تحريض الدماغية السكتة الدماغية ونقص التروية ضخه في الفئران عن طريق الشريان الأوسط انسداد تقنية والتخيل من عائق منطقة

Summary

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Abstract

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Introduction

دراسة أمراض القلب والأوعية الدموية، مثل السكتة الدماغية، ويعتمد على استخدام نماذج في الجسم الحي. في فهم الآثار المترتبة ممكن من نقص التروية، سمية الدواء، و / أو العلاج، وهناك حاجة إلى استخدام نموذج مناسب، موحد وموثوق بها، وقابلة للتكرار لهذا المرض، والتي تمكن الدراسات المقارنة بين مجموعات العلاج. في هذه المخطوطة، ونحن نستخدم الفئران، نظرا لتوافر عدد كبير من الفئران المعدلة وراثيا ونماذج تقييم موحدة. نبش عشرات لتقييم العجز الحركي والسلوك التالي السكتة الدماغية التجريبية والانتعاش التالية تم تطويرها ^{1 و 2.}

هي المتاحة، مثل كامل نقص التروية الدماغية العالمي، نقص التروية العالمي ناقصة، نقص التروية الدماغية متعددة البؤر ونقص التروية الدماغية البؤري عدة نماذج السكتة الدماغية. المجموعة الأخيرة هي أيضا فئة من السكتة الدماغية الأكثر انتشارا في المرضى. غالبية عشيةوبدأت اليلة قبل تشكيل انسداد الصمي أو الجلطات عند أو بالقرب من الشريان الدماغي الأوسط (مولودية الجزائر). ونظرا لهذه المعايير، والنموذج المقدم بشكل وثيق يقلد مسببات مرض السكتة الدماغية الإنسان ويجعل النتائج التي تم الحصول عليها ذات أهمية كبيرة ^3. ومع ذلك، فقد ثبت أن ترجمة الاكتشافات من نماذج حيوانية لعلاج المرض لدى البشر ليكون تحديا. حتى الآن، وقد وافق فقط استخدام الأنسجة التخثر البلاسمينوجين منشط لعلاج السكتة الدماغية الحادة ^4.

ومن بين نماذج من نقص التروية الدماغية التنسيق في الماوس، الخلفي الدماغي نموذج التداول السكتة الدماغية والدماغية نموذج تخثر وريدي هي الغازية للغاية، مما يقلل إمكانية تطبيقها والحد من مجموعة من التحليلات التي يمكن القيام بها. ومع ذلك، وتقنيات أخرى، مثل نموذج الصمي، نموذج photothrombosis، نموذج السكتة الدماغية endothelin-1 التي يسببها، وخياطة داخل اللمعة انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO) نموذج، متاحة للاستخدام من دون قيود. نموذج MCAO هو أسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول. ويوفر طريقة يمكن الاعتماد عليها لإحداث نقص التروية الدماغية البؤري التي يمكن إشباعها بسهولة وأداء بطريقة الإنتاجية العالية. هناك طريقتان لهذا النموذج، وهي أساليب زيا-لونجا وكويزومي. وهي تختلف قليلا في طريقة إدراج خياطة انسداد في الأوعية الدموية. في تقنية زيا-لونجا، يتم إدراج خياطة عبر الشريان السباتي الخارجي ^5. يتم تعديل هذه التقنية المعروضة هنا من أسلوب كويزومي الذي يتم إدخال خياطة الاغلاق من خلال الشريان السباتي المشترك ^(6).

تم تطبيق نموذج MCAO بنجاح لتقييم الأحداث المختلفة التي تحدث أثناء السكتة الدماغية. بعد ضخه، وذمة الدماغ ويمكن ملاحظة جنبا إلى جنب مع انهيار حاجز الدم في الدماغ. ويلاحظ عادة موت الخلايا العصبية الذروة في 24 ساعة. ومع ذلك، فإنه إعادةيلتفت الى مستويات خط الأساس بعد 7 أيام ^7. في البشر، والجنس والعمر والمتغيرات الهامة عند تحديد نتيجة السكتة الدماغية، وهذا ما لوحظ أيضا في الفئران والجرذان ^{8 و 9 و 10.} وقد استخدمت العديد من المنشورات نموذج MCAO لإثبات كفاءة معالجة ^{11، 12، 13، 14.}

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات من قبل جامعة ميامي المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (IACUC) وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة (NIH) المبادئ التوجيهية. مطلوب استخدام المعدات المعقمة وتقنيات العقيم.

1. إعداد انسداد خياطة

1. استخدام الخيط بقطر 0.21 ملم بالنسبة للفئران بين 20 - 25 غراما و 0.23 مم بالنسبة للفئران بين 25-35 غرام من وزن الجسم. اختيار نوع من الغرز لإجراء MCAO يعتمد على وزن الحيوان.
2. باستخدام قلم فضة، بمناسبة خياطة في 9 ملم بدءا من سيليكون المغلفة طرف. وهذا سيكون بمثابة دليل لطول الإدراج.

2. إعداد لجراحة

1. تخدير الماوس مع isoflurane مختلطة مع الأكسجين، وذلك باستخدام نظام التخدير المختبر. استخدام الأيزوفلورين إلى وضع 5 وتدفق الأوكسجين في 2 على آلة التجارية (راجع المواد الجدول). نقل الحيوان إلى surgerذ السطحية والحفاظ على التخدير باستخدام مخروط الأنف (استخدام وضع 1.5 الأيزوفلورين - 2.5 وتدفق الأوكسجين في 2).
   1. تأكد من أن معدل التنفس الماوس حوالي 1-2 التنفس لكل ثانية دون يلهث. وبالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن هذا الحيوان لا يحمل رد فعل التحفيز شعرات والمنعكس دواسة (قرصة أخمص قدميه). مراقبة معدل التنفس والجهد أثناء الجراحة، على الأقل كل 5 دقائق.
2. وضعت قطرة من زيوت التشحيم العيون على كل عين باستخدام مسحة معقمة لمنعهم من الجفاف أثناء العملية. بدلا من ذلك، وتطبيق مرهم للعين من أنبوب الأدوية العقيمة.
3. الوجه الحيوان على ظهره، وحلق منطقة شق. بعد ذلك، وتطهير شامل لمنطقة الجراحة باستخدام الايثانول 70٪، تليها الكلورهيكسيدين، ومسحة النهائية مع 70٪ من الإيثانول. وضع الحيوان على سطح الجراحية دافئ تحت مجهر تشريحي.

3. تشريح الشريان السباتي المشترك والداخلية / جيس إكستrnal التشعب

1. باستخدام مقص جراحي وملقط، إجراء شق خط الوسط الضحلة في الرقبة، من فوق عظمة الصدر إلى أسفل الفك (حوالي 3-4 سم). يجب وضع ثنى الجراحية في جميع أنحاء المنطقة لعملية جراحية لمنع الأجهزة من ملامسة الأسطح غير معقمة. تم حذف ثنى الجراحية في الفيديو الحالي لمساعدة التصوير.
2. باستخدام ملقط، الدهنية منفصل بعناية والنسيج الضام لفضح القصبة الهوائية. يجب أن الأنسجة بسهولة وبشكل طبيعي منفصلة لكلا الجانبين.
3. ضع وسادة (وجوه مستديرة، حوالي 0.5 سم وقطرها) على الجزء الخلفي من الرقبة من الفئران تمديد العنق، مما يعرض المنطقة لإجراء عملية جراحية.
4. فتح شق سواء باستخدام ضام الأنسجة أو السنانير.
5. على الجانب الحيوان الأيسر من القصبة الهوائية، ينتف الريش بعناية بعيدا النسيج الضام لفضح الأيسر الشريان السباتي المشترك (CCA). يجب الحرص على عدم تلف الأعصاب والأوردة الرئيسية واحدة مع التقييم القطري المشترك.
6. مواصلة فضح التقييم القطري المشترك، والحرص على فصل من الأنسجة الكامنة، وفضح كبار "Y" المتفرعة من الشريان الدماغي الداخلي (ICA) والشريان الدماغي الخارجي (ECA). للمساعدة في فصل التقييم القطري المشترك، إدراج ملقط المنحني تحت التقييم القطري المشترك لاختراق النسيج الضام ومن ثم السماح ببطء لهم لفتح.

4. إعداد التقييم القطري المشترك لMCAO خياطة الإدراج

1. إدراج 3 شرائح من الخيط النايلون من حوالي 4 سم في الطول تحت التقييم القطري المشترك. تأكد من أن التقييم القطري المشترك ليس الملتوية وهذا من شأنه تعقيد كبير في إدخال الخيط.
2. عند أدنى نقطة ممكنة، أغلق خياطة أسفل باستخدام عقدة دائمة.
3. ربط الخيط أعلى أسفل ICA / اللجنة الاقتصادية لأفريقيا المتفرعة باستخدام عقدة الانزلاق القابلة للإزالة.
4. ربط الخيط المتوسطة باستخدام عقدة الانزلاق القابلة للإزالة، ولكن يبقيه مفتوحا على مصراعيه. ومن المهم أن ترك الكثير من الفضاء لا تعيق خياطة الإدراج.
5. باستخدام تسليخ مجهري الربيع الخيال العلميssors، إجراء شق في التقييم القطري المشترك بين القاع والغرز الوسطى. إجراء شق 0.2 ملم على مقربة من خياطة أسفل.

5. الشرق انسداد الشريان الدماغي

1. باستخدام ملقط، إدراج خياطة MCAO في شق التقييم القطري المشترك، وتوجيه ما يصل إلى الأعلى. تنفيذ هذه الخطوة بسرعة بعد الخطوة 4.5 لمنع تخثر الدم وإغلاق افتتاح التقييم القطري المشترك. في حال تم حظره الإدراج خياطة، استخدم نصائح من ملقط لإعادة فتح الجرح.
2. ربط بلطف إلى أسفل الدرز الوسطى من جانب خياطة سيليكون MCAO باستخدام عقدة زلة لتقييد تدفق الدم من حوله، ولكن فضفاض بما يكفي لتمكينه من التحرك بحرية.
3. تراجع بعناية خياطة العليا، والتأكد من أن خياطة MCAO لا تنزلق.
4. إدراج خياطة MCAO في ICA من قبل اثنين من ملليمتر وثم reclose خياطة العليا، بنفس الطريقة كما هو موضح في الخطوة 5.2.
5. توجيه خياطة MCAO إلى منطقة الانسداد. مؤشر الإدراج الناجح هويقع يتضح من كمية قليلة من ارتجاع الدم من شق التقييم القطري المشترك وأن العلامة الفضية 9 ملم بين شق التقييم القطري المشترك والتشعب ICA / اللجنة الاقتصادية لأفريقيا. مزيد من التأكيد من انسداد ناجحة يمكن الحصول عليها باستخدام طرق الرصد مثل دوبلر الليزر تدفق الدم نظام رصد ^{15 و 16.}
   ملاحظة: انخفاض في 90٪ من تدفق الدم إلى منطقة الدماغ المتوسط ​​على الجانب منطقة المغطي تشير انسداد ناجحة.
6. بعد انسداد ناجحة، التعادل لأسفل خياطة المتوسطة والعليا بإحكام. إذا كان أداء خدعة الإدراج، لا reclose الغرز ولكن تخطي بدلا من ذلك على الفور إلى الخطوة 7.3.

6. شق الإنتهاء والعناية بعد العملية

1. الثنية في الغرز في منطقة الشق.
2. إزالة ضام أو الأنسجة السنانير وسادة.
3. منطقة خياطة نظيفة باستخدام المياه المالحة عقيمة ومسحة القطن.
4. إغلاق شق باستخدام النايلون خياطة / إبرة وملقط.
<لى> بإدارة المضادة للالتهابات (على سبيل المثال، كاربروفين 10 ملغم / كغم، SC) ومسكن (على سبيل المثال، البوبرينورفين 0.1 ملغ / كغ الشوري، مرتين في اليوم) الأدوية للتخفيف من الانزعاج بعد الجراحة. وضع الفئران في قفص وضعها على وسادة ساخنة لمنع انخفاض حرارة الجسم ومنح حق الوصول الشفة الإعلان إلى الماء والغذاء خففت.
5. رصد الانتعاش الحيوانات (5-10 دقيقة) وعلامات السكتة الدماغية. ويمكن أن تختلف من الشلل الجانبي خفيف وتدور إلى انكماش حاد في الجهة المقابل والمتداول. وترد عدة نقاط التقييم في المناقشة. الحيوانات التي تظهر علامات الضائقة التنفسية أو النوبات الحادة لابد أن يتم التخلص.
6. اعتمادا على بروتوكول ضخه نقص التروية، وترك خياطة MCAO في الفترة من 30 دقيقة إلى 120 دقيقة أو أكثر. تقليل الوقت انسداد يمنع الوفيات.
7. لانسداد دائم، وترك خياطة MCAO في مكان لمدة 24 ساعة، ولكن معدل الوفيات الكبير هو متوقع. بعد هذا الفاصل الزمني، انتقل إلى STEص 7.
   1. في حالة استخدام نموذج انسداد دائم، والحفاظ على الفئران في قفص حتى نقطة النهاية. في ذلك الوقت، وإزالة خياطة (الخطوات 7،1-7،8). ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا الإجراء بعد القتل الرحيم.

7. ضخه

1. تخدير الحيوان مرة أخرى (اتبع التعليمات في 2.1) وإزالة الغرز إغلاق الجرح.
2. باستخدام ملقط وفواصل الأنسجة، وإعادة فتح شق وفضح التقييم القطري المشترك.
3. إزالة بعناية خياطة العلوي وسحب بلطف على خياطة MCAO حتى يقع جزء من السيليكون المغلفة في عقدة الوسطى.
4. إعادة عقدة أعلى على خياطة لمنع الدم من التدفق تمرير الخيط (أنه ليس من الضروري أن تكون عقدة زلة).
5. بعناية التراجع عن عقدة المتوسطة وسحب الخيط الماضي عقدة أعلى، ولكن يبقيه داخل التقييم القطري المشترك.
6. إغلاق محكم عقدة قصوى لمنع تدفق الدم في الشريان.
7. سحب تماما خياطة MCAO وإغلاق محكم عقدة الوسطى.
8. خياطة MCAO يمكن أن يكونإعادة استخدامها عدة مرات. بعد كل استخدام، وتنظيف خياطة بعناية في الايثانول 70٪ لإزالة الملوثات (على سبيل المثال، في الدم أو الأنسجة) باستخدام شاش معقم. بعد ذلك، ضع خياطة في كيس معقم وتعقيمها.
9. كرر الخطوات من 6،1-6،4 ورصد الانتعاش الحيوانات.

تحليل 8. الأنسجة

1. لمراقبة حجم المخ، تشريح خارج الدماغ.
   1. الموت ببطء الماوس باستخدام عملية من خطوتين. أولا، فضح الحيوان إلى جرعة زائدة من الأيزوفلورين حتى توقف التنفس. لتلطيخ TTC، قطع رأس الماوس على الفور، والشروع في استخراج الدماغ. لالدماغ باجتزاء (على سبيل المثال، ليحلل المناعية)، نفذ نضح من خلال ثقب في القلب قبل قطع الرأس.
   2. قطع الرأس في قاعدة الجمجمة وقطع فروة الرأس من افتتاح الرقبة إلى الجزء العلوي من الجمجمة حتى بين العينين. مع الجمجمة المكشوفة، وقطع العظام على جانبي بدءا من افتتاح قاعدة الجمجمةحتى محجر العين. جعل هذا الخفض على طول جزء واسع من الجمجمة. يجب الحرص على عدم الوصول عميق جدا مع مقص لمنع تلف الدماغ.
   3. بعد ذلك، وقطع العظام بين تجويف العين اثنين.
2. باستخدام ملقط، رفع الجزء العلوي من الجمجمة لفضح الدماغ. يجب أن يكون هناك سوى مقاومة صغيرة. اذا لم ترفع بسهولة، قد تكون شقوق الجمجمة غير مكتملة. نقب من الدماغ بلطف باستخدام ملقط المنحنية حادة. الدماغ قد لا يزال تركيبها من قبل العديد من الأعصاب. المضي قدما ببطء، إزالة المرفقات على طول الطريق.
3. وضع الدماغ جديدة في مصفوفة الدماغ 1 ملم، إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني، وشريحة طول المصفوفة باستخدام شفرة حلاقة أو شفرة ناظم البرد.
4. نقل الدماغ على طبق 100 ملم وإضافة حل تلطيخ (2٪ 2،3،5-triphenyltetrazolium كلوريد [عقاري] الذائبة في برنامج تلفزيوني) لتغطية الجزء السفلي من الطبق. باستخدام اثنين من ملقط، منفصلة عن شرائح الدماغ (الجبهة التي تواجه أسفل) ووضعها في النظام في قاع الطبق.
   ملاحظة: سوف يلطخ تحويل أنسجة قابلة للحياة الحمراء، مع الأنسجة غير قابلة للحياة المتبقية البيضاء. وارتفاع درجة حرارة الحل إلى 37 درجة مئوية تسريع تلطيخ. ويمكن رؤية علامات منطقة السكتة الدماغية (أبيض) في أسرع وقت 90 دقيقة بعد السكتة الدماغية وتبقى لأكثر من 7 أيام مرئية. وينبغي أن يتم التصوير مع حاكم للسماح حساب حجم المخ.
5. عملية تشريح أدمغة لباجتزاء، المناعية تلطيخ، والعزلة البروتين، أو مجموعة متنوعة من الإجراءات الأخرى ^{17 و 18 و 19.}

النتائج

ويتضح الطريق الإدراج للخياطة انسداد في الشكل 1. خياطة MCAO هي أن يتم توجيهها إلى منطقة الانسداد، bifurcating في ICA. سوف انسداد الناجح لمولودية الجزائر تؤدي إلى إصابة الأنسجة وظاهرة للعيان من خلال تلطيخ TTC. ويبين الشكل 2 صورة من تلطيخ من خدعة...

Discussion

استخدام الناجح لطريقة MCAO صفها يعتمد بشكل كبير على فهم الدماغي التشريح تدفق الدم. منذ موضع الصحيح للخياطة من الصعب تمييز بسبب عدم وجود أدلة بصرية مباشرة، الممارسة المتكررة هي مهمة لإتقان هذا الاجراء قبل استخدامه للدراسات الاستقصائية. وينبغي تحليل حجم المخ لضمان تحقي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCAO suture 0.23 mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21 mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 - LDPM