Induzione di ictus ischemico e di ischemia-riperfusione nei topi mediante la tecnica di occlusione dell'arteria Medio e visualizzazione di Infarct Area

Riepilogo

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Abstract

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Introduzione

Lo studio di malattie cardiovascolari, come ictus, si basa sull'utilizzo di modelli in vivo. Per comprendere la possibile implicazione di ischemia, tossicità del farmaco, e / o il trattamento, vi è la necessità di utilizzare un modello adatto, standardizzata, affidabile e riproducibile della malattia, che consente studi comparativi tra i gruppi di trattamento. In questo manoscritto, stiamo usando i topi, data la disponibilità di un gran numero di topi transgenici e modelli di valutazione standardizzati. Rastrellando i punteggi per valutare a motore e il comportamento deficit seguenti ictus ischemico sperimentale e il successivo recupero sono stati sviluppati ^{1, 2.}

Diversi modelli con ictus ischemico sono disponibili, come ad esempio completo ischemia globale cerebrale, ischemia incompleta globale, multifocale ischemia cerebrale e ischemia cerebrale focale. Quest'ultimo gruppo è anche la categoria di ictus prevalente nei pazienti. La maggior parte di Evanti vengono avviate dalla formazione di un'occlusione embolica o trombotica o in prossimità dell'arteria cerebrale media (MCA). Alla luce di questi parametri, il modello presentato da vicino imita malattia eziologia della corsa umana e rende i risultati ottenuti altamente pertinenti ^3. Tuttavia, la traduzione di scoperte da modelli animali per il trattamento della malattia negli esseri umani ha dimostrato di essere una sfida. Fino ad ora, solo l'uso di tessuto trombolitica del plasminogeno è stato approvato per il trattamento dell'ictus ischemico acuto ^4.

Tra i modelli di ischemia cerebrale focale nel topo, posteriore modello di ictus circolazione cerebrale e cerebrale modello trombosi venosa sono altamente invasiva, diminuendo la loro applicabilità e limitando la gamma di analisi che possono essere eseguite. Tuttavia, altre tecniche, come ad esempio il modello embolico, il modello photothrombosis, modello di ictus endotelina-1 indotta, e endoluminale sutura dell'arteria cerebrale media di occlusione (MCAO modello), sono disponibili per l'uso, senza tali limitazioni. Il modello MCAO è una tecnica descritta in questo protocollo. Offre un metodo affidabile per indurre ischemia cerebrale focale che possono essere facilmente riperfuso ed eseguito in maniera high-throughput. Ci sono due approcci per questo modello, vale a dire, i metodi di Zea-Longa e Koizumi. Essi differiscono leggermente in modo sutura occlusione viene inserito nel sistema vascolare. Nella tecnica Zea-Longa, la sutura viene inserito attraverso la carotide esterna ^5. La tecnica qui presentata viene modificato dal metodo Koizumi in cui è inserita la sutura occlusione attraverso l'arteria carotide comune ^6.

Il modello MCAO è stato applicato con successo per valutare diversi eventi che si verificano durante l'ictus ischemico. A seguito di riperfusione, edema cerebrale può essere osservata con la rottura della barriera emato-encefalica. morte neuronale picco si osserva di solito a 24 ore; tuttavia, risi rivolge a livelli basali dopo 7 giorni ^7. Negli esseri umani, il sesso e l'età sono variabili importanti nel determinare il risultato ictus, questo si osserva anche in topi e ratti ^{8, 9, 10.} Diverse pubblicazioni hanno utilizzato il modello MCAO dimostrare efficienza di trattamento ^{11, 12, 13, 14.}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dalla University of Miami Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC) in conformità con i National Institutes of Health (NIH) le linee guida. è richiesto l'uso di materiale sterile e tecniche asettiche.

1. Preparare l'occlusione di sutura

1. Utilizzare una sutura di diametro di 0,21 millimetri per topi tra 20 - 25 g e 0,23 mm per topi tra 25 - 35 g di peso corporeo. La scelta del tipo di suture per la procedura MCAO dipende dal peso degli animali.
2. Usando una penna d'argento, segnare la sutura a 9 mm a partire dalla punta rivestito di silicone. Questo servirà come guida per lunghezza di inserimento.

2. Preparazione per la chirurgia

1. Anestetizzare topo con isoflurano mescolato con l'ossigeno, utilizzando un sistema di laboratorio anestesia. Utilizzare isoflurano a creare 5 e il flusso di ossigeno a 2 sulla macchina commerciale (vedi Materiali Tavolo). Trasferire l'animale al Surgersuperficie y e sostenere l'anestesia con un cono (uso impostazione 1,5 isoflurano - 2,5 e ossigeno flusso a 2).
   1. Assicurarsi che la frequenza respiratoria del mouse è di circa 1 - 2 respirazione per sec senza boccheggiare. Inoltre, assicurarsi che l'animale non presenta reazione stimolazione baffi e il pedale del riflesso (tep pizzico). Monitorare la frequenza respiratoria e lo sforzo durante l'intervento chirurgico, almeno ogni 5 min.
2. Mettere una goccia di lubrificante oftalmica su ciascun occhio con un tampone sterile per evitare che si secchi durante la procedura. In alternativa, applicare pomata oftalmica ad occhio da un tubo farmaceutica sterile.
3. Capovolgere l'animale sul dorso e radere l'area di incisione. In seguito, accuratamente disinfettare la zona chirurgia utilizzando 70% di etanolo, seguito da clorexidina, e il tampone finale con il 70% di etanolo. Posto l'animale su una superficie chirurgica caldo sotto uno stereomicroscopio.

3. La dissezione della carotide comune e interno / External Branching

1. Usando forbici e pinze chirurgiche, eseguire una incisione mediana superficiale nel collo, da sopra lo sterno al di sotto della ganascia (circa 3 - 4 cm). telo chirurgico deve essere collocato intorno alla zona intervento chirurgico per prevenire strumenti di venire in contatto con superfici non sterili. Il telo chirurgico è stato omesso nel video corrente per facilitare le riprese.
2. Utilizzando pinze, grassi accuratamente separato e del tessuto connettivo per esporre la trachea. Tissue dovrebbe facilmente e naturalmente separati per entrambe le parti.
3. Posizionare un cuscino (oggetto rotondo, circa 0,5 cm di diametro) sul retro del collo dei topi per estendere il collo, esponendo ulteriormente l'area per la chirurgia.
4. Aprire l'incisione utilizzando un divaricatore tissutale o ganci.
5. Sul lato sinistro dell'animale della trachea, accuratamente tweeze parte il tessuto connettivo per esporre sinistra arteria carotide comune (CCA). Fare attenzione a non danneggiare i nervi e le vene principali in bundle con il CCA.
6. Continuare ad esporre il CCA, facendo attenzione a staccarsi dal tessuto sottostante, ed esporre la parte superiore "Y" ramificazione dell'arteria cerebrale interna (ICA) e dell'arteria cerebrale esterna (ECA). Per aiutare a staccare la CCA, inserire le pinze curve sotto il CCA di perforare il tessuto connettivo e quindi consentire lentamente loro di aprire.

4. Preparazione della CCA per la MCAO sutura Insertion

1. Inserire 3 segmenti di sutura in nylon di circa 4 cm di lunghezza sotto il CCA. Assicurarsi che il CCA non è ritorto in quanto complicherebbe notevolmente l'inserimento della sutura.
2. Nel punto più basso possibile, chiudere la sutura fondo utilizzando un nodo permanente.
3. Legare la sutura alto appena sotto l'ICA / ECA ramificazione con un nodo scorsoio rimovibile.
4. Legare la sutura mezzo utilizzando un nodo scorsoio rimovibile, ma tenerlo spalancata. È importante lasciare molto spazio per non ostacolare l'inserimento di sutura.
5. Utilizzando microdissezione primavera scissors, effettuare un'incisione nel CCA tra il fondo e suture medie. Eseguire l'incisione 0,2 millimetri vicino alla sutura fondo.

5. occlusione dell'arteria cerebrale media

1. Utilizzando pinze, inserire la sutura MCAO nell'incisione CCA, guidandolo fino alla cima. Eseguire questo passaggio rapidamente dopo passo 4.5 per prevenire la coagulazione e la chiusura dell'apertura CCA. In caso di inserimento sutura è bloccato, utilizzare la punta delle pinze di riaprire l'incisione.
2. tie delicatamente la sutura centrale da parte di sutura silicone MCAO utilizzando un nodo scorsoio per limitare il flusso di sangue intorno ad esso, ma abbastanza largo da permettere di muoversi liberamente.
3. svitare con cautela la sutura in alto, facendo in modo che la sutura MCAO non scivoli via.
4. Inserire la sutura MCAO nella ICA da un paio di millimetri e quindi richiudere la sutura superiore, nello stesso modo come descritto al punto 5.2.
5. Guida la sutura MCAO alla occlusione. Indicazione di inserimento di successo èevidente dalla bassa quantità di riflusso del sangue dall'incisione CCA e che il marchio d'argento 9 millimetri si trova tra l'incisione CCA e la biforcazione ICA / ECA. Un'ulteriore conferma di occlusione successo può essere ottenuta utilizzando metodi di controllo, come un laser Doppler sistema di monitoraggio del flusso di sangue ^{15, 16.}
   NOTA: Una goccia nel 90% del flusso di sangue alla zona centrale del cervello sul lato dell'area occluso indica occlusione successo.
6. Dopo l'occlusione di successo, lega giù la sutura middle e top ermeticamente. Se si esegue l'inserimento farsa, non richiudere punti di sutura, ma invece subito passare al punto 7.3.

6. Incisione di chiusura e di assistenza post-operatoria

1. Tuck nei punti di sutura nella zona di incisione.
2. Rimuovere divaricatore o di tessuti ganci e cuscino.
3. Pulire l'area di sutura con soluzione fisiologica sterile e un batuffolo di cotone.
4. Chiudere l'incisione mediante sutura in nylon / ago e pinza.
5. Somministrare anti-infiammatori (ad esempio, Carprofen 10 mg / kg, sc) ed analgesico (es buprenorfina 0,1 mg / kg sc, due volte al giorno) farmaci per alleviare i disagi post-operatorio. Mettere i topi in una gabbia posta su un tappetino riscaldato per prevenire l'ipotermia e dare ad accesso labbro di acqua e cibo ammorbidito.
6. Monitorare il recupero degli animali (5 - 10 minuti) e per i segni di ictus. Essi possono variare da una paralisi laterale lieve e girando a grave contrazione del fianco controlaterale e laminazione. Diversi punti di valutazione sono elencati nella discussione. Animali che presentano segni di insufficienza respiratoria o di crisi epilettiche gravi dovrebbero essere eutanasia.
7. A seconda del protocollo di riperfusione ischemia, lasciare la sutura MCAO in atto da 30 minuti a 120 minuti o più. Ridurre il tempo di occlusione previene la mortalità.
8. Per l'occlusione permanente, lasciare la sutura MCAO sul posto per 24 ore, tuttavia significativo tasso di mortalità è da aspettarselo. Dopo questo lasso di tempo, procedere alla step 7.
   1. Se si utilizza il modello di occlusione permanente, tenere i topi in gabbia fino punto finale. A quel tempo, rimuovere le suture (passi 7,1-7,8). Questa procedura può essere eseguita dopo l'eutanasia.

7. riperfusione

1. Anestetizzare l'animale di nuovo (seguire le istruzioni in 2.1) e rimuovere punti di sutura chiusura della ferita.
2. Utilizzando pinze e separatori di tessuto, riaprire l'incisione ed esporre il CCA.
3. Rimuovere con attenzione la sutura superiore e tirare delicatamente la sutura MCAO fino a quando la parte rivestito di silicone è situato al nodo centrale.
4. Ripeti il ​​nodo superiore sulla sutura per evitare che il sangue scorra passare la sutura (non deve essere un nodo di slittamento).
5. disfare con attenzione il nodo centrale e tirare la sutura passato, il nodo in alto, ma tenerlo all'interno del CCA.
6. Strettamente chiudere il nodo in alto per bloccare il flusso di sangue dell'arteria.
7. Estrarre completamente la sutura MCAO e chiudere ermeticamente il nodo centrale.
8. La sutura MCAO può essereriutilizzato più volte. Dopo ogni utilizzo, pulire accuratamente la sutura nel 70% di etanolo per rimuovere i contaminanti (ad esempio, sangue o tessuti) utilizzando una garza sterile. Successivamente, posizionare la sutura in un sacchetto sterilizzatrice e sterilizzarlo.
9. Ripetere i passaggi 6,1-6,4 e monitorare il recupero degli animali.

Analisi 8. Tissue

1. Per monitorare gittata sistolica, sezionare il cervello.
   1. Euthanize il mouse usando un processo a due fasi. In primo luogo, esporre l'animale a una dose eccessiva di isoflurano fino smette di respirare. Per la colorazione TTC, decapitare il mouse immediatamente e procedere all'estrazione del cervello. Per il cervello sezionamento (ad esempio, per le analisi immunostaining), eseguire perfusione attraverso una puntura cardiaca prima di decapitazione.
   2. Cut-off testa alla base del cranio e tagliare il cuoio capelluto dall'apertura collo alla parte superiore del cranio fino a tra gli occhi. Con il cranio esposto, tagliare l'osso lungo entrambi i lati a partire dall'apertura base cranicafino alla cavità oculare. Rendere questo taglio lungo l'ampia parte del cranio. Fare attenzione a non arrivare troppo in profondità con le forbici per evitare di danneggiare il cervello.
   3. Successivamente, tagliare l'osso tra le due orbite.
2. Utilizzando pinze, sollevare la parte superiore del cranio per esporre il cervello. Ci dovrebbe essere solo una piccola resistenza. Se non si solleva con facilità, incisioni cranio possono essere incomplete. Facendo leva, togliere il cervello delicatamente con pinze curve smussate. Il cervello potrebbe essere ancora attaccato da diversi nervi. Procedete lentamente, rimuovere gli allegati lungo la strada.
3. Posizionare il cervello fresco in una matrice cerebrale 1 mm aggiungere un paio di gocce di PBS, e tagliare lungo la matrice utilizzando una lametta o lama criostato.
4. Trasferire il cervello di un piatto 100 mm e aggiungere soluzione colorante (2% di cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio [TTC] disciolto in PBS) per coprire il fondo del piatto. Utilizzando due pinze, separata tutti fettine cerebrali (rivolto verso il basso) e metterli in ordine al fondo del piatto.
   NOTA: La colorazione diventerà tessuto vitale rosso, con i tessuti non vitali restante bianco. Il riscaldamento della soluzione a 37 ° C accelererà colorazione. Segni di zona corsa (bianco) possono essere visti nel più breve tempo 90 minuti dopo ictus e rimangono visibili per più di 7 giorni. Imaging dovrebbe essere fatto con un righello per consentire il calcolo della gittata sistolica.
5. Cervelli di processo sezionato per sezionamento, immuno-colorazione, isolamento delle proteine, o una varietà di altre procedure di ^{17, 18, 19.}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Il percorso di inserimento per la sutura occlusione viene mostrato in Figura 1. La sutura MCAO deve essere instradato verso l'area di occlusione, biforcano in ICA. l'occlusione di successo del MCA porterà a lesioni dei tessuti, visibile attraverso la colorazione TTC. La figura 2 presenta le immagini di colorazione da sham trattati animale (Figura 2A) e da un 60 min MCAO ischemia riperfusione animale (colorazione a 90 minuti o 24...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

L'utilizzo efficace del metodo MCAO descritto è fortemente dipendente dalla comprensione dei cerebrale dell'anatomia flusso sanguigno. Poiché il corretto posizionamento della sutura è difficile distinguere a causa della mancanza di indizi visivi diretti, pratica ripetuta è importante avere il procedimento prima di utilizzarlo per studi investigativi. gittata sistolica dovrebbe essere analizzato per garantire risultati coerenti. L'aggiunta di un sistema laser Doppler può aiutare a determinare l'occlu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCAO suture 0.23 mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21 mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 - LDPM