Induction de l'AVC ischémique et ischémie-reperfusion chez la souris Utilisation de l'artère moyenne Occlusion Technique et visualisation des Infarctus Zone

Résumé

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Résumé

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Introduction

L'étude des maladies cardiovasculaires, telles qu'un accident vasculaire cérébral, repose sur l'utilisation de modèles in vivo. Pour comprendre l'implication éventuelle d'une ischémie, une toxicité médicamenteuse et / ou le traitement, il est nécessaire d'utiliser un modèle approprié, normalisé, fiable et reproductible de la maladie, ce qui permet des études comparatives entre les groupes de traitement. Dans ce manuscrit, nous utilisons des souris, étant donné la disponibilité d'un grand nombre de souris transgéniques et des modèles d'évaluation normalisés. Ratisser scores pour évaluer moteur et le comportement des déficits après un AVC ischémique expérimentale et la récupération après avoir été mis au point ^{1, 2.}

Plusieurs modèles d'AVC ischémiques sont disponibles, tels que l'ischémie complète mondiale cérébrale, une ischémie globale incomplète, l'ischémie cérébrale multifocale et ischémie cérébrale focale. Ce dernier groupe est également la catégorie d'accident vasculaire cérébral le plus répandu chez les patients. La majorité de la veillents sont initiées par la formation d'une occlusion thrombotique ou embolique au niveau ou à proximité de l'artère cérébrale moyenne (MCA). Compte tenu de ces paramètres, le modèle présenté étroitement imite l' étiologie de la maladie d'accident vasculaire cérébral humain et rend les résultats obtenus très pertinents ^3. Néanmoins, la traduction des découvertes de modèles animaux au traitement de la maladie chez les humains est avérée difficile. Jusqu'à présent, seule l'utilisation du tissu thrombolytique activateur du plasminogène a été approuvé pour le traitement de l' AVC ischémique aigu ^4.

Parmi les modèles d'ischémie focale cérébrale chez la souris, postérieure modèle de course de la circulation cérébrale et cérébrale modèle de thrombose veineuse sont très invasive, diminuant leur applicabilité et de restreindre l'éventail des analyses qui peuvent être effectuées. Cependant, d'autres techniques, telles que le modèle de protection embolique, le modèle de photothrombosis, le modèle de course endothéline-1 induite par suture intraluminale et une occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) modèle, sont disponibles pour une utilisation sans ces limitations. Le modèle MCAO est une technique décrite dans ce protocole. Il offre une méthode fiable d'induire une ischémie cérébrale focale qui peut être facilement reperfusé et exécutée de manière à haut débit. Il existe deux approches de ce modèle, à savoir, les méthodes Zea-Longa et Koizumi. Ils diffèrent légèrement dans le sens de la suture d'occlusion est inséré dans le système vasculaire. Dans la technique Zea-Longa, le fil de suture est insérée par l' intermédiaire de l'artère carotide externe ^5. La technique présentée ici est modifiée à partir de la méthode Koizumi dans laquelle la suture occlusive est introduit par l'artère carotide commune ^6.

Le modèle MCAO a été appliquée avec succès pour évaluer les différents événements qui se produisent au cours de l'AVC ischémique. Après reperfusion, l'oedème cérébral peut être observé avec la rupture de la barrière hémato-encéphalique. la mort neuronale de pointe est généralement observée à 24 h; cependant, il rese tourne vers les niveaux de base au bout de 7 jours ^7. Chez l' homme, le sexe et l' âge sont des variables importantes pour déterminer la course des résultats, ce qui est également observée chez les souris et les rats ^{8, 9, 10.} Plusieurs publications ont utilisé le modèle MCAO pour démontrer l' efficacité du traitement ^{11, 12, 13, 14.}

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par l'Université de Miami Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC) en conformité avec les National Institutes of Health (NIH) des lignes directrices. L'utilisation de matériel stérile et des techniques d'asepsie est nécessaire.

1. Préparation de l'Occlusion Suture

1. Utiliser un fil de diamètre 0,21 mm pour les souris entre 20 à 25 g et 0,23 mm pour les souris entre 25-35 g de poids corporel. Le choix du type de sutures pour la procédure MCAO est fonction du poids des animaux.
2. L'utilisation d'un stylo en argent, marquer la suture à 9 mm à partir de la pointe en silicone enduite. Cela servira de guide pour la longueur d'insertion.

2. Préparation pour la chirurgie

1. Anesthésier souris avec de l'isoflurane mélangé avec de l'oxygène, en utilisant un système de laboratoire de l'anesthésie. Utilisez isoflurane au réglage 5 et le débit d'oxygène à 2 sur la machine commerciale (voir le tableau Matériaux). Transfert de l'animal à l'surgersurface y et maintenir l'anesthésie en utilisant un cône de nez (utilisation réglage 1,5 isoflurane - 2,5 et de l'oxygène débit à 2).
   1. Assurez-vous que la fréquence respiratoire de la souris est d'environ 1 - 2 respiration par seconde sans haleter. En outre, veiller à ce que l'animal ne présente pas de réaction de stimulation des moustaches et de la pédale réflexe (pincement de l'orteil). Surveiller le taux de respiration et d'efforts au cours de la chirurgie, au moins tous les 5 min.
2. Mettre une goutte de lubrifiant ophtalmique sur chaque œil à l'aide d'un écouvillon stérile pour les empêcher de sécher pendant la procédure. Vous pouvez également appliquer une pommade ophtalmique à l'oeil d'un tube pharmaceutique stérile.
3. Retournez l'animal sur son dos et se raser la zone d'incision. Par la suite, complètement désinfecter la zone d'opération chirurgicale en utilisant 70% d'éthanol, suivi par la chlorhexidine, et le tampon final avec 70% d'éthanol. Placez l'animal sur une surface chaude chirurgicale sous un stéréomicroscope.

3. Dissection de l'artère carotide commune et interne / Externe Branching

1. Avec des ciseaux et des pinces chirurgicales, effectuer une incision médiane peu profonde dans le cou, au-dessus du sternum au-dessous de la mâchoire (environ 3 - 4 cm). Champ opératoire doit être placé autour de la zone d'intervention chirurgicale pour empêcher des instruments de venir en contact avec les surfaces non stériles. Le champ opératoire a été omis dans la vidéo en cours pour faciliter le tournage.
2. En utilisant des pinces, gras soigneusement séparé et le tissu conjonctif pour exposer la trachée. Les tissus doivent facilement et naturellement séparer les deux parties.
3. Placer un oreiller (objet rond, d'environ 0,5 cm de diamètre) au dos du col de la souris pour étendre le col, ce qui expose en outre la zone pour la chirurgie.
4. Ouvrez l'incision en utilisant soit un écarteur de tissus ou des crochets.
5. Sur le côté gauche de la trachée de l'animal, tweeze avec précaution le tissu conjonctif pour exposer l'artère carotide commune gauche (CCA). Faites attention à ne pas endommager les nerfs et les veines principales fournies avec le CCA.
6. Continuer d'exposer le CCA, en prenant soin de se détacher de tissu sous-jacent, et d'exposer la partie supérieure "Y" ramification de l'artère cérébrale interne (ICA) et de l'artère cérébrale externe (ECA). Pour aider à détacher le CCA, insérez la pince courbés sous la CCA pour percer le tissu conjonctif et permettent lentement leur ouverture.

4. Préparation de la CCA pour la MCAO Suture Insertion

1. Insérez 3 segments de suture en nylon d'environ 4 cm de longueur dans le cadre du CCA. Assurez-vous que le CCA est pas tordue car cela radicalement compliquer l'insertion de la suture.
2. Au point le plus bas possible, fermer la suture en bas en utilisant un noeud permanent.
3. Attachez le fil de suture supérieure juste en dessous de l'ICA / ECA ramification en utilisant un noeud coulant amovible.
4. Attachez le fil de suture milieu à l'aide d'un noeud coulant amovible, mais le garder ouverte. Il est important de laisser beaucoup d'espace pour ne pas gêner l'insertion de fil de suture.
5. Utilisation de microdissection ressort scissors, effectuer une incision dans le CCA entre le fond et les sutures du milieu. Effectuer 0,2 mm incision près de la suture en bas.

5. Moyen Cerebral Artery Occlusion

1. En utilisant des pinces, insérez la suture MCAO dans l'incision CCA, guidant jusqu'au sommet. Effectuez cette étape rapidement après l'étape 4.5 pour empêcher la coagulation et la fermeture de l'ouverture CCA. Dans le cas où l'insertion de fil de suture est bloqué, en utilisant les pointes de pinces pour rouvrir l'incision.
2. attacher doucement la suture du milieu sur la partie de suture en silicone MCAO en utilisant un noeud coulant pour restreindre le flux sanguin autour de lui, mais assez lâche pour lui permettre de se déplacer librement.
3. défaire délicatement la suture en haut, faire en sorte que la suture MCAO ne glisse pas.
4. Insérez la suture MCAO dans l'ICA par un couple de millimètres, puis refermer la suture en haut, de la même manière que celle décrite à l'étape 5.2.
5. Guider le fil de suture MCAO à la zone d'occlusion. Indication d'insertion réussie estévident par la faible quantité de reflux de sang de l'incision CCA et que la marque mm argent 9 est situé entre l'incision CCA et la bifurcation ICA / CEA. Une confirmation supplémentaire de l' occlusion réussie peut être obtenue en utilisant des méthodes de surveillance , tel qu'un système de surveillance du flux sanguin Doppler à laser ^{15, 16.}
   Remarque: Une baisse de 90% du flux sanguin vers la région du cerveau du milieu sur le côté de la zone occluse indique une occlusion réussie.
6. Après occlusion réussie, attacher la suture milieu et haut hermétiquement. Si vous effectuez une insertion fictive, ne pas réenclencher sutures, mais passez à la place immédiatement à l'étape 7.3.

6. Incision clôture et des soins post-opératoires

1. Rentrage des fils de suture dans la zone de l'incision.
2. Retirer écarteur ou de tissus crochets et oreiller.
3. zone de suture Nettoyer avec une solution saline stérile et un coton-tige.
4. Fermer l'incision en utilisant suture en nylon / aiguille et pince.
5. Administrer anti-inflammatoire (par exemple, carprofène 10 mg / kg, sc) et analgésique (par exemple, buprénorphine 0,1 mg / kg sc, deux fois par jour) des médicaments pour soulager l' inconfort post-opératoire. Placez la souris dans une cage placée sur un coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie et de donner accès labium publicitaire à l'eau et la nourriture ramolli.
6. Surveiller la récupération des animaux (5 - 10 min) et des signes d'accident vasculaire cérébral. Ils peuvent varier d'une paralysie latérale légère et indirecte à la contraction sévère du flanc controlatéral et le laminage. Plusieurs points d'évaluation sont répertoriés dans la discussion. Les animaux présentant des signes de détresse respiratoire ou des convulsions sévères doivent être euthanasiés.
7. Selon l'ischémie reperfusion protocole, laisser la suture MCAO en place à partir de 30 min à 120 min ou plus. La réduction du temps d'occlusion empêche la mortalité.
8. Pour une occlusion permanente, laisser la suture MCAO en place pendant 24 heures, mais le taux de mortalité importante est à prévoir. Après ce laps de temps, passez à step 7.
   1. Si vous utilisez le modèle d'occlusion permanente, gardez la souris en cage jusqu'à ce point final. À ce moment, retirer suture (étapes 7/1 à 7/8). Cette procédure peut également être réalisée après l'euthanasie.

7. reperfusion

1. Anesthetize l'animal à nouveau (suivre les instructions de 2.1) et enlever les sutures de fermeture de la plaie.
2. En utilisant des pinces et des séparateurs de tissus, ré-ouvrir l'incision et exposer le CCA.
3. Retirez délicatement la suture en haut et tirez doucement sur la suture MCAO jusqu'à ce que la partie revêtue de silicone est situé au nœud du milieu.
4. Refaire le chignon sur la suture pour empêcher le sang de couler passer la suture (il ne doit pas être un nœud coulant).
5. défaire délicatement le nœud du milieu et tirer le fil de suture passé le nœud en haut, mais gardez à l'intérieur du CCA.
6. Bien refermer le nœud haut pour bloquer le flux sanguin de l'artère.
7. Retirez complètement la suture MCAO et fermer hermétiquement le nœud du milieu.
8. La suture MCAO peut êtreréutilisé plusieurs fois. Après chaque utilisation, nettoyer la suture soigneusement dans 70% d' éthanol pour éliminer les contaminants (par exemple, du sang ou des tissus) en utilisant une gaze stérile. Ensuite, placer la suture dans une poche de stérilisateur et le stériliser.
9. Répétez les étapes 6.1 à 6.4 et surveiller la récupération des animaux.

8. Analyse tissulaire

1. Pour contrôler le volume systolique, disséquer le cerveau.
   1. Euthanize la souris en utilisant un procédé en deux étapes. Tout d'abord, exposer l'animal à une surdose de isoflurane jusqu'à l'arrêt respiratoire. Pour la coloration TTC, décapite la souris immédiatement et procéder à l'extraction du cerveau. Pour le cerveau sectionnant (par exemple, pour les analyses immunocoloration), effectuer la perfusion via une ponction cardiaque avant la décapitation.
   2. Cut-off la tête à la base du crâne et couper le cuir chevelu de l'ouverture du col au sommet du crâne jusqu'à entre les yeux. Avec le crâne exposé, couper l'os le long des deux côtés à partir de l'ouverture de la base du crâneà la cavité oculaire. Faire de cette coupe le long de la grande partie du crâne. Veillez à ne pas atteindre trop profond avec des ciseaux pour éviter d'endommager le cerveau.
   3. Ensuite, couper l'os entre les deux orbites.
2. En utilisant des pinces, soulevez le haut du crâne pour exposer le cerveau. Il devrait y avoir seulement une petite résistance. Si elle ne se soulève pas facilement, incisions du crâne peuvent être incomplètes. Soulever le cerveau doucement à l'aide des pinces courbes émoussées. Le cerveau pourrait encore être fixé par plusieurs nerfs. Procédez lentement, en supprimant les pièces jointes le long du chemin.
3. Placer le cerveau frais dans une matrice de cerveau de 1 mm, ajouter quelques gouttes de PBS, et on tranche le long de la matrice à l'aide d'une lame de rasoir ou une lame de cryostat.
4. Transférer le cerveau à un mm plat 100 et ajouter la solution de coloration (2% de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium [TTC] dissous dans du PBS) pour couvrir le fond du plat. En utilisant deux pinces, séparée toutes les tranches de cerveau (face vers le bas) et placez-les dans l'ordre au fond du plat.
   NOTE: Coloration tournera tissu viable rouge, avec un tissu non viable restant blanc. Réchauffer la solution à 37 ° C va accélérer la coloration. Les signes de la zone de course (blanc) peut être vu aussi rapidement que post-AVC 90 min et restent visibles pendant plus de 7 jours. L'imagerie doit être fait avec une règle pour permettre le calcul du volume de course.
5. Processus disséqué les cerveaux pour sectionner, immuno-coloration, l' isolement de la protéine, ou une variété d'autres procédures ^{17, 18, 19.}

Résultats

La voie d'insertion du fil de suture d'occlusion est mise en évidence sur la figure 1. La suture MCAO doit être acheminé vers la zone d'occlusion, bifurquant dans l'ICA. occlusion réussie du MCA va conduire à une lésion tissulaire, visible par coloration TTC. La figure 2 présente des images de coloration de simulacre animal traité (figure 2A) et d'un 60 min MCAO ischémie reperfusion animale (coloration à 90 ...

Discussion

L'utilisation réussie de la méthode MCAO décrite est très dépendante de la compréhension de l'anatomie cérébrale du flux sanguin. Depuis la mise en place correcte de la suture est difficile à discerner en raison de l'absence d'indices visuels directs, la pratique répétée est important de maîtriser la procédure avant de l'utiliser pour des études d'investigation. Le volume systolique devrait être analysé afin d'assurer des résultats cohérents. L'ajout d'un système d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCAO suture 0.23 mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21 mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 - LDPM