמכוון בעיקר האפיתל מכתשיים, ושנית האנדותל של כלי הדם, כמו גם את דרכי הנשימה הקטנה מוביל אל alveoli. יתר על כן, פגיעה לשחזור עם הבדלים רחבים בין עלבונות פוגעניים ובלתי מזיקים אחרים חשובה.

מודל שאיפת murine קיבת החומצה שהוצג כאן על ידי שימוש חומצה הידרוכלורית מעסיק הנשמה פתוחה משחזר תרחיש פתוגניים שמעתיק את pneumon pH הנמוךפציעת itis בבני אדם. בנוסף, מודל זה יכול לשמש כדי לבחון אינטראקציה של עלבון pH נמוך עם גופים מזיקים ריאה אחרים (למשל, חלקיקי מזון, חיידקים פתוגניים).

Introduction

ARDS מאופיינת בדלקת ריאות נרחבת נתפסת קלינית כמו קוצר נשימה חריף עם היפוקסמיה. תסמינים אלה מתרחשים לעתים קרובות פחות מ -24 שעות לאחר אירוע הסתה כגון טראומה, אלח דם, תגובות הקשורות עירוי דם או שאיפה. הוא מאופיין histopathologically ידי alveolitis neutrophilic (כלומר, דלקת נפוצה) מקומי כדי האפיתל מכתשיים ו האנדותל של כלי הדם המובילים אל דליפה חלבון ובהמשך היווצרות קרום hyaline. שאיפה מסווג דלקת ריאות כימית או דלקת ריאות שאיפה. ¹ המרכיב החומצית של הקיבה השאיפה תורמת הן דלקת ריאות ו נטייה לפתח דלקת ריאות חיידקית משנית. דלקת ריאות שאיפה היא אחד מגורמי הסיכון המובילים עבור ALI והפיתוח הבא של ARDS. ²

שאיפת קיבה היא אירוע חמור המוגדר שאיפה של חומרי tהיה בו העוז עם או בלי צמחייה הלוע התחתון לתוך דרכי הנשימה מעבר מיתרי הקול. התכנים לשאוב עשויים להכיל נוזל קיבת pH נמוך, חיידקים, דם, או חלקיקי מזון. השאיפה קיבה מתרחש לעיתים קרובות בחולים ביחידה לטיפול נמרץ (ICU), שאותו הם בדרך כלל במצב צום ובכך להציב על מעכבי משאבות פרוטונים להגביל שאיפת תוכן קיבה acidified. ההיארעות של עלי באוכלוסיית הטיפול הנמרץ בארה"ב היא 2.5 - 5 פעמים גבוהה יותר בהשוואה לאוכלוסייה הכללית החולה. ³ לרוע מזל, תנאי החושף אלה לעתים קרובות להוביל למצב של יתר חיידקים בבטן שעלולה להוביל סיבוכים חמורים יותר הבריא לאחר אירוע שאיפה, כמו שאיפת קיבה הוא גורם סיכון בלתי תלוי להתפתחות של דלקת ריאות חיידקית משניות (SBP) , עלי ARDS.

יש שאיפת קיבה שני מרכיבים עיקריים: חומצה הידרוכלורית תוכן קיבה, אשר עשוי או לא עשוי להכיל חיידקיםאו חלקיקי מזון. במודל מכרסם רכיב החומצה לבד שאיפת קיבה מייצר תגובה דלקתית ראשונית כתוצאה של פגיעת קאוסטית הישירה של pH הנמוך על אפיתל דרכי נשימה. זה ואחריו חדירת neutrophilic ו תגובה דלקתית ב 4 - 6 שעות. ⁴ שני גורמים אלה שבסופו של דבר להוביל להרס של שלמות כלי הדם הריאתי ובכך מובילה extravasation של נוזל וחלבונים לתוך alveoli ובדרכי הנשימה. כדי להבין פתופיזיולוגיה זה וכדי להמשיך לחקור התערבויות טיפוליות אפשריות, חשוב לפתח ולאפיין במודל חיה כי מבהיר את המנגנונים המעורבים. לשאוב חומצי לבד חייב להיות משופע או עם pH נמוך מספיק כדי לעקוף את קיבולת חציצה של עץ הנשימה ולהגיע alveoli. אם זה לא קורה, רק פציעת איירווייז חולפת עליונה, ניצוח מתרחשת שהוא פחות צפוי להוביל מהתוצאות החמורות של ARDS. ^{5 <}/ Sup>

כדי לחקות אירוע השאיפה במדויק עם האפיתל מכתשיים פצוע, חשוב לצורך עקיפת ההגנות הטבעיות של החיה. באמצעות מודל שאיפה בעכבר כדי לייצר ALI המחקה את פגיעת חומצת הקיבה אצל בני אדם, אחד חייב להסביר את ההבדלים בעץ קנה נשימה-סימפונות. טכניקת ההנשמה הפתוחה כי שיטה זו מנצלת עוקפת את ההבדלים בין murine ועצי נשימה של אדם ומודלים הפגיעים באופן שמעתיק עליי מבחינה פיזיולוגית ו היסטולוגית. מבחינה היסטורית, אינטובציה intratracheal היה השתמשו כדי ליצור עלי, אולם היא נחשבת קשה לבצע בעכברים ללא פציעה בגרון. לכן, שיטה זו מציעה חלופה פוטנציאלית כי ניב תוצאות עקביות על פני חוקרים רבים המקיימים תמותה מיוחסת הליך מינימאלי.

Protocol

כל החומרים והציוד צריכים שיסדרו אותם כראוי לפני ההליך. הליך זה להתנהל עם מעברים חלקים משלב אחד למשנהו על מנת לספק נתונים עקביים, לשחזור. פרוטוקול זה כדלקמן מדיניות מוסדית שקבעה ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש במרכז הרפואי לענייני יוצאי צבא באפלו.
הערה: גם זכר וגם נקבה C57BL / 6 עכברים שימשו פרוטוקול זה. אין הבדל משמעותי של דליפת אלבומין בין המינים.

1. הידרוכלורית הכנת חומצה

1. הפוך 56.2 מ"מ HCl _סטרילי על ידי הוספת 281 μL של 1 N HCl כדי 4.72 מלח רגיל סטרילי מ"ל (SNS). לכיל ל -1.25 pH עם 1 N HCl (≈ 0 - 50 μL).
2. הפוך בתכשיר טרי לפני הפציעה. כפי נמוך pH SNS לא שנאגר היא מבטיחה את העלבון הידרוכלורית חומצת פציעה הוא חולף.

2. הרדמה טכניקה חשיפה קנה הנשימה

הערה:ודא כי נוהל הפציעה מתנהל במנדף עם סינון פחם עבור הדחת גז הרדמה. תחזוקה בתנאי סטריליים חיונית כמו זה הוא ניתוח הישרדות. יש להשתמש בכפפות סטריליות לעקר את כל המכשירים מעקרים מכשיר כירורגי חרוז זכוכית לפני ניתוח על כל חיה. השימוש וילונות לבודד את האתר כירורגית מומלץ לשמור על סטריליות. השתמש isoflurane כגז ההרדמה כפי שהוא מספק מסיסות גז דם נמוכה יחסית המאפשר אינדוקציה מהירה של הרדמה, כמו גם התאוששות מהירה בעקבות הפציעה.

1. התחל על ידי גרימת הרדמה בתא עם 2.75% isoflurane חמצן עם קצב הזרימה של 2 ליטר / דקה.
2. לאחר העכבר הוא הרדים כראוי (מגיב הבוהן צביטה חזקה מספיק כדי לא לשבור את העור או לגרום נזק לרקמות עמוקות), להשעות את העכבר על ידי החותכות מעולה עם אורך 15 ס"מ של 1-0 תפר משי קלוע בעמדה פרקדן על 60 ^o קרש חיתוך בשיפוע.
3. ודא הרדמה כי נשמרה לאורך ניתוח על ידי מתן isoflurane באמצעות חרטומו. החל משחת וטרינרים על העין של העכבר כדי למנוע יובש.
4. לגלח את החלק הגחוני של הצוואר עם גוזם חשמלי וליישם פתרון חיטוי מקומי (כלומר, povidone יוד). הסר חיטוי עודף עם גזה ולתת להתייבש (~ -15 - 30 שניות).
5. לחדור את קו האמצע של הצוואר מן החריץ sternal לחלק נח של לסת עם 100 μL 0.5% bupivacaine (כדי לספק שיכוך כאבים טרום, peri-, ואת שלאחר ניתוח).
6. הפוך 1 - חתך קו אמצע אורך 1.5 סנטימטרים בצוואר עם אזמל או מספריים בסדר מעוקלים. לחדור את קרום fascial בין בלוטות רוק על ידי דיסקציה הקהה עם 2 מלקחיים משוננים מעוקלים לחשוף את קנה הנשימה (שזוהתה על ידי טבעות הסחוס הלבנות).
7. זאת באמצעות 2 מלקחיים משוננים, לתפוס צד אחד של השרירים paratracheal ולמשוך אותו לצד תוך ביתור בין musסיבי CLE longitudinally ליד קנה הנשימה.
8. כאשר מטוס לנתיחה מוקם, להמשיך חוזר בה שריר paratracheal כמו הזוג השני של מלקחיים הוא עבד תחת קנה הנשימה. שימוש במלקחיים אלה להציב גדיל 15 סנטימטר של 1-0 תפר משי קלוע לתוך קצה המלקחיים ולמשוך דרך למקם את התפר מאחורי קנה הנשימה.

3. Intra-קנה הנשימה נוהל החדרה

1. הכן את המזרק החדרה פציעה ידי מילוי מזרק 0.5 מ"ל מצורף מחט 22 G עם 0.2 מ"ל של אוויר ואחריו 3.6 מ"ל / ק"ג של חומצה הידרוכלורית. האוויר יפעל כדי לסייע פיזור של הרכב, כמו גם תמרון גיוס המכתשית עבור alveoli אלה שעשויים עברו תמט ריאות במהלך מתן הרדמה.
   הערה: פעל לפי ההנחיות המקומיות IACUC לגבי שיכוך כאבים שלאחר הניתוח ולהתייעץ עם הווטרינר המקומי שלך. תיזהר על שימוש במשככי כאבים כל עם תכונות אנטי דלקתיות לפני להעסיקing מודל זה של פציעה ריאות סטרילי.
2. על מנת לנהל את הפגיעה, ראשון להפסיק ממשל isoflurane. אפשר עומק ההרדמה של העכבר כדי לעלות כ 10 - 15 s עד שהוא מתחיל להגיב קמצוץ בוהן מלקחיים.
3. מייד להתחיל צעדי החדרה של פציעה. אם עומק הרדמה הוא עמוק מדי החיה לא לנשום באופן ספונטני לאחר החדרת פציעה, וזה נכון במיוחד עבור פציעות המכילות חומצה הידרוכלורית.
4. יש עוזר לסחוט את בית החזה כדי לגרש יכולת חיונית.
5. השתמש תפר 1-0 קלוע משי להציב בעבר סביב קנה הנשימה כדי לספק כוח משיכה על ידי משיכתו superiorly ולאחר מכן הכנס מחט מזרק לתוך קנה הנשימה בין ^-1 ו -2 ^nd טבעות סחוסי מתחת הגרון. שפוע המחט צריכה להתמודד עם המנתח ולהתקדם עד שפוע בעבר רק את קנה הנשימה עם המחט כמקביל עם קנה הנשימה ככל האפשר.
6. שחרר את החזה רק לפני מתן בולוס שלחומצה הידרוכלורית על מנת להבטיח פיזור בתצהיר לתוך דרכי הנשימה ואת alveoli דיסטלי. להפקיד את בולוס ב בערך 0.5 - 0.75 s. שמור את המחט בתוך קנה הנשימה עד הנשימה הספונטנית הראשונה נלקחת על מנת להבטיח כי היקף בולוס פציעה כולו בשאיפה לריאות.
7. חתך סגור באף 1 - 2 סיכות עור או תפרים.

שחזור 4.

1. באמצעות מזרק 5 מ"ל עם מחט 26 G, להזריק 1 מ"ל SNS מתחת לעור לתוך בעורף החייאה נוזל. למרות שיש איבוד נוזלים מינימאלי במהלך הליך, לאחר ניתוח העכבר נוטה לא לשתות יכול לייבש פוטנציאלי. לחלופין, לספק SNS באמצעות זריקה intraperitoneal.
2. מקום עכבר בתא מחומם על 37 מעלות צלזיוס perfused עם 100% O _2. ודא כי העכבר הוא התאושש כראוי לפני שיוצב בחזרה לתוך דיור. צג חיות לא להשאיר ללא השגחה במהלך הזמן הזה עד r אמבולטורי מלאecovered.

5. שטיפה ברונכואלוואולרית ועיבוד ריאות

1. להשרות ולשמור הרדמה isoflurane כמתואר שלב 2.1 ו שלב 2.2. אשר מטוס נאות הרדמה בשיטת קמצוץ בוהן מתוארת בשלב 2.2.
2. Secure במצב שכיבה על לוח לנתח ולהשתמש לולאה של 1-0 תפר משי קלוע מכור על החותכות המעולות להאריך את הצוואר. החל משחת וטרינרים על עיניים כדי למנוע יובש.
3. לאחר הסרת סיכות עור הצוואר, לעשות חתך אורכי קו אמצע דרך העור מקיר הבטן התחתון דרך החתך בצוואר הקודם אל הלסת התחתונה עם מספריים.
4. ביצוע חתך קו האמצע של שרירי הבטן עם מספריים לחזור בו אברי הבטן עם ספוגים לחשוף את החלל retroperitoneal. אם דם יש צורך, לגבות את אב העורקים בבטן או וריד נבוב נח בשלב זה.
5. להרדימו באמצעות exsanguination ידי חוצים את abdomאב עורקי Inal ואת וריד נבוב נח. על ידי ניצול פתיחת בית חזה בין שתי מדינות בשלב הבא שיטת מאשרות משנית של המתת חסד תושלם הומנית ככל שנקבעה על ידי הנחיות IACUC.
6. לחורר את הסרעפת לגרום להתמוטטות הריאה. לאחר מכן, באמצעות עצם חיתוך מספריים, לחתוך את הסרעפת, ביקע את ההקבלה כלוב הצלעות ומשני הצדדים של עצם החזה. השתמש hemostat נעילה לחזור בהם דש sternal כדי להקל הזרקת 5 מ"ל חם (37 מעלות צלזיוס) תמיסת מלח מאוזן של האנק עם סידן ומגנזיום לתוך החדר הימני כדי לשטוף את כלי הדם ריאות.
   1. כמו דם מאבי העורקים מתקבל להעריך רמות ציטוקינים היקפיות לפני ההליך המתואר במאמר זה, לעשות חתך קטן בחדר השמאלי לספק יצוא הכרחי דם לעזוב את זרימת הדם סומקת הולם בכלי דם הריאות אם לא קבלת דם .
7. אביזר קרש החיתוך כדי בשיפוע 60 מעלות ולהשתמש ההליך דואר מתואר בשלב 2.2 כדי להקל החדרת 20 G x ½ "צינורית נירוסטה בתוך קנה הנשימה ומאובטחת עם תפר 1-0.
8. מניח את קרש החיתוך אופקי ולבצע שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL).
   1. כדי לבצע את BAL לצרף שני 5 מזרקי מיליליטר שסתום 3 כיוונים. מלאו מזרק אחד עם 5 מ"ל של SNS בורג לתוך נמל ברזלים. צרף מזרק 5 מ"ל ריק ליציאת 2 ^nd ולבסוף לצרף הנמל פתוח של ברזלים כדי צינורית לקנה הנשימה התוך להציב שלב 5.6. להנחיל 1 מיליליטר של NS לתוך ריאות שטיפה עם מזרק שני.
   2. חזור עבור 5 instillations הכולל 1 מ"ל NS נזהר כי צינורית לקנה הנשימה נשאר מאובטח ובמקביל קנה הנשימה, כך שהוא לא לקרוע את קנה הנשימה.
9. לניתוח היסטולוגית, cannulate את קנה הנשימה כמו בשלב 5.7. תקן את הריאות ידי insufflating עם 10% פורמלין נייטרלי שנאגרו על 20 ס"מ H ₂ O למשך 24 שעות.
10. הסר כל caref אונת ריאהully באמצעות מספריים מלקחיים על ידי חוצים הסמפונות ליד hilum. מניח כל אונת ריאות (5 סה"כ) קלטת היסטולוגיה בטרם מוטבע פרפין. חותכים 5 מיקרומטר סעיפים רקמה עם microtome, ואת הכתם עם hematoxylin ו eosin באמצעות טכניקות סטנדרטיות היסטולוגית. ⁶ Morphometrics יכול להתבצע גם בשקופיות היסטולוגית לכמת את דלקת החומרה. ⁴
11. לעבד את BAL התאושש על ידי צנטריפוגה ב 1500 XG 3 דקות ב 4 ° C. Aliquot את supernatants BAL ללא תאים בכמויות שוות ערך לתוך צינורות microcentrifuge 2.0 מ"ל לצורך ניתוח עתידי. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
12. נתח את BAL ריכוז אלבומין ידי ELISA, או כל מוצר ביולוגי אחר בעלי עניין. ¹¹ תאי pelleted מן BAL ניתן לספור, דגימות cytoslide שנוצרו, ומוכתם עם רייט Giemsa מבוסס כתם לקביעת ספירת הפרש תא דם לבנים כדי להעריך את הריאות "תגובה דלקתית.

תוצאות

Histopathology ריאתי של דגם Murine של חומצה שאיפה דלקת ריאות

עכברים נפצעו כמתואר לעיל וריאות הוסרו 24 עלבון pH נמוך שעות שלאחר, מחולקות ו- H & E מוכתמת (איור 1). תאים נמקי, אובדן אדריכלות parenchymal ריאות, ...

Discussion

המטרה הייתה לפתח מודל חיה עליי באמצעות שאיפת חומצת קיבה דומה בפתופיזיולוגיה המתרחשת אצל בני אדם במהלך ההתפתחות של דלקת ריאות חומצת ARDS שלאחר מכן. בפיתוח מודל, בחרנו מיני בעלי חיים המציע רכישת נתוני תפוקה גבוהה בשל העלות הנמוכה שלה, מחזור רבייה קצר, ומערכת חיסונית ה...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1x2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 ga x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator