Ouvrir trachéotomie acide gastrique Aspiration modèle murin de lésion pulmonaire aiguë Résultats dans Maximal aiguë non létaux Lung Injury

Résumé

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Résumé

pneumonite Acid est une cause majeure de lésion pulmonaire aiguë stérile (ALI) chez les humains. pneumonite Acid couvre le spectre clinique asymptomatique au syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), caractérisé par alvéolite neutrophile, et des blessures à la fois l'épithélium alvéolaire et l'endothélium vasculaire. Cliniquement, SDRA est définie par l'apparition soudaine d'hypoxémie, infiltrats pulmonaires bilatéraux inégaux et un œdème pulmonaire non cardiogénique. Les études humaines nous ont fourni des informations précieuses sur les changements physiologiques et inflammatoires dans les poumons causées par SDRA, qui a conduit à diverses hypothèses sur les mécanismes sous-fifre. Malheureusement, les difficultés qui déterminent l'étiologie du SDRA, ainsi qu'une large gamme de physiopathologie ont abouti à un manque d'informations critiques qui pourraient être utiles dans l'élaboration de stratégies thérapeutiques.

modèles animaux translationnelle sont précieux lorsque leur pathogenèse et la physiopathologie REPRODUC précisele concept ea prouvé à la fois in vitro et les paramètres cliniques. Bien que les modèles de grands animaux (par exemple, les moutons) partagent des caractéristiques de l'anatomie de l' arbre de la trachée-bronchiques humaines, des modèles murins fournissent une foule d'autres avantages , notamment: un faible coût; prêts à court cycle de reproduction lui-même pour l'acquisition de données plus important; un système immunitaire bien compris; et un génome bien caractérisée conduisant à la disponibilité d'une variété de délétion du gène et des souches transgéniques. Un modèle robuste de pH induite par SDRA faible nécessite une murin ALI qui cible principalement l'épithélium alvéolaire, secondairement l'endothélium vasculaire, ainsi que les petites voies respiratoires menant aux alvéoles. En outre, une blessure reproductible avec de larges différences entre les insultes préjudiciables et non préjudiciables est important.

Le modèle d'aspiration d'acide gastrique murine présenté ici en utilisant l'acide chlorhydrique emploie une trachéotomie ouverte et recrée un scénario pathogène qui reproduit le faible pneumon pHitis blessures chez les humains. En outre, ce modèle peut être utilisé pour examiner l' interaction d'un faible pH insulte avec d' autres entités pulmonaires dommageables (par exemple, les particules de nourriture, des bactéries pathogènes).

Introduction

SDRA est caractérisée par une inflammation pulmonaire répandue et est cliniquement considéré comme l'essoufflement aigu de souffle avec hypoxémie. Ces symptômes se produisent souvent moins de 24 h après un événement d'incitation telles que les traumatismes, la septicémie, transfusionnelle réactions de sang ou d'aspiration. Elle se caractérise histopathologique par alvéolite neutrophile (ie, une inflammation généralisée) localisée à l' épithélium alvéolaire et l' endothélium vasculaire entraînant une fuite de protéines et de formation de la membrane hyaline ultérieurement. Aspiration est classé comme une pneumonie chimique ou d'une pneumonie d'aspiration. ¹ Le composant acide de l'aspiration gastrique contribue à la fois la pneumonite et la prédilection pour développer une pneumonie bactérienne secondaire. La pneumonie par aspiration est l'un des principaux facteurs de risque pour ALI et le développement ultérieur du SDRA. ²

aspiration gastrique est un événement aigu défini comme l'inhalation de matières de til estomac avec ou sans flore oropharyngée dans les voies aériennes au-delà des cordes vocales. Les teneurs en aspirés peuvent contenir un fluide à faible pH de l'estomac, des bactéries, le sang ou les particules alimentaires. aspiration gastrique se produit souvent chez les patients de l'unité de soins intensifs (USI), qui sont généralement dans un état de jeûne et donc placés sur un inhibiteur de la pompe à protons pour limiter l'aspiration du contenu gastrique acidifiés. L'incidence de l'ALI dans la population des soins intensifs aux Etats-Unis est de 2,5 - 5 fois plus élevé par rapport à la population générale des patients. ³ Malheureusement, ces conditions prédisposant conduisent souvent à un état de prolifération bactérienne dans l'estomac qui peuvent conduire à des séquelles plus graves dans les poumons suite à un événement d'aspiration, comme une aspiration gastrique est un facteur de risque indépendant pour le développement de la pneumonie bactérienne secondaire (SBP) , ALI et SDRA.

aspiration gastrique a deux composantes principales: l'acide chlorhydrique et le contenu gastrique, ce qui peut ou non contenir des bactériesou de particules de nourriture. Dans le modèle de rongeur le composant acide seul d'aspiration gastrique produit une réponse inflammatoire initiale en raison de la blessure caustique directe de faible pH sur épithélium des voies respiratoires. Ceci est suivi d'une infiltration neutrophile et une réponse inflammatoire de 4 - 6 heures. ⁴ Ces deux facteurs conduisent finalement à la destruction de l' intégrité microvasculaire pulmonaire conduisant ainsi à une extravasation de liquide et de protéines dans les alvéoles et les voies respiratoires. Pour comprendre ce physiopathologie et d'étudier plus avant les interventions thérapeutiques possibles, il est important de développer et caractériser un modèle animal qui élucide les mécanismes sous-jacents impliqués. seule une aspirée acide doit être volumineux ou avec un pH suffisamment bas pour contourner la capacité tampon de l'arbre respiratoire et atteindre les alvéoles. Si cela ne se produit pas, seule une partie supérieure, la conduite des blessures des voies respiratoires transitoire se produit qui est moins susceptible de conduire à des séquelles graves du SDRA. ^{5 <}/ Sup>

Émuler un événement d'aspiration avec précision l'épithélium alvéolaire lésée, il est important de contourner les défenses naturelles de l'animal. En utilisant un modèle d'aspiration de la souris pour produire un ALI qui imite la blessure d'acide gastrique observée chez l'homme, il faut tenir compte des différences dans l'arbre de la trachée-bronchique. La technique de trachéotomie ouverte que cette méthode utilise contourne les différences entre les souris et les arbres respiratoires humaines et modèles, la blessure d'une manière qui reproduit ALI fois physiologiquement et histologiquement. Historiquement, intubation trachéale a été utilisé pour générer ALI, mais il est considéré comme difficile à réaliser chez les souris sans blessure laryngé. Par conséquent, cette méthode offre une alternative potentielle qui a donné des résultats cohérents entre plusieurs chercheurs et avec la procédure mortalité attribuée minime.

Protocole

Tous les matériaux et l'équipement doivent être recueillies et adéquatement organisée avant l'intervention. La procédure doit être conduite avec des transitions en douceur d'une étape à l'autre afin de fournir des données reproductibles cohérentes. Ce protocole fait suite à des politiques institutionnelles établies par le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnels au Buffalo Veterans Affairs Medical Center.
NOTE: C57BL / 6 mâles et femelles ont été utilisés pour ce protocole. Il n'y a pas de différence significative de fuite d'albumine entre les sexes.

1. Préparation d'acide chlorhydrique

1. HCl 56,2 mM rendre _stérile , en ajoutant 281 pi de HCl 1 à 4,72 ml de solution saline normale stérile (SNS). Titrer à pH 1,25 avec HCl 1 N (≈ 0-50 ul).
2. Faire de cette préparation fraîche avant l'accident. Comme un pH bas SNS ne tamponné il assure la chlorhydrique blessure d'acide insulte est transitoire.

2. Anesthésie et trachéale Exposition Technique

REMARQUE:Veiller à ce que la procédure de blessure est réalisée dans une hotte avec un filtrage de charbon de bois pour évacuation des gaz anesthésiques. Maintien des conditions stériles est essentiel car cela est une chirurgie de survie. Utiliser des gants stériles et stériliser tous les instruments dans une perle de verre instrument chirurgical avant l'intervention chirurgicale stérilisant sur chaque animal. L'utilisation de rideaux pour isoler le site chirurgical est recommandé de maintenir la stérilité. Utilisez isoflurane comme gaz anesthésique car il fournit une solubilité des gaz du sang relativement faible permettant une induction rapide de l'anesthésie, ainsi que la récupération rapide après la blessure.

1. Commencer par induction dans une chambre d'anesthésie avec 2,75% d'isoflurane dans de l'oxygène avec un taux de 2 L / min.
2. Une fois que la souris est correctement anesthésié (ne répondant pas aux pieds pincer assez fort pour ne pas casser la peau ou causer des dommages aux tissus profonds), suspendre la souris par les incisives supérieures avec une longueur de 15 cm de 1-0 suture tressée en soie dans une position couchée sur un 60 ^o bord incliné de dissection.
3. Veiller à ce que l'anesthésie est maintenue tout au long de la chirurgie en livrant isoflurane à travers un cône de nez. Appliquer une pommade vétérinaire sur l'oeil de la souris pour prévenir la sécheresse.
4. Rasez la partie ventrale du cou avec une tondeuse électrique et appliquer une solution antiseptique topique (ie, povidone-iode). Enlever l'excès antiseptique avec de la gaze et laisser sécher (~ 15 - 30 s).
5. Infiltrez la ligne médiane du cou de la fourchette sternale à la partie inférieure de la mâchoire avec 100 pi bupivacaïne à 0,5% (pour fournir une analgésie pré-, péri- et post-opératoire).
6. Faire 1 - 1,5 cm ligne médiane longitudinale incision dans le cou avec un scalpel ou des ciseaux fins courbes. Pénétrer la membrane aponévrotique entre les glandes salivaires par dissection avec 2 pinces dentelées incurvées pour exposer la trachée (identifiée par les anneaux cartilagineux blancs).
7. Toujours en utilisant les 2 pinces dentelées, saisir un côté de la musculature paratrachéale et tirez sur le côté tout en disséquant entre le musfibres longitudinalement à côté de la trachée de cle.
8. Une fois que la dissection plan est établi, poursuivre la rétraction du muscle paratrachéal que la seconde paire de pinces est travaillé sous la trachée. Utilisez ces pinces pour placer un 15 cm brin de 1-0 suture tressée en soie dans la pointe de la pince et tirez à travers de placer la suture derrière la trachée.

Procédure instillation 3. intra-trachéale

1. Préparer la seringue blessure instillation par remplissage d'une seringue 0,5 ml fixée à une aiguille 22 G avec 0,2 ml d'air, puis de 3,6 ml / kg d'acide chlorhydrique. L'air va agir pour faciliter la dispersion du véhicule, ainsi qu'une manoeuvre de recrutement alvéolaire pour les alvéoles qui peuvent avoir subi une atélectasie lors de l'administration d'anesthésie.
   REMARQUE: Suivez les directives du IACUC locales concernant l'analgésie post-opératoire et consulter votre vétérinaire local. Soyez prudent sur l'utilisation des analgésiques avec des propriétés anti-inflammatoires avant emploiment ce modèle de lésion pulmonaire stérile.
2. Pour administrer la blessure, arrêtez première administration isoflurane. Laisser profondeur de l'anesthésie de la souris à la hausse pendant environ 10-15 s jusqu'à ce qu'il commence à réagir à un pincement de l'orteil forceps.
3. commencer immédiatement des mesures d'instillation de blessure. Si profondeur de l'anesthésie est trop profonde l'animal ne respire pas spontanément après une blessure instillation, ce qui est particulièrement vrai pour les acides contenant blessures chlorhydrique.
4. Demander à un assistant presser la cage thoracique pour expulser la capacité vitale.
5. Utilisez la suture de soie 1-0 tressé placé précédemment autour de la trachée pour assurer la traction en le tirant supérieurement puis insérez l' aiguille de la seringue dans la trachée entre le 1 ^er et 2 anneaux cartilagineux en dessous du larynx. Le biseau de l'aiguille doit être dirigée vers le chirurgien et l'avance jusqu'à ce que le biseau est juste après la trachée avec l'aiguille en parallèle avec la trachée que possible.
6. Relâchez la poitrine juste avant l'administration d'un bolus del'acide chlorhydrique afin d'assurer la dispersion et le dépôt dans les voies aériennes et les alvéoles distale. Déposer le bolus dans environ 0,5 à 0,75 s. Maintenir l'aiguille dans la trachée jusqu'à ce que la première respiration spontanée est prise pour garantir que la totalité du volume des lésions bol est inhalée dans les poumons.
7. Fermer l'incision en utilisant soit 1 - 2 agrafes de la peau ou des sutures.

4. Récupération

1. En utilisant une seringue de 5 ml avec une aiguille de 26 G, injecter 1 mL SNS sous-cutanée dans le cou peau du réanimation fluide. Bien qu'il y ait perte de fluide minimale durant la procédure, après la chirurgie de la souris a tendance à boire et peut potentiellement déshydrater. Vous pouvez également fournir SNS via une injection intrapéritonéale.
2. Placer la souris dans une chambre chauffée à 37 ° C perfusée avec 100% de O _2. Assurez-vous que la souris est récupéré de façon adéquate avant d'être replacé dans le logement. Surveiller les animaux et ne pas laisser sans surveillance pendant cette période jusqu'à ambulatoire et entièrement recovered.

5. lavage broncho-alvéolaire et de traitement du poumon

1. Provoquer et maintenir une anesthésie isoflurane comme décrit à l'étape 2.1 et l'étape 2.2. Confirmez plan adéquat d'anesthésie en utilisant la méthode toe de pincement décrite à l'étape 2.2.
2. Fixer en position couchée sur une planche de dissection et utiliser une boucle de 1-0 suture tressée en soie accroché les incisives supérieures pour étendre le cou. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
3. Après avoir enlevé les agrafes de peau du cou, faire une incision longitudinale médiane à travers la peau de la paroi abdominale inférieure à travers le col incision précédente à la mandibule avec des ciseaux.
4. Faire une incision médiane dans la musculature péritonéale avec des ciseaux et rétracter les organes abdominaux avec des éponges pour exposer l'espace rétropéritonéal. Si le sang est nécessaire, recueillir de l'aorte abdominale ou la veine cave inférieure à ce point.
5. Euthanasier l'animal via exsanguination par sectionnant le abdomaorte inal et la veine cave inférieure. En utilisant une thoracotomie bilatérale dans l'étape suivante une méthode de confirmation secondaire de l'euthanasie sera complétée humainement établie par les directives IACUC.
6. Perforer la membrane pour provoquer l'effondrement du poumon. Ensuite, en utilisant les os des ciseaux de coupe, couper la membrane et couper à travers la cage thoracique parallèle et sur les deux côtés du sternum. Utilisez une pince hémostatique de verrouillage pour rétracter le rabat sternal pour faciliter l'injection de 5 ml chaud (37 ° C) une solution saline équilibrée de Hank avec le calcium et le magnésium dans le ventricule droit pour vider la vascularisation pulmonaire.
   1. Comme le sang de l'aorte est obtenue pour évaluer les niveaux de cytokine périphériques avant la procédure décrite dans cet article, faire une petite incision dans le ventricule gauche pour fournir des sorties nécessaires pour le sang de quitter la circulation à ras adéquate la vascularisation des poumons en cas de ne pas obtenir le sang .
7. Prop la planche de dissection à une inclinaison de 60 ° et d'utiliser the procédure décrite à l'étape 2.2 pour faciliter l'insertion d'une G 20 x ½ "canule en acier inoxydable dans la trachée-artère et sécurisé avec une suture 1-0.
8. Placez la planche de dissection horizontalement et effectuer un lavage broncho - alvéolaire (BAL).
   1. Pour effectuer la BAL attacher deux 5 seringues mL à un robinet 3 voies. Remplir une seringue avec 5 mL de SNS et visser dans le port de robinet. Attachez un vide 5 ml seringue à un port 2 ^e et enfin attacher port ouvert du robinet à canule intra-trachéale placé à l' étape 5.6. Instiller 1 mL de NS dans les poumons et le lavage avec seconde seringue.
   2. Répétez l'opération pour un total de 1 5 instillations NS mL en faisant attention que la canule trachéale reste sécurisé et parallèle à la trachée de sorte qu'il ne se déchire pas la trachée.
9. Pour l'analyse histologique, cathétériser la trachée comme à l'étape 5.7. Fixer les poumons en insufflant avec 10% de formol tamponné neutre à 20 cm H ₂ O pendant 24 h.
10. Retirer chaque lobe CAREF du poumonutilisant ully ciseaux et des pinces par sectionnant bronchus près du hile. Placer chaque lobe pulmonaire (5 au total) dans une cassette d'histologie avant d'être inclus dans la paraffine. Couper 5 um sections de tissu avec un microtome, et tacher avec de l'hématoxyline et de l'éosine en utilisant des techniques histologiques standard. ⁶ Morphométrie peuvent également être effectuées sur les lames histologiques pour quantifier l'inflammation sévérité. ⁴
11. Traiter le BAL récupéré par centrifugation à 1500 g pendant 3 min à 4 ° C. Aliquoter les surnageants de BAL exempts de cellules dans des quantités équivalentes dans 2,0 ml microtubes pour une analyse future. Conserver à -80 ° C.
12. Analyser le BAL de la concentration d'albumine par la méthode ELISA, ou tout autre produit biologique présentant un intérêt. ¹¹ Les cellules sédimentées de la BAL peuvent être comptées, les spécimens de cytoslide générés, et colorées avec teinture à base Wright-Giemsa pour le blanc détermination du sang de comptage différentiel des cellules pour évaluer les poumons 'réaction inflammatoire.

Résultats

Pulmonaire histopathologie du modèle murin de l'acide Aspiration Pneumopathie

Les souris ont été blessés comme décrit ci - dessus et les poumons ont été retirés 24 heures après un pH faible insulte, sectionnés et H & E colorées (Figure 1). Les cellules nécrotiques, la perte de l'architecture du parenchyme pulmonaire, les cellules et les débris dans les espaces aériens et importante infil...

Discussion

L'objectif était de développer un modèle animal ALI par aspiration acide gastrique qui ressemble étroitement à la physiopathologie qui se produit chez l'homme au cours du développement de pneumopathie acide et SDRA ultérieures. Lors de l' élaboration d' un modèle, nous avons choisi une espèce animale qui offre l' acquisition élevée de données de débit en raison de son faible coût, cycle de reproduction court, et un système immunologique bien compris avec une abondance d'outi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
syringe, 1 cc	Becton Dickinson	309628
syringe, 5 cc	Becton Dickinson	309646
needle, 22 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305159
needle, 26 G x 1 1/2"	Becton Dickinson	305111
1-O Braided Silk Suture	Harvard Apparatus	517730
3" Curved tissue serrated forceps	Fine Science Tools	11065-07
3" Curved tissue "toothed" forceps, 1 x 2 teeth	Fine Science Tools	11067-07
4" curved micro dissecting scissors	Fine Science Tools	14061-10
bone cutting spring scissors	Fine Science Tools	16144-13
3 1/2" curved locking hemostat	Fine Science Tools	13021-12
Disposable Skin Stapler	3M	DS-25
tracheal cannula (20 gauge x 1/2" stainless steal tubing adapter)	Becton Dickinson	408210
60-degree Incline Dissection Board
0.5% Bupivacaine
Isoflurane
Betadine and "Q-tip" cotton applicator