Индукционная ишемического инсульта и ишемии-реперфузии у мышей с помощью средней артерии Occlusion Техника и визуализация площади инфаркта

Резюме

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Аннотация

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Введение

Исследование сердечно - сосудистых заболеваний, таких как инсульт, основывается на использовании моделей в естественных условиях. Для того, чтобы понять, возможной причастности ишемии, лекарственной токсичности, и / или лечения, необходимо использовать подходящий, стандартизированную, надежную и воспроизводимую модель болезни, которая позволяет сравнительные исследования между группами лечения. В этой рукописи, мы используем мышей, учитывая наличие большого количества трансгенных мышей и моделей стандартизированные оценки. Боковое баллов для оценки двигательных и поведение дефицита после экспериментального ишемического инсульта и последующего восстановления были разработаны ^{1, 2.}

Несколько ишемические модели инсульта доступны, такие как полный глобальной ишемии головного мозга, неполной глобальной ишемии, мультифокальной ишемии головного мозга и очаговой ишемии головного мозга. Последняя группа также категория инсульта наиболее распространенных у пациентов. Большинство наканунеNTS инициируются образованием эмболии или тромботической окклюзии на или вблизи средней мозговой артерии (СМА). Учитывая эти параметры, модель , представленная точно имитирует этиологию заболевания человеческого инсульта и делает полученные результаты весьма актуальной ^3. Тем не менее, перевод открытий от моделей животных к лечению заболевания у людей, оказалось сложной задачей. До сих пор, только использование активатора плазминогена тромболитическая ткани был одобрен для лечения острого ишемического инсульта ^4.

Среди моделей очаговой ишемии головного мозга у мышей, задней мозговой модели циркуляции инсульта и церебрального венозного тромбоза на экспериментальной модели сильно инвазивные, уменьшая их применимости и ограничения диапазона анализов, которые могут быть выполнены. Тем не менее, другие методы, такие как эмболии модели, фототромбоза модели, эндотелин-1 модели индуцированного инсульта и внутрипросветное шовного окклюзии средней мозговой артерии (МСАО) модели, доступны для использования без таких ограничений. Модель МСАО представляет собой способ, описанный в данном протоколе. Он предлагает надежный способ индукции очаговой ишемии головного мозга, которые могут быть легко реперфузии и выполняются в высокой пропускной образом. Есть два подхода к этой модели, а именно, методы Zea-Лонга и Коидзуми. Они немного отличаются по тому, как окклюзия шовный вставляется в сосудистую сеть. В технике Zea-Лонга, шовный материал вставляется через наружную сонную артерию ^5. Методика представлена здесь модифицирован из метода Коидзуми , в котором поглощающий шовный материал вставляется через общую сонную артерию ^6.

Модель MCAO была успешно применена для оценки различных событий, происходящих во время ишемического инсульта. После реперфузии, отек головного мозга может наблюдаться наряду с разрушением гематоэнцефалического барьера. Пик гибели нейронов обычно наблюдается через 24 часа; Тем не менее, она вновьповорачивается к исходному уровню через 7 дней ^7. У людей, пол и возраст являются важными факторами при определении исхода инсульта, это также наблюдается у мышей и крыс ^{8, 9, 10.} Несколько публикаций использовали модель МСАО , чтобы продемонстрировать эффективность обработки ^{11, 12, 13, 14.}

протокол

Все процедуры были одобрены Университета Майами Institutional уходу и использованию животных комитета (IACUC) в соответствии с национальными институтами здоровья руководящих принципов (NIH). Использование стерильно оборудования и асептики требуется.

1. Подготовка Occlusion Шов

1. С помощью шовного материала диаметром 0,21 мм для мышей между 20 - 25 г и 0,23 мм для мышей с 25 - 35 г массы тела. Выбор типа шовного материала для процедуры MCAO зависит от массы животного.
2. Используя серебряную ручку, отметьте шовный материал на 9 мм, начиная с силиконовым покрытием наконечника. Это будет служить в качестве руководства для длины вставки.

2. Подготовка к хирургии

1. Обезболить мышь с изофлуран в смеси с кислородом, с использованием лабораторной системы анестезии. Используйте изофлуран при установке 5 и поток кислорода в 2 на коммерческой машине (см Материалы таблицу). Перевести животное в Surgerу поверхности и поддержания анестезии с использованием носовой конус (используйте настройки 1.5 изофлуран - 2,5 и кислорода поток в 2).
   1. Убедитесь в том, что частота дыхания мыши составляет около 1 - 2 дыхания в секунду без задыхаться. Кроме того, убедитесь, что животное не проявляет усов реакции стимуляции и педали рефлекс (носок щепотку). Монитор частоты дыхания и сил во время операции, по крайней мере, каждые 5 мин.
2. Нанесите каплю офтальмологических смазки на каждый глаз, используя стерильный тампон, чтобы предотвратить их от высыхания во время процедуры. В качестве альтернативы, применять глазной мази для глаз из стерильной фармацевтической трубки.
3. Флип животное на его спине и бритье области надреза. После этого тщательно продезинфицировать область хирургии с использованием 70% этанола, а затем хлоргексидин, а окончательный тампон с 70% этанола. Поместите животное на теплой хирургической поверхности под стереомикроскопа.

3. Рассечение общей сонной артерии и внутренней / External Ветвление

1. Используя хирургические ножницы и пинцет, выполняют неглубокую срединный разрез в области шеи, сверху грудной кости ниже челюсти (примерно 3 - 4 см). Хирургическое драпировки должны быть размещены вокруг области хирургии, чтобы предотвратить инструменты от контакта с нестерильных поверхностей. Хирургический драпировка была опущена в текущем видео, чтобы помочь видеосъемку.
2. Использование щипцов, тщательно отдельный жировой и соединительной ткани подвергать трахеи. Ткань должна легко и естественно разделить с обеих сторон.
3. Поместите подушку (круглый предмет, около 0,5 см в диаметре) на задней стороне шеи мышей продлить шеи, далее подвергая область для хирургического вмешательства.
4. Откройте надрез, используя либо механизм втягивания ткани или крючки.
5. На левой стороне животного трахеи, тщательно выщипывать друг от друга соединительной ткани, чтобы выставить левую общую сонную артерию (CCA). Будьте осторожны, чтобы не повредить нервы и крупные вены в комплекте с ОАС.
6. Продолжайте обнажая CCA, соблюдая осторожность, чтобы отделить от основной ткани, а также выставить верхний "Y" разветвление внутренней мозговой артерии (ВСА) и внешней мозговой артерии (ЭКА). Для того, чтобы помочь в отсоединении CCA вставить изогнутых щипцов под ОАС проколоть соединительную ткань , а затем медленно позволяют им открыть.

4. Подготовка ОАС для MCAO Suture вставки

1. Вставка 3 сегментов нейлоновой нити около 4 см в длину под ОАС. Убедитесь, что ОАС не скрученный, как это приведет к резкому усложняют вставку шовного материала.
2. В нижней точке возможно, закройте нижний шов, используя постоянный узел.
3. Привяжите верхний шов чуть ниже ICA / ECA разветвленности с помощью съемного скольжения узла.
4. Свяжите средний шов, используя съемный узел промаха, но держать его открытым. Важно, чтобы оставить достаточно места, чтобы не препятствовать вставки шовного.
5. Использование микродиссекции пружины SCIssors, выполнить надрез в ОАС между нижней и средней швами. Выполните 0,2 мм надрез близко к нижнему шву.

5. Средний церебральной артерии Окклюзия

1. Использование щипцов, вставьте шовный MCAO в разрез CCA, направляя его до самого верха. Выполните этот шаг быстро после шага 4.5, чтобы предотвратить свертывание и закрытие отверстия ОСО. В том случае, если вставка шовный заблокирован, используйте кончики щипцами, чтобы снова открыть надрез.
2. Аккуратно сковать средний шов на MCAO шовный силиконовой части с помощью скольжения узла, чтобы ограничить приток крови вокруг него, но достаточно свободно, чтобы позволить ему свободно двигаться.
3. Осторожно отменить верхний шов, убедившись, что шовный материал MCAO не выскальзывает.
4. Вставьте шовный MCAO в ВСА на пару миллиметров, а затем вновь запечатать верхний шов, таким же образом, как описано в пункте 5.2.
5. Руководство шовный материал MCAO в область закупорки. Индикация успешного введения являетсяочевидно, низким количеством обратный поток крови из разреза CCA и что мм марки серебро 9 расположен между разрезом ОАС и бифуркацией МКА / ECA. Дальнейшее подтверждение успешного окклюзии могут быть получены с использованием методов мониторинга , таких как системы мониторинга кровотока лазерной доплеровской ^{15, 16.}
   Примечание: Падение в 90% притока крови к области среднего мозга на закупоренной стороне области свидетельствует об успешном прикус.
6. После успешной окклюзии, сковать высшего и среднего шва плотно. При выполнении вставки фиктивный, не запечатать наложения швов, но вместо того, чтобы сразу перейти к шагу 7.3.

6. Разрез Закрытие и послеоперационный уход

1. Tuck в швах в области надреза.
2. Удалите втягивающего устройства или ткани крючки и подушку.
3. Очистить поверхность шва с помощью стерильного физиологического раствора и ватный тампон.
4. Закрыть разрез с помощью нейлоновой шовный / иглы и пинцета.
5. Администрирование противовоспалительный (например, Carprofen 10 мг / кг, подкожно) и обезболивающее (например, бупренорфин 0,1 мг / кг подкожно, два раза в день) препараты , чтобы облегчить послеоперационный дискомфорт. Поместите мышей в клетку помещают на нагретую подушку, чтобы предотвратить переохлаждение и дать объявления доступ к воде губой и смягченной пищи.
6. Контроль за выздоровление животных (5 - 10 мин) и признаки инсульта. Они могут отличаться в зависимости от легкого бокового паралича и кружить до тяжелой сокращения контралатеральной фланг и прокатки. Несколько точек оценки перечислены в обсуждении. Животные показаны признаки дыхательной недостаточности или тяжелых приступов должны быть умерщвлены.
7. В зависимости от протокола ишемией реперфузии, оставить шовного МСАО на месте от 30 мин до 120 мин или более. Сокращение времени окклюзия предотвращает смертность.
8. Для получения постоянной окклюзии, оставьте шовного МСАО на месте в течение 24 ч, однако значительный уровень смертности следует ожидать. По истечении этого промежутка времени, приступить к STEр 7.
   1. При использовании постоянной модели окклюзия, держать мышей в клетке до конечной точки. В то время, удалить шовный материал (шаги 7.1 до 7.8). Эта процедура также может быть выполнена после эвтаназии.

7. реперфузии

1. Обезболить животное снова (следуйте инструкциям, приведенным в 2.1) и снимите раны закрытия швов.
2. Использование щипцов и сепараторы ткани, повторно открыть разрез и разоблачить CCA.
3. Осторожно снимите верхний шов и осторожно потяните на шовного MCAO до силиконовым покрытием часть не находится в середине узла.
4. Повторить верхний узел на шовного материала, чтобы предотвратить кровь течет пройти шовный материал (он не должен быть нескользящей узел).
5. Тщательно расстегнуть средний узел и тянуть шов мимо верхнего узла, но держать его внутри ОАС.
6. Плотно закрыть верхний узел, чтобы блокировать артерии кровоток.
7. Вытащить полностью шовный материал MCAO и плотно закрыть средний узел.
8. Шов может быть MCAOповторно использовать несколько раз. После каждого использования, очистите шовный материал тщательно в 70% этаноле для удаления загрязняющих веществ (например, кровь или ткани) с использованием стерильной марлей. Затем поместите шовный материал в стерилизационной сумке и стерилизовать его.
9. Повторите шаги 6.1 - 6.4 и контролировать восстановление животных.

8. Анализ тканей

1. Для контроля ударного объема, рассекать из мозга.
   1. Эвтаназии мышь с помощью двухступенчатого процесса. Во-первых, не подвергать животное к передозировки изофлуран до остановки дыхания. Для TTC окрашивания, обезглавить мышь немедленно и приступить к извлечению мозга. Для мозга секционирования (например, для иммунное анализа), выполнять перфузию через пункции сердца до начала декапитации.
   2. Пороговые головы у основания черепа и разрезают кожу головы от открытия шеи до верхней части черепа до между глазами. С черепом разоблачены, вырезать кости вдоль обеих сторон, начиная от основания черепа открытиядо глазницы. Сделайте этот разрез вдоль широкой части черепа. Будьте осторожны, чтобы не достичь слишком глубоко с ножницами, чтобы предотвратить повреждение мозга.
   3. Затем разрезать кость между двумя глазницами.
2. Использование щипцов, поднимите верхнюю часть черепа, чтобы обнажить мозг. Там должно быть лишь небольшое сопротивление. Если он не поднимается легко, череп насечки может быть неполным. Подденьте мозг мягко тупыми изогнутых щипцов. Мозг все еще может быть присоединён несколькими нервами. Продолжайте медленно, удаление вложений по пути.
3. Поместите свежий мозг в матрице мозга 1 мм, добавьте пару капель PBS, и порезать вдоль матрицы с помощью лезвия бритвы или криостата лезвие.
4. Перенести мозг на 100 мм чашку и добавляют окрашивающий раствор (2% 2,3,5-трифенилтетразолий [ТТС], растворенного в PBS), чтобы покрыть дно тарелки. С помощью двух щипцов, просепарируйте срезах мозга (передний лицевой стороной вниз) и поместите их в порядок в нижней части блюда.
   Примечание: Окрашивание станет жизнеспособной ткани красного цвета, с нежизнеспособные ткани оставшегося белого. Согревания раствора до 37 ° C ускорит окрашивание. Признаки области инсульта (белый) можно рассматривать как быстро, как 90 мин после инсульта и остаются видимыми в течение более 7 дней. Визуализации должно быть сделано вместе с линейкой, чтобы рассчитать ударный объем сердца.
5. Процесс расчлененный мозги для секционирования, иммуно-окрашивание, изолирующие белок, или целый ряд других процедур ^{17, 18, 19.}

Результаты

Вставки маршрута для закупорки швом продемонстрировано на рисунке 1. Шовный материал МСАО должен быть направлен в область закупорки, бифурцирующих в ICA. Успешное окклюзия MCA приведет к повреждению ткани, видимой с помощью ТТС окрашивания. На рисунке 2...

Обсуждение

Успешное использование описанного метода MCAO сильно зависит от понимания мозгового кровотока анатомии. Так как правильное размещение шовного материала трудно различить из-за отсутствия прямых визуальных подсказок, повторяется практика важно освоить процедуру, прежде чем использова?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCAO suture 0.23 mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21 mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 - LDPM