La inducción de ictus isquémico y la isquemia-reperfusión en ratones con la técnica de oclusión de la arteria Medio y Visualización de un infarto Área

Resumen

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Resumen

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Introducción

El estudio de la enfermedad cardiovascular, tal como apoplejía, se basa en el uso de modelos in vivo. Para entender la posible implicación de la isquemia, la toxicidad del fármaco, y / o tratamiento, hay una necesidad de usar un modelo adecuado, estandarizado, fiable y reproducible de la enfermedad, lo que permite estudios comparativos entre los grupos de tratamiento. En este manuscrito, estamos utilizando ratones, dada la disponibilidad de un gran número de ratones transgénicos y los modelos de evaluación estandarizados. Rastrillar puntajes para evaluar los déficits motores y de comportamiento después del accidente cerebrovascular isquémico experimental y el después de la recuperación han sido desarrollados ^{1, 2.}

Varios modelos de accidente cerebrovascular isquémico están disponibles, tales como isquemia global completa cerebral, isquemia global incompleta, isquemia cerebral multifocal y la isquemia cerebral focal. El último grupo es también la categoría de derrame cerebral más frecuente en los pacientes. La mayoría de las vísperasnts se inician por la formación de una oclusión embólica o trombótica en o cerca de la arteria cerebral media (MCA). Teniendo en cuenta estos parámetros, el modelo presentado estrechamente imita etiología de la enfermedad de apoplejía humana y hace que los resultados obtenidos altamente relevante ^3. Sin embargo, la traducción de los descubrimientos de modelos animales para el tratamiento de enfermedades en los seres humanos ha demostrado ser un reto. Hasta ahora, sólo el uso de activador de plasminógeno tisular trombolítico se ha aprobado para el tratamiento del ictus isquémico agudo ^4.

Entre los modelos de isquemia cerebral focal en ratón, modelo accidente cerebrovascular circulación cerebral posterior y modelo de trombosis venosa cerebral son altamente invasivos, disminuyendo su aplicabilidad y la restricción de la gama de análisis que se pueden realizar. Sin embargo, otras técnicas, tales como el modelo embólico, modelo photothrombosis, modelo de carrera de la endotelina-1 inducida, y oclusión de la arteria cerebral media de sutura intraluminal (MCAO modelo), están disponibles para su uso sin tales limitaciones. El modelo MCAO es una técnica descrita en este protocolo. Ofrece un método fiable de inducir isquemia cerebral focal que puede ser fácilmente reperfundido y realiza de una manera de alto rendimiento. Hay dos enfoques para este modelo, a saber, los métodos de Zea-Longa y Koizumi. Se diferencian ligeramente en la forma en que se inserta la sutura oclusión de la vasculatura. En la técnica de Zea-Longa, la sutura se inserta a través de la arteria carótida externa ^5. La técnica que aquí se presenta es una modificación del método de Koizumi en el que la sutura oclusiva se inserta a través de la arteria carótida común ^6.

El modelo MCAO se ha aplicado con éxito para evaluar los diferentes eventos que se producen durante el accidente cerebrovascular isquémico. Después de la reperfusión, edema cerebral puede ser observado junto con la ruptura de la barrera sangre-cerebro. la muerte neuronal pico se observa generalmente a las 24 horas; sin embargo, se reconvierte a los niveles basales después de 7 días ^7. En los seres humanos, el sexo y la edad son variables importantes en la determinación pronóstico del accidente cerebrovascular, esto también se observa en ratones y ratas ^{8, 9, 10.} Varias publicaciones han utilizado el modelo MCAO para demostrar la eficacia del tratamiento ^{11, 12, 13, 14.}

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por la Universidad de Miami Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Se requiere el uso de equipo estéril y técnicas asépticas.

1. Preparación de la oclusión de la sutura

1. Utilice una sutura de mm de diámetro 0,21 para los ratones entre 20 a 25 g y 0,23 mm para los ratones entre 25 - 35 g de peso corporal. La elección del tipo de suturas para el procedimiento de MCAO depende del peso animal.
2. El uso de una pluma de plata, marcar la sutura a los 9 mm a partir de la punta recubierta de silicona. Esto servirá como una guía para la longitud de inserción.

2. Preparación para la Cirugía

1. Anestesiar al ratón con isoflurano mezclado con oxígeno, utilizando un sistema de anestesia de laboratorio. Utilice isoflurano en la posición 5 y el flujo de oxígeno a 2 en la máquina comercial (Ver Tabla de Materiales). Transferir el animal a la surgery la superficie y mantener la anestesia utilizando un cono de la nariz (1,5 utilización establecer isoflurano - 2,5 y flujo de oxígeno a las 2).
   1. Asegúrese de que la frecuencia respiratoria del ratón es de alrededor de 1 - 2 respiración por segundo sin jadear. Además, asegúrese de que el animal no presenta reacción estimulación barbas y el reflejo del pedal (puntera pellizco). Controlar la frecuencia y el esfuerzo de respiración durante la cirugía, por lo menos cada 5 minutos.
2. Ponga una gota de lubricante oftálmica en cada ojo utilizando un hisopo estéril para evitar que se sequen durante el procedimiento. Alternativamente, aplicar pomada oftálmica al ojo de un tubo farmacéutica estéril.
3. Da la vuelta al animal a su espalda y afeitar el área de la incisión. Después, desinfectar a fondo el área de la cirugía usando 70% de etanol, seguido de clorhexidina, y el hisopo final con 70% de etanol. Colocar el animal sobre una superficie quirúrgica caliente bajo un microscopio estereoscópico.

3. La disección de la arteria carótida común e Interno / Externo de ramificación

1. Usando tijeras quirúrgicas y fórceps, realizar una incisión en la línea media superficial en el cuello, desde arriba del esternón por debajo de la mandíbula (aproximadamente 3 - 4 cm). paño quirúrgico debe ser colocado alrededor del área de la cirugía para prevenir instrumentos entren en contacto con superficies no estériles. El paño quirúrgico se omitió en el vídeo actual para facilitar el rodaje.
2. Con unas pinzas, graso cuidadosamente separada y el tejido conectivo para exponer la tráquea. Tejido debe separar fácil y natural para ambas partes.
3. Coloque una almohada (objeto redondo, alrededor de 0,5 cm de diámetro) en la parte posterior del cuello de los ratones para extender el cuello, exponiendo aún más el área de cirugía.
4. Abra la incisión usando un retractor de tejidos o ganchos.
5. En el lado izquierdo del animal de la tráquea, pinzas cuidadosamente con el tejido conectivo para exponer la arteria carótida común izquierda (CCA). Tenga cuidado de no dañar los nervios y las venas principales que vienen con el CCA.
6. Continuar la exposición de la CCA, teniendo cuidado de separar de los tejidos subyacentes, y exponer la parte superior de "Y" de ramificación de la arteria cerebral interna (ACI) y la arteria cerebral externa (ACE). Para ayudar en la separación de la CCA, insertar las pinzas curvas en virtud de la CCA para perforar el tejido conjuntivo y luego permitir que se abran lentamente.

4. Preparación de la CCA para la MCAO Sutura de inserción

1. Inserte 3 segmentos de sutura de nylon de aproximadamente 4 cm de longitud en virtud de la CCA. Asegúrese de que la CCA no es retorcido ya que esto complicaría drásticamente la inserción de la sutura.
2. En el punto más bajo posible, cerrar la parte inferior de la sutura con un nudo permanente.
3. Atar la sutura superior justo debajo de la ICA / ECA ramificación usando un nudo corredizo extraíble.
4. Atar la sutura media que usa un nudo corredizo extraíble, pero mantenerlo abierto. Es importante dejar suficiente espacio como para no obstaculizar la inserción de sutura.
5. El uso de microdisección de ciencia primaverassors, realizar una incisión en la CCA entre la parte inferior y las suturas medias. Realizar la incisión de 0,2 mm cerca de la parte inferior de sutura.

5. Medio oclusión de la arteria cerebral

1. Con unas pinzas, inserte la sutura MCAO en la incisión CCA, guiándolo hasta la parte superior. Realice este paso rápidamente después del paso 4.5 para prevenir la coagulación y el cierre de la abertura de la CCA. En el caso de que la inserción de la sutura está bloqueado, usar las puntas de fórceps para volver a abrir la incisión.
2. atar suavemente hacia abajo la sutura media de silicona en la parte de sutura MCAO usando un nudo corredizo para restringir el flujo de sangre a su alrededor, pero lo suficientemente floja como para permitir que se mueva libremente.
3. Con cuidado, deshacer la sutura de la parte superior, asegurándose de que la sutura MCAO no se salga.
4. Insertar la sutura MCAO en el ICA por un par de milímetros y a continuación, volver a cerrar la sutura superior, de la misma manera como se describe en el paso 5.2.
5. Guiar la sutura MCAO a la zona de la oclusión. Indicación de inserción exitosa esevidente por la baja cantidad de expulsión de la sangre de la incisión CCA y que el marco de plata de 9 mm se encuentra entre la incisión CCA y la bifurcación ICA / ECA. La confirmación adicional de la oclusión exitosa puede obtenerse utilizando métodos de control tales como un sistema de monitoreo del flujo sanguíneo láser Doppler ^{15, 16.}
   NOTA: Una gota en 90% del flujo de sangre al área del cerebro medio en el lado área ocluida indica oclusión éxito.
6. Después de la oclusión exitosa, atar la sutura media y alta fuerza. Si se realiza la inserción simulada, no se volverá a cerrar suturas pero en lugar de inmediato vaya al paso 7.3.

6. Cierre la incisión y el cuidado post-operatorio

1. Cirugía estética en los puntos de sutura en el área de la incisión.
2. Retire retractor de tejido o ganchos y almohada.
3. área de sutura limpia utilizando solución salina estéril y un hisopo de algodón.
4. Cerrar la incisión utilizando nylon sutura / aguja y pinzas.
<(kg sc, por ejemplo, buprenorfina 0,1 mg / dos veces al día) drogas li> Administrar antiinflamatorio (por ejemplo, carprofeno 10 mg / kg, sc) y analgésicos para aliviar el malestar post-operatorio. Coloque los ratones en una jaula colocada sobre una almohadilla caliente para prevenir la hipotermia y dar acceso ad labium a agua y comida blanda.
5. Controlar la recuperación de los animales (de 5 - 10 min) y los signos de un derrame cerebral. Pueden variar de leve parálisis lateral y dando vueltas a la contracción severa del flanco contralateral y el laminado. Varios puntos de evaluación se muestran en la discusión. Animales que presenten signos de dificultad respiratoria o convulsiones severas deben ser sacrificados.
6. En función de protocolo de isquemia-reperfusión, dejar la sutura MCAO en lugar de 30 minutos a 120 minutos o más. Reduciendo el tiempo de oclusión previene la mortalidad.
7. Para oclusión permanente, dejar la sutura MCAO en su lugar durante 24 horas, sin embargo la tasa de mortalidad significativa es de esperar. Después de este lapso de tiempo, proceder a step 7.
   1. Si se utiliza el modelo de oclusión permanente, mantener a los ratones en la jaula hasta el punto final. En ese momento, retirar la sutura (pasos 7.1 a 7.8). Este procedimiento también se puede realizar después de la eutanasia.

7. La reperfusión

1. Anestesiar al animal de nuevo (siga las instrucciones en 2.1) y retirar las suturas de cierre de la herida.
2. El uso de pinzas y separadores de tejidos, vuelva a abrir la incisión y exponer la CCA.
3. Retirar con cuidado la sutura superior y tire suavemente de la sutura MCAO hasta que la parte recubierta de silicona está situado en el nudo medio.
4. Rehacer el nudo superior de la sutura para evitar que la sangre que fluye a pasar la sutura (que no tiene que ser un nudo corredizo).
5. Con cuidado deshacer el nudo medio y tirar de la sutura más allá del nudo superior, pero mantenerlo dentro de la CCA.
6. Cierre bien el nudo superior para bloquear el flujo sanguíneo de la arteria.
7. Extraiga completamente la sutura MCAO y cerrar herméticamente el nudo medio.
8. La sutura puede ser MCAOreutilizado varias veces. Después de cada uso, limpie la sutura cuidadosamente en 70% de etanol para eliminar los contaminantes (por ejemplo, sangre o tejido) usando una gasa estéril. Después, colocar la sutura en una bolsa de esterilización y esterilizarlo.
9. Repita los pasos 6.1 a 6.4 y monitorear la recuperación de los animales.

8. Análisis de Tejidos

1. Para controlar el volumen sistólico, diseccionar el cerebro.
   1. La eutanasia del ratón utilizando un proceso de dos pasos. En primer lugar, exponer a los animales a una sobredosis de isoflurano hasta que deje de respirar. Para la tinción de TTC, decapitar al ratón inmediatamente y proceder a la extracción del cerebro. Para seccionar cerebro (por ejemplo, para los análisis de inmunotinción), lleve a cabo la perfusión a través de una punción cardiaca antes de la decapitación.
   2. De corte de la cabeza en la base del cráneo y cortar el cuero cabelludo de la abertura del cuello a la parte superior del cráneo hasta entre los ojos. Con el cráneo expuesto, cortar el hueso a lo largo de ambos lados a partir de la abertura de la base del cráneohasta la cuenca del ojo. Hacer este corte a lo largo de la parte ancha del cráneo. Tenga cuidado de no llegar demasiado profundo con unas tijeras para prevenir daños en el cerebro.
   3. Después, cortar el hueso entre las dos cuencas de los ojos.
2. Con unas pinzas, levante la parte superior del cráneo para exponer el cerebro. No debe haber sólo una pequeña resistencia. Si no lo hará fácilmente, incisiones cráneo pueden estar incompletos. Palanca para extraer el cerebro suavemente con pinzas curvas contundentes. El cerebro todavía podría estar unido por varios nervios. Proceder lentamente, la eliminación de los archivos adjuntos a lo largo del camino.
3. Coloque el cerebro fresco en una matriz de cerebro 1 mm, añadir un par de gotas de PBS, y cortar a lo largo de la matriz usando una hoja de afeitar o una cuchilla criostato.
4. Transferir el cerebro a un plato de 100 mm y añadir solución de tinción (2% de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio [TTC] disuelto en PBS) para cubrir el fondo del plato. El uso de dos pinzas, separar todas las secciones de cerebro (parte frontal hacia abajo) y colocarlos en el orden en el fondo del plato.
   NOTA: La tinción se convertirá tejido viable rojo, con tejido no viable restante blanco. Calentamiento de la solución a 37 ° C se acelerará la tinción. Los signos de la zona de recorrido (blanco) se pueden ver tan pronto como 90 minutos después de la apoplejía y permanecen visibles durante más de 7 días. Imaging se debe hacer junto con una regla para permitir el cálculo del volumen sistólico.
5. Cerebros disecados de proceso para el seccionamiento, inmuno-tinción, aislamiento de proteínas, o una variedad de otros procedimientos ^{17, 18, 19.}

Resultados

La ruta de inserción para la sutura oclusión se demuestra en la Figura 1. La sutura MCAO se va a encaminar a la zona de la oclusión, bifurcándose en el ICA. oclusión de la MCA éxito dará lugar a la lesión tisular, visible por tinción con TTC. La Figura 2 presenta imágenes de tinción de tratados sham animales (Figura 2A) y de un 60 min MCAO animales isquemia reperfusión (tinción en 90 min o 24 horas después de la oclusión, ...

Discusión

La utilización con éxito de la MCAO método descrito depende de una comprensión de la anatomía del flujo sanguíneo cerebral altamente. Desde la correcta colocación de la sutura es difícil de discernir debido a la falta de pistas visuales directos, la práctica repetida es importante dominar el procedimiento antes de usarla para estudios de investigación. El volumen de eyección debe ser analizado para asegurar resultados consistentes. La adición de un sistema de láser Doppler puede ayudar a determinar el éxit...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCAO suture 0.23 mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21 mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 - LDPM