Открыть Трахеостомия Желудочный кислота Аспирация мышиной модели острого повреждения легких Результаты в Максимальный Острый несмертельного повреждения легких

Резюме

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Аннотация

Кислота пневмонит является основной причиной стерильного острого повреждения легких (ALI) в организме человека. Кислота пневмонит охватывает клинический спектр от бессимптомных до острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), характеризуется нейтрофильным альвеолит, и причинение вреда как альвеолярного эпителия и эндотелия сосудов. Клинически, РДСВ определяется острым началом гипоксемии, двусторонние неоднородными легочные инфильтраты и не-кардиогенного отека легких. Человеческие исследования предоставили нам ценную информацию о физиологических и воспалительных изменений в легких, вызванных РДСВ, что привело к различным гипотезам о механизмах, лежащих в основе. К сожалению, трудности, определяющие этиологию РДСВ, а также широкий спектр патофизиологии, привели к отсутствию критической информации, которая может оказаться полезной при разработке терапевтических стратегий.

Трансляционные модели на животных являются ценными, когда их патогенеза и патофизиологии точно reproducеа концепция доказана как в пробирке и клинических условиях. Хотя больших животных моделях (например, овцы) доля характеристики анатомии человека трахеи-бронхиального дерева, мышиные модели обеспечивают множество других преимуществ , в том числе: низкая стоимость; короткий кредитование репродуктивный цикл себя более сбора данных; хорошо понимать иммунологическая система; и хорошо охарактеризован геном что привело к появлению разнообразных делеции генов и трансгенных линий. Надежная модель низких рН РДСВ индуцированного требует мышиного ALI, что цели в основном альвеолярный эпителий, во вторую очередь эндотелия сосудов, а также малые дыхательные пути, ведущие к альвеол. Кроме того, воспроизводимые травмы с широкими различиями между различными вредными и безвредных оскорбления важно.

Мышиный аспирация модель желудочной кислоты, представленные здесь с помощью соляной кислоты используют открытую трахеотомию и воссоздает патогенную сценарий, который воспроизводит низкий рН pneumonИТИС травмы у людей. Кроме того, эта модель может быть использована для изучения взаимодействия низкого рН инсульта с другими легочными вредными объектами (например, частицы пищи, патогенные бактерии).

Введение

ОРДС характеризуется широко распространенным воспалением легких и клинически рассматривается как острая одышка с гипоксией. Эти симптомы часто происходят менее чем через 24 ч после провоцирующего события, такие как травма, сепсис, реакций, связанных с переливания крови или аспирации. Она характеризуется гистологически по нейтрофильного альвеолита (т.е. широко распространенное воспаление) , локализуется альвеолярного эпителия и сосудистого эндотелия , приводящей к утечке белка и образованию впоследствии гиалиновых мембран. Стремления классифицируется как химический пневмонит или аспирационной пневмонии. ¹ Кислотный компонент аспирации желудочного способствует как пневмонит и пристрастием к разработке вторичной бактериальной пневмонии. Аспирационная пневмония является одним из ведущих факторов риска развития ОПЛ и последующего развития ОРДС. ²

Желудочный аспирация острое событие определяется как ингаляции материалов из тон переваривает с или без ротоглотки флоры в дыхательные пути за пределы голосовых связок. Содержание аспирата может содержать низкую жидкость рН желудка, бактерии, кровь, или частицы пищи. Желудочный стремление часто возникает у пациентов в отделении интенсивной терапии (ОИТ), которых обычно находятся в состоянии голодания и, таким образом, помещают на ингибитор протонного насоса, чтобы ограничить стремление подкисленной желудочного содержимого. Заболеваемость ALI в популяции ОРИТ в США составляет 2,5 - 5 раз выше по сравнению с общей популяции пациентов. ³ К сожалению, эти предрасполагающие условия часто приводят к состоянию избыточного бактериального роста в желудке , что может привести к более тяжелым последствиям в легком следующем событии аспирации, как желудочная аспирация является независимым фактором риска для развития вторичной бактериальной пневмонии (СБП) , ALI и ОРДС.

Желудочный стремление имеет два основных компонента: соляной кислоты и желудочного содержимого, которые могут содержать или не содержать бактерииили продукты питания в виде частиц. В модели с грызунами в одиночку желудочного аспирации кислотный компонент производит первоначальную воспалительную реакцию в результате прямого едкого травмы низкого рН на эпителии дыхательных путей. Это сопровождается нейтрофильным инфильтрации и воспалительной реакции на 4 - 6 ч. ⁴ Эти два фактора , в конечном счете привести к разрушению целостности легочной микрососудистой что приводит к транссудации жидкости и белков в альвеолы и дыхательные пути. Чтобы понять это патофизиологии и для дальнейшего изучения возможных терапевтических вмешательств, важно разработать и охарактеризовать модель животных, которая проясняет основные механизмы, вовлеченные. в одиночку кислая аспирата должна быть объемными или с достаточно низким рН, чтобы обойти буферную емкость дыхательного дерева и достигают альвеол. Если этого не происходит, только переходная верхняя, проведение травмы дыхательных путей происходит что менее вероятно, приведет к тяжелым последствиям РДСВ. ^{5 <}/ SUP>

Для того, чтобы точно с травмированной альвеолярного эпителия эмулировать событие аспирации, важно, чтобы обойти естественную защиту животного. Использование модели мыши аспирации, чтобы произвести ALI, который имитирует травму желудочной кислоты, наблюдаемых у людей, необходимо учитывать различия в трахее-бронхиального дерева. Открытая технология трахеостомические, которая использует этот метод обходит различия между мышиными и респираторные деревьев человека и модели травмы в манере, воспроизводящей ALI как физиологически, так и гистологически. Исторически сложилось так, трахею интубации был использован для генерации ALI, однако считается, трудно выполнить в мышах без ларингеальной травмы. Таким образом, этот метод предлагает потенциальную альтернативу, которая дала последовательные результаты по нескольким исследователям и с минимальными процедуры приписываемой смертности.

протокол

Все материалы и оборудование должны быть собраны и надлежащим образом организована до процедуры. Процедура должна проводиться с плавными переходами от одного шага к другому, с тем, чтобы обеспечить последовательное и воспроизводимые данные. Этот протокол следует институциональной политики, установленные по уходу и использованию комитета Institutional животных путем в медицинском центре Буффало по делам ветеранов.
Примечание: мужские и женские C57BL / 6 мышей использовали для этого протокола. Там нет никакой существенной разницы утечки альбумина между мужчинами и женщинами.

1. Получение Соляная кислота

1. Сделать 56,2 мМ HCl , _{стерильный} добавлением 281 мкл 1 N HCl до 4,72 мл стерильного физиологического раствора (SNS). Титрование до рН 1,25 с помощью 1 н HCl (≈ 0 - 50 мкл).
2. Сделайте этот препарат свежим до травмы. Как низкий рН SNS не буферизуется обеспечивает соляной кислоты травмы обида преходяще.

2. Обезболивание и трахеи экспозиции Техника

ЗАМЕТКА:Убедитесь в том, что процедура травмы проводится в вытяжном шкафу с углем для фильтрации анестезирующего газа продувки. Поддержание стерильных условий имеет важное значение, поскольку это хирургическое вмешательство на выживание. Используйте стерильные перчатки и стерилизовать все инструменты в стеклянных шариков хирургического инструмента стерилизатор до операции на каждом животном. Использование шторами, чтобы изолировать хирургический сайт рекомендуется для поддержания стерильности. Используйте изофлуран в качестве анестезирующего газа, поскольку она обеспечивает относительно низкую растворимость газа в крови, позволяя быструю индукцию анестезии, а также быстрое восстановления после травмы.

1. Начало путем индукции анестезии в камере с 2,75% изофлуран в кислороде с расходом 2 л / мин.
2. После того, как мышь адекватно наркозом (не реагирует на пальце ноги зажать достаточно сильным, чтобы не разорвать кожу или привести к повреждению глубоких тканей), приостанавливать мышь превосходящими резцами с длиной менее 15 см от 1-0 плетеной шелковой нити в положении лежа на спине на 60 ^о рассечение угла наклона доски.
3. Убедитесь в том, что анестезия сохраняется в течение операции, предоставляя изофлуран через носовой конус. Нанесите мазь на ветеринарную глаза мыши, чтобы предотвратить сухость кожи.
4. Бритье вентральной части шеи с электрическим триммером и применять местное антисептическим раствором (например, повидон-йод). Удалите излишки антисептик с марлей и дайте высохнуть (~ 15 - 30 сек).
5. Проникнуть средней линии шеи от яремной вырезки до нижней части челюсти с 100 мкл 0,5% бупивакаина (для обеспечения пре-, пери- и послеоперационное обезболивание).
6. Сделать 1 - 1,5 см продольный срединный разрез в области шеи с помощью скальпеля или изогнутых тонких ножниц. Проникнуть фасциальное мембрану между слюнных желез тупым с 2-мя изогнутыми зубчатыми щипцами подвергать трахеи (обозначаемого белых хрящевых колец).
7. Тем не менее, используя 2 зубчатыми щипцами, возьмитесь одной из сторон паратрахеальной мускулатурой и потяните ее в сторону при рассечения между MusНКУ волокна в продольном направлении рядом с трахеи.
8. После того, как рассечение плоскость устанавливается, продолжают втягивания паратрахеальную мышцы, как вторая пара щипцов работала под трахеи. С помощью этих щипцов, чтобы разместить 15 см прядь 1-0 плетеной шелковой нити в кончик пинцетом и протащить, чтобы поместить шов позади трахеи.

3. Intra-трахеи Процедура закапывания

1. Подготовьте травмы закапывания шприц путем заполнения 0,5 мл шприц, присоединенный к 22 G иглу с 0,2 мл воздуха с последующим 3,6 мл / кг хлористо-водородной кислоты. Воздух будет действовать, чтобы помочь в дисперсии транспортного средства, а также альвеолярный набора маневра для тех альвеол, которые, возможно, претерпевших ателектаз при анестезии введения.
   Примечание: Следуйте местным рекомендациям IACUC относительно послеоперационную анальгезию и проконсультироваться с вашим местным ветеринаром. Будьте осторожны при использовании каких-либо анальгетики с противовоспалительными свойствами перед службеИНГ эту модель стерильного повреждения легких.
2. Для того, чтобы управлять травмы, сначала прекратить изофлуран администрацию. Разрешить анестетик глубину мыши, чтобы подняться в течение приблизительно 10 - 15 секунд, пока она не начнет реагировать на щипцов схождения крайнем случае.
3. Немедленно начать шаги закапывания травмы. Если анестетик глубина слишком глубока животное не будет дышать спонтанно после травмы инстилляции, что особенно актуально для соляной кислоты, содержащей травмах.
4. Попросите помощника выжать грудную клетку высылать жизненную емкость.
5. Используйте 1-0 плетеный шелковый шов ранее размещенных вокруг трахеи , чтобы обеспечить тягу, потянув его главно , а затем вставить иглу шприца в трахею между 1 - ^й и 2 - ^й хрящевых колец ниже гортани. Игла фаска должна быть обращена к хирургу и вперед до тех пор, пока коническая только мимо трахеи с иглой, как параллельно с трахеи, насколько это возможно.
6. Отпустите грудь непосредственно перед болюсным введениемсоляной кислоты, чтобы обеспечить дисперсии и осаждения в дистальный дыхательные пути и альвеолы. Депозит комок в примерно 0,5 - 0,75 с. Держите иглу в трахею, пока первый спонтанное дыхание не будет предпринято, чтобы гарантировать, что весь объем травмы болюс вдыхается в легкие.
7. Закрыть разрез с использованием либо 1 - 2 скобы кожи или наложения швов.

4. Восстановление

1. С помощью 5 мл шприц с иглой 26 G, вводят 1 мл SNS подкожно в загривок шеи для инфузионной терапии. Хотя есть минимальные потери жидкости во время процедуры, после операции мыши, как правило, не пить и потенциально может обезвоживают. В качестве альтернативы, обеспечить SNS с помощью внутрибрюшинной инъекции.
2. Место мыши в нагретой камере при 37 ° С перфузию 100% O _2. Убедитесь в том, что мышь адекватно восстанавливается перед помещением обратно в корпус. Монитор животных и не оставляйте без присмотра в течение этого времени, пока амбулаторной и полностью гecovered.

5. бронхоальвеолярной и обработка легких

1. Индуцировать и поддерживать изофлурановым анестезии, как это описано в шаге 2.1 и Этап 2.2. Подтвердить адекватную плоскость анестезии с использованием метода пинч пальца ноги, описанный в шаге 2.2.
2. Закрепить в положении лежа на спине на секционном борту и использовать петлю из 1-0 плетеной шелковой нити зацепили на высших резцами, чтобы продлить шею. Нанесите мазь ветеринарную на глаза, чтобы предотвратить сухость кожи.
3. После удаления скрепок кожи шеи, сделайте срединный продольный разрез через кожу от нижней брюшной стенки через предыдущий разрез шеи на нижней челюсти с помощью ножниц.
4. Сделайте срединный разрез в брюшную мускулатуру с помощью ножниц и втягивания органов брюшной полости с губками, чтобы выставить забрюшинного пространства. Если кровь необходима, собирают из брюшной аорты или нижней полой вены в этой точке.
5. Усыпить животное через обескровливания с помощью пересекающих abdomИнал аорта и нижняя полая вена. Используя двустороннюю торакотомия в следующей стадии вторичного подтверждающим метод эвтаназии будет завершен гуманно, установленные руководящими принципами IACUC.
6. Проколите диафрагму, чтобы вызвать коллапс легких. Затем с помощью косторезное ножницы, отрезать диафрагму и прорезать грудную клетку параллельно и по обе стороны от грудины. С помощью стопорного кровоостанавливающего втягивать грудины заслонку, чтобы облегчить инъекции 5 мл теплой (37 ° C) Хэнка сбалансированный солевой раствор с кальцием и магнием в правый желудочек, чтобы смыть сосудистую сеть легких.
   1. По мере того как кровь из аорты получают для оценки периферические уровни цитокина перед процедурой, описанной в данной статье, делают небольшой разрез в левый желудочек, чтобы обеспечить необходимый отток для крови, чтобы оставить обращение на достаточное флешами сосудистую сеть легких, если не получения крови ,
7. Подпирать рассечение доску наклоне 60 ° и использовать йПроцедура электронной описано в шаге 2.2 для облегчения вставки 20 G х ½ "канюлю из нержавеющей стали в трахее и безопасной с 1-0 швом.
8. Поместите рассечение доску горизонтально и выполнить бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ).
   1. Для выполнения БАЛ прикрепить два 5 мл шприцы с 3-ходовым запорным краном. Заполните один шприц 5 мл SNS и ввинчивается в порту запорного крана. Прикрепите пустой 5 мл шприц на 2 - ^й порт и , наконец , приложить открытый порт для запорного крана внутрибрюшного трахеи канюли , помещенной в шаге 5.6. Привить 1 мл NS в легкие и промывание со вторым шприцем.
   2. Повторите эти действия для 5 всего 1 мл NS инстилляции быть осторожным, что трахеи канюля остается обеспеченным и параллельно трахеи, так что не рвет трахею.
9. Для гистологического анализа, трахею иглу, как в шаге 5.7. Закрепить легкие по инсуфляция с 10% нейтральным забуференным формалином при 20 см H ₂ O в течение 24 часов.
10. Удалите каждую легких лепестка carefully с помощью ножниц и щипцов с помощью пересекающих бронха вблизи рубчика. Поместите каждую мочку легких (5) в общей гистологии кассеты до того, заливали в парафин. Вырезать секции 5 мкм ткани с микротома и окрашивают гематоксилином и эозином с использованием стандартных гистологических методов. ⁶ морфометрия также может быть выполнена на гистологических срезов для оценки тяжести воспаления. ⁴
11. Процесс восстановленную BAL центрифугированием при 1500 х г в течение 3 мин при температуре 4 ° С. Алиготе бесклеточной БАЛ супернатантов в эквивалентных количествах в 2,0 мл микропробирок для последующего анализа. Хранить при температуре -80 ° С.
12. Анализ БАЛ для концентрации альбумина с помощью ELISA, или любого другого биологического продукта, представляющего интерес. ¹¹ Осажденные клетки из BAL можно пересчитать, cytoslide образцы генерироваться и окрашивали Райт-Гимза на основе красителя для определения белого клеток крови дифференциального подсчета для оценки легких "Воспалительная реакция.

Результаты

Легочная гистопатология в мышиной модели аспирации кислоты пневмонит

Мыши получили ранения , как описано выше , и легкие были удалены через 24 ч после низкого рН инсульт, разрезали и H & E окрашенных (рисунок 1). Некротические кле...

Обсуждение

Цель состояла в том, чтобы разработать модель ALI животных с помощью аспирации кислоты желудочного сока, что близко напоминает патофизиологии, что происходит в организме человека при развитии кислотного пневмонит и последующих РДСВ. При разработке модели мы выбрали виды животных , к...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 ga x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1x2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 ga x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator