缺血性中风和缺血再灌注小鼠的诱导使用梗塞区的中心动脉闭塞技术和可视化

摘要

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

摘要

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

引言

心血管疾病的研究中，如中风，依赖于使用的体内模型。理解局部缺血，药物毒性，和/或治疗的可能含义，有必要使用该疾病，从而使治疗组之间的比较研究的一个合适的，标准化的，可靠的和可再现的模型。在这个手稿中，我们使用的是老鼠，给予了大量的转基因小鼠和标准化的评估模型的有效性。耙分数来评估以下的实验缺血性卒中及以下恢复运动和行为障碍已经开发的^1，2。

几个缺血性中风型号可供选择，如完整的全球脑缺血，不完全性缺血，多灶性脑缺血和脑缺血。后一组也是中风患者最常见的种类。大多数前夕NTS由栓塞或血栓闭塞的形成在或接近大脑中动脉（MCA）发起。鉴于这些参数，紧紧提出的模型模拟人类中风的疾病的病因，使获得高度相关的^3个结果。尽管如此，从动物模型在人类疾病治疗的发现的翻译已被证明是具有挑战性的。截至目前，只有使用溶栓组织型纤溶酶原激活物已被批准用于治疗急性缺血性脑卒中^4。

间在小鼠脑缺血，大脑后循环中风模型和脑静脉血栓形成模型的模型是高度侵入性，减少它们的适用性，并限制能够进行分析的范围。然而，其他技术如栓塞模型，photothrombosis模型，内皮素-1诱导的中风模型，和管腔内缝合大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，可用于使用没有这些限制。在缺血模型在本协议中所述的技术。它提供了诱导可以容易地再灌注，并在高通量的方式进行局部脑缺血的可靠方法。有两种方法这一模式，即玉米，龙格和小泉的方法。它们在闭塞缝合插入脉管的方式略有不同。在玉米-隆加技术，缝线经由外颈动脉⁵插入。这里提出的技术是从在其中封闭缝合经由颈总动脉⁶插入小泉方法改性。

该MCAO模型已成功地应用于评估缺血性中风期间发生的不同事件。以下再灌注，脑水肿可以与血脑屏障的击穿可以观察到沿。山顶神经元死亡通常在24小时观察;然而，将其重新后7天⁷转动到基线水平。在人类中，性别和年龄的确定行程结果时，这也将在小鼠和大鼠^8，9，10观察的重要变量。若干出版物已经使用了MCAO模型以证明处理效率^{11，12，13，14。}

研究方案

所有的程序是由迈阿密机构动物护理和使用委员会（IACUC）的大学按照卫生研究院（NIH）的指导方针的国家机构的批准。需要无菌设备和无菌技术的使用。

1.准备缝合闭塞

1. 使用直径0.21毫米的缝合线20之间的小鼠 - 25克0.23毫米至25只小鼠 - 35克体重的。缝线的MCAO程序的类型的选择取决于动物的体重。
2. 使用银笔，标记从涂硅尖开始9毫米缝合。这将作为插入长度的导向。

2.准备手术

1. 麻醉小鼠用异氟烷与氧混合，用实验室麻醉系统。在凌晨2商用机器上设置5和氧气流量使用异氟醚（见材料表 ）。动物转移到surgerŸ表面用鼻锥维持麻醉（异氟烷使用1.5设置 - 在2 2.5和氧气流量）。
   1. 确保鼠标的呼吸率约为1 - 每秒2呼吸喘气没有。此外，确保动物不会出现晶须刺激的反应和踏板反射（趾捏）。监控呼吸率和精力的手术过程中，至少每5分钟。
2. 放眼用润滑剂上每只眼睛一滴使用无菌拭子，以防止它们在手术过程中进行干燥。可替代地，从一个无菌药物管适用眼药膏的眼球。
3. 翻转在它的后面的动物和刮胡子切口区域。之后，彻底消毒用70％的乙醇，接着洗必泰，并用70％乙醇的最终拭子的外科手术区域。放置在一个温暖的手术表面的动物立体显微镜下。

3.颈总动脉夹层和内部/ EXTERNAL分支

1. 用手术剪和镊子，在颈部执行浅中线切口，从乳房骨上面的下颚下面（大约3 - 第4厘米）。手术单应放在周围的手术区域，以防止仪器从与非无菌表面接触。外科被单在当前视频省略以有助于成膜。
2. 使用镊子，仔细分离脂肪和结缔组织暴露气管。组织应该轻松，自然分开双方。
3. 放置在小鼠的颈背部枕头（圆形物体，约0.5厘米，直径），以延伸颈部，进一步暴露手术的区域。
4. 打开使用一个组织牵开器或钩切口。
5. 上气管的动物的左侧，小心tweeze相距结缔组织以暴露左颈总动脉（CCA）。要小心，不要损坏与CCA捆绑的神经和主脉。
6. 继续露出CCA，小心翼翼地从底层组织分离，并露出顶部"Y"分支内部的脑动脉（ICA）和外部脑动脉（ECA）的。要卸下CCA帮助，将CCA下弯钳刺穿结缔组织，然后慢慢让他们打开。

4.制备CCA为缺血缝线插针

1. 插入的长度约4厘米的CCA下尼龙缝线的3段。确保CCA不扭曲，因为这将极大地缝合线的插入变得复杂。
2. 在最低点可能，使用永久结关闭底部缝合。
3. 领带就在ICA下方的顶缝/ ECA分支使用可移动的滑结。
4. 配合使用可移动滑结中间缝合，但保持敞开的。它离开足够的空间是重要的，因为不阻碍缝合插入。
5. 采用显微春天科幻ssors，在CCA进行底部和中部之间缝合切口。执行0.2毫米的切口接近底部缝合。

5.大脑中动脉闭塞

1. 使用镊子，将缝线缺血进入CCA切口，引导其到顶部。 4.5步后迅速执行此步骤，以防止CCA开放的凝血和关闭。在缝合插入受阻的情况下，用钳提示重新打开切口。
2. 轻轻用滑结，以限制其周围血流阕中间缝合在MCAO缝合硅氧烷部分，但足够宽松以允许其自由移动。
3. 仔细撤消顶部缝合，确保了缺血缝合不滑出。
4. 通过几毫米的插入中的ICA的MCAO缝合，然后重新关闭的顶部缝合，以相同的方式如在步骤5.2中描述。
5. 引导缺血缝合到闭塞区域。成功插入指示从CCA切口少量血液回流的，而且银9毫米明显的标志是位于CCA切口和ICA / ECA分叉之间。可使用的监测方法如激光多普勒血流监测系统^15，16来获得成功闭塞进一步确认。
   注:在血流90％A下降至在闭塞区域侧中部脑区域表示成功闭塞。
6. 成功闭塞后，紧紧牵制中部和顶部缝合。如果执行假的插入，不重合缝合而是立即跳到步骤7.3。

6.切口关闭和术后护理

1. 塔克在缝线到切口区域。
2. 删除拉钩或组织挂钩和枕头。
3. 使用无菌盐水和棉签清洁缝合区。
4. 关闭使用尼龙线/针和镊子的切口。
<利>管理抗炎（ 例如 ，卡洛芬10毫克/千克，SC）和镇痛药（ 例如 ，丁丙诺啡0.1毫克/千克SC，每天两次）的药物，以减轻术后不适。放置在老鼠放在一个加热垫一个笼子里，以防止低温和给水软化食品广告阴唇访问。
5. 监测动物的恢复（5 - 10分钟）和中风的迹象。他们可以从轻度麻痹侧各不相同，盘旋对侧侧翼和滚动的剧烈收缩。几个评价观点中列出了讨论。显示呼吸窘迫或严重癫痫发作的迹象动物应实施安乐死。
6. 取决于缺血再灌注协议，从30分钟到120分钟或更离开代替MCAO缝合。减少阻塞时间，可以防止死亡。
7. 对于永久性闭塞，留在原地的缝合缺血24小时，但显著的死亡率是可以预期的。这段时间过去后，继续STE第7页。
   1. 如果使用永久性闭塞模型，养老鼠笼，直到终点。当时，去除缝线（步骤7.1到7.8）。这个过程也可以安乐死之后进行。

7.再灌注

1. 再次麻醉动物（按照2.1的说明），并删除创伤闭合缝线。
2. 使用镊子和组织分离器，重新打开切口暴露CCA。
3. 小心取出顶部缝合，直到涂硅部分位于中间结对缺血缝合轻轻一拉。
4. 重做在缝合顶端结防止血液流入通过缝合（它不必是一滑结）。
5. 仔细撤消中间结，拉动缝线过去结顶，但保持了CCA内。
6. 盖紧结顶阻断动脉血流。
7. 拉出完全缺血缝合然后拧紧中间结。
8. 在MCAO缝合可以是重复使用几次。在每次使用后，仔细清洁缝合在70％乙醇以除去使用无菌纱布的污染物（ 例如 ，血液或组织）。之后，放置在消毒袋缝合和消毒它。
9. 重复步骤6.1 - 6.4和监视动物的恢复。

8.组织分析

1. 为了监测每搏输出量，剖析了大脑。
   1. 使用两步骤过程安乐死鼠标。首先，暴露动物异氟醚过量，直到呼吸停止。对于TTC染色，立即斩首鼠标进行脑部提取。脑切片（ 如用于免疫分析），通过前一个斩首心脏穿刺灌注执行。
   2. 切断在颅底头和切断从颈部开口的头骨顶部的头皮到眼睛之间。与颅骨外露，切沿两侧从颅底开始开骨到眼窝。使沿着头骨的一部分，广本晋级。要小心，不要达到用剪刀剪，以免损坏大脑太深。
   3. 此后，切两眼窝之间的骨头。
2. 使用镊子，抬起头颅顶部，露出大脑。应该只有一个小的阻力。如果不轻松举起，头骨切口可能不完整。撬出轻轻用钝弯钳大脑。大脑仍可能由几个神经被连接。继续慢慢地，沿途移除附件。
3. 放置新鲜脑在1毫米大脑基质，加入一对的PBS滴，并沿着用剃刀刀片或低温恒温器叶片基质切片。
4. 脑转移到100mm培养皿，并添加染色溶液（2％2,3,5-氯化三苯四唑溶解在PBS [TTC]）以覆盖培养皿的底部。使用两个镊子，独立的所有脑切片（正面朝下），并将其放置，以便在培养皿的底部。
   注:染色会变成活组织的红色，与非活组织剩余的白色。温热该溶液至37℃将加速染色。中风面积（白色）的症状可以迅速视为90分钟后中风且持续超过7天可见。成像应做连同一把尺子，使每搏输出量计算。
5. 过程解剖大脑用于切片，免疫染色，蛋白质分离，或各种其他程序^{17，18，19。}

结果

为闭塞缝线的插入路径是表现在图1中 。在MCAO缝合要被路由到闭塞区域，在ICA中分叉。马华的成功闭塞会导致组织损伤，TTC染色可见。 图2呈现从假治疗的动物（ 图2A）和从60分钟缺血缺血再灌注动物染色的图像（染色，在90分钟或24小时后的闭塞， 图2B）。为了确定每搏量，首先计算行程区的每个部分中，使用包括在成像...

讨论

所描述的MCAO方法的成功应用是高度依赖于脑血流解剖学的理解。由于缝合线的正确位置是难以辨别，由于缺乏直接的视觉线索，反复练习很重要，将其用于调查研究之前掌握的过程。行程容积应分析，以确保一致的结果。增加了一个激光多普勒系统可以帮助确定血流的成功闭塞和应定期使用，以确保过程正确进行。路由MCAO缝合到闭塞区域可以通过操纵动脉来促进。为了帮助在缝线引导至MCA，一?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCAO suture 0.23 mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21 mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 - LDPM