Die Induktion von ischämischem Schlaganfall und Ischämie-Reperfusion bei Mäusen die Mittel Artery Occlusion Technik und Visualisierung von Infarktbereich verwenden

Zusammenfassung

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Zusammenfassung

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Einleitung

Die Studie von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Schlaganfall, beruht auf der Verwendung von in vivo - Modellen. Um die möglichen Auswirkungen von Ischämie, Arzneimitteltoxizität zu verstehen und / oder Behandlung, besteht ein Bedarf, einen geeigneten, standardisiert, zuverlässig zu verwenden und reproduzierbares Modell der Krankheit, die zwischen den Behandlungsgruppen vergleichende Untersuchungen ermöglicht. In diesem Manuskript, verwenden wir Mäuse, da die Verfügbarkeit einer großen Anzahl von transgenen Mäusen und standardisierte Bewertungsmodelle. Raking Partituren Motor und Verhaltensdefiziten folgenden experimentellen ischämischen Schlaganfall und der folgenden Erholung wurden ¹ zu beurteilen , ^{entwickelt, 2.}

Mehrere ischämischen Schlaganfall-Modelle stehen zur Verfügung, wie zum Beispiel komplette globale zerebrale Ischämie, unvollständige globale Ischämie, multifokale zerebrale Ischämie und fokaler zerebraler Ischämie. Die letztere Gruppe ist auch die Kategorie des Schlaganfalls am häufigsten bei Patienten. Die Mehrheit der Vorabendnts werden durch die Bildung eines embolischen oder thrombotischen Okklusion an oder nahe der mittleren zerebralen Arterie (MCA) initiiert. Vor dem Hintergrund dieser Parameter präsentierte das Modell ahmt Krankheitsätiologie des menschlichen Schlaganfall und macht erhaltenen Ergebnisse höchst relevant ^3. Dennoch hat sich die Übersetzung von Entdeckungen aus Tiermodellen auf die Behandlung von Krankheiten beim Menschen erwiesen schwierig. Bisher ist nur die Verwendung der Thrombolyse Gewebe - Plasminogen - Aktivator wurde für die Behandlung des akuten ischämischen Schlaganfalls ⁴ zugelassen.

Unter Modellen von fokaler zerebraler Ischämie in der Maus, sind cerebri posterior Zirkulation Hubmodell und Hirnvenenthrombose-Modell sehr invasiv, deren Anwendbarkeit verringern und die Bandbreite der Analysen zu beschränken, die durchgeführt werden können. Jedoch können auch andere Techniken, wie zum Beispiel die embolischen Modell, photothrombosis Modell, Endothelin-1-induzierten Schlaganfall-Modell und intraluminalen Naht Arteria cerebri media Okklusion (MCAO) Modell sind für den Einsatz ohne solche Einschränkungen zur Verfügung. Das MCAO-Modell ist eine Technik, die in diesem Protokoll beschrieben. Es bietet eine zuverlässige Methode der fokaler zerebraler Ischämie zu induzieren, die leicht Reperfusion und in einem Hochdurchsatz-Art und Weise durchgeführt werden kann. Es gibt zwei Ansätze für dieses Modell, nämlich die Zea-Longa und Koizumi Methoden. Sie unterscheiden sich etwas in der Art und Weise der Okklusion Naht in das Gefäßsystem eingeführt wird. In der Zea Longa-Technik wird der Faden über die Arteria carotis externa ⁵ eingesetzt. Die Technik , die hier präsentiert wird vom Koizumi Verfahren modifiziert , in der die okkludierende Naht über die Arteria carotis communis ⁶ eingesetzt ist.

Das MCAO-Modell wurde erfolgreich verschiedene Ereignisse, die während ischämischen Schlaganfall zu bewerten angewendet. Nach Reperfusion kann Hirnödem mit dem Zusammenbruch der Blut-Hirn-Schranke beobachtet entlang werden. Peak-neuronalen Tod wird in der Regel bei 24 Stunden beobachtet; Es können jedoch wiederdreht sich auf das Ausgangsniveau nach 7 Tagen ^7. Bei Menschen, Geschlecht und Alter sind wichtige Variablen bei Schlaganfall Ergebnis der Bestimmung, dies auch bei Mäusen und Ratten beobachtet ^{8, 9, 10.} Mehrere Veröffentlichungen haben die MCAO - Modell zu zeigen , die Behandlungseffizienz ^{11, 12, 13, 14} verwendet.

Protokoll

Alle Verfahren wurden von der University of Miami Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health (NIH) Richtlinien zugelassen. Die Verwendung in sterile Geräte und aseptischer Techniken erforderlich ist.

1. Vorbereiten der Occlusion Suture

1. Verwenden einer Naht von 0,21 mm Durchmesser für Mäuse zwischen 20 bis 25 g und 0,23 mm für Mäuse zwischen 25 - 35 g Körpergewicht. Die Wahl der Art von Nähten für die MCAO Verfahrens beruht auf Tiergewicht.
2. Mit einem silbernen Stift, markieren Sie die Naht auf 9 mm von der silikonbeschichteten Spitze beginnen. Dies wird als Leitfaden für die Einbaulänge dienen.

2. Vorbereitung für Chirurgie

1. Anesthetize Maus mit Isofluran mit Sauerstoff gemischt, ein Labor, Anästhesie-System. Verwenden Sie Isofluran bei Einstellung 5 und Sauerstoffstrom bei 2 auf der kommerziellen Maschine (siehe Werkstoff - Tabelle). Übertragen Sie das Tier auf dem Weg surgery Oberfläche und Aufrechterhaltung der Anästhesie einen Nasenkegel mit (Verwendung von Isofluran Einstellung 1,5-2,5 und Sauerstoffstrom bei 2).
   1. Stellen Sie sicher, dass die Maus Atemfrequenz liegt bei etwa 1 bis 2 Atmung pro Sekunde ohne Keuchen. Darüber hinaus gewährleisten, dass das Tier nicht Whiskers Stimulation nicht aufweist Reaktion und Pedal Reflex (toe Prise). Überwachen Sie die Atemfrequenz und Aufwand während der Operation, mindestens alle 5 Minuten.
2. Geben Sie einen Tropfen ophthalmische Schmiermittel auf jedes Auge einen sterilen Tupfer, sie zu verhindern, dass während des Verfahrens zu trocknen. Alternativ gelten ophthalmischen Salbe in das Auge aus einer sterilen pharmazeutischen Röhre.
3. Flip das Tier auf den Rücken und rasieren den Schnittbereich. Anschließend desinfizieren gründlich den OP-Bereich 70% Ethanol, gefolgt von Chlorhexidin, und die endgültige Tupfer mit 70% Ethanol. Legen Sie das Tier an einem warmen chirurgischen Oberfläche unter einem Stereomikroskop.

3. Dissektion der Arteria carotis communis und interne / External Branching

1. Mit chirurgische Schere und Pinzette, führen Sie einen flachen Mittelschnitt im Nacken, von oberhalb des Brustbeins bis unterhalb des Kiefers (ca. 3-4 cm). Operationstuch sollte rund um den OP-Bereich platziert werden Instrumente zu verhindern, dass in Kontakt mit nicht sterilen Oberflächen kommen. Das Operationstuch wurde in der aktuellen Video weggelassen Filmen zu unterstützen.
2. Mit einer Pinzette vorsichtig getrennte Fett- und Bindegewebe, um die Luftröhre aus. Gewebe sollte leicht und natürlich auf beiden Seiten zu trennen.
3. Legen Sie ein Kissen (rundes Objekt, etwa 0,5 cm im Durchmesser) auf der Rückseite des Halses der Mäuse den Hals zu verlängern, das weiterhin den Bereich für die Operation auszusetzen.
4. Öffnen Sie den Einschnitt entweder mit einem Geweberetraktor oder Haken.
5. Auf der linken Seite der Trachea des Tieres, tweeze sorgfältig das Bindegewebe neben der linken Arteria carotis communis (CCA) zu belichten. Achten Sie darauf, nicht die Nerven zu schädigen und die wichtigsten mit dem CCA gebündelten Adern.
6. Fortsetzung der CCA aussetzt, vorsichtig von darunterliegenden Gewebe zu lösen, und setzen die oben "Y" Verzweigung der inneren Hirnarterie (ICA) und externe Arteria cerebri (ECA). Zur Unterstützung des CCA in Abnehmen, legen Sie die gebogenen Pinzette unter der CCA das Bindegewebe zu durchdringen und dann langsam erlauben , sie zu öffnen.

4. Vorbereitung der CCA für die MCAO Suture Insertion

1. Legen Sie drei Segmente von Nylonfaden von etwa 4 cm in der Länge unter der CCA. Stellen Sie sicher, dass der CCA nicht verdreht ist, da dies drastisch um das Einsetzen des Naht erschweren würde.
2. Am tiefsten Punkt möglich, schließen Sie die untere Naht einen permanenten Knoten.
3. Binden Sie die obere Naht knapp unter dem ICA / ECA Verzweigung einen herausnehmbaren Schlupf Knoten.
4. Binden Sie die mittlere Naht einen abnehmbaren Laufknoten verwenden, aber halten Sie es weit offen. Es ist wichtig, viel Platz zu verlassen, da nicht Naht Einsetzen zu verhindern.
5. Mit microdissection Frühjahr scissors, führen Sie einen Einschnitt in der CCA zwischen dem unteren und mittleren Nähten. Führen Sie die 0,2 mm Einschnitt nahe dem Boden Naht.

5. Middle Cerebral Artery Occlusion

1. Mit einer Pinzette, legen Sie die MCAO Naht in die CCA Einschnitt, Führungs es bis an die Spitze. Führen Sie diesen Schritt schnell nach dem Schritt 4,5 bis Blutgerinnung und Schließen der CCA Öffnung verhindern. Für den Fall, dass Naht Einsetzen blockiert ist, verwenden Sie die Spitzen der Zange den Schnitt wieder zu öffnen.
2. binden vorsichtig die mittlere Naht auf der MCAO Nahtsilikonteil einen Belegknoten mit den Blutfluss um es zu beschränken, aber locker genug, um es zu ermöglichen, sich frei zu bewegen.
3. Vorsichtig lösen Sie die obere Naht, um sicherzustellen, dass die MCAO Naht nicht herausrutschen.
4. Legen Sie die MCAO Naht in der ICA um ein paar Millimeter und dann die obere Naht wieder geschlossen, in der gleichen Weise wie in Schritt 5.2 beschrieben.
5. Führen Sie die MCAO Naht an der Okklusion Bereich. Anzeige der erfolgreichen Insertionoffensichtlich durch die geringe Menge an Blutrückfluss aus dem CCA Schnitt und dass die Silber-9-mm-Markierung wird zwischen dem CCA Einschnitt und der ICA / ECA Bifurkation entfernt. Eine weitere Bestätigung der erfolgreichen Okklusion kann Überwachungsverfahren unter Verwendung von beispielsweise einem Laser - Doppler - Blutströmungsüberwachungssystem ^{15, 16} erhalten werden.
   HINWEIS: Ein Tropfen in 90% der den Blutfluss zum Gehirn mittleren Bereich auf der okkludierte Bereich Seite zeigt die erfolgreiche Okklusion.
6. Nach dem erfolgreichen Verschluss, binden Sie die mittlere und obere Naht fest nach unten. Wenn Schein Einfügung ausgeführt werden, dürfen nicht Nähte wieder zu verschließen, sondern sofort überspringen 7.3 zu treten.

6. Incision Closing und postoperative Pflege

1. Tuck in den Nähten in den Schnittbereich.
2. Entfernen Aufroller oder Gewebehaken und Kissen.
3. Saubere Nahtbereich mit einer sterilen Kochsalzlösung und mit einem Wattestäbchen.
4. Schließen Sie den Schnitt mit Nylonfaden / Nadel und Pinzette.
5. Verwalten entzündungshemmende (zB Carprofen 10 mg / kg, sc) und analgetische ( zum Beispiel Buprenorphin 0,1 mg / kg sc, zweimal täglich) Drogen postoperative Beschwerden zu lindern. Legen Sie die Mäuse in einem Käfig auf einem Heizkissen platziert Hypothermie zu verhindern und ad labium Zugang zu Wasser und erweicht Nahrung geben.
6. Überwachen Sie die Wiederherstellung von Tieren (5 - 10 min) und auf Anzeichen von Schlaganfall. Sie können von einer leichten seitlichen Lähmung variieren und kreisen zu starken Kontraktion der Gegenflanke und Rollen. Mehrere Bewertungspunkte werden in der Diskussion aufgeführt. Tiere Anzeichen von Atemnot oder schwere Anfälle Anzeige sollte eingeschläfert werden.
7. Je nach Ischämie Reperfusion Protokoll, lassen Sie die MCAO Naht anstelle von 30 min bis 120 min oder mehr. Okklusionszeit Reduzierung verhindert Mortalität.
8. Für einen dauerhaften Verschluss, lassen Sie die MCAO Naht an Ort und Stelle für 24 Stunden, jedoch signifikante Mortalitätsrate zu erwarten ist. Nach dieser Zeit außer Kraft treten, gehen steS. 7.
   1. Bei der Verwendung von permanenten Okklusion Modell, halten Mäuse im Käfig bis Endpunkt. Zu diesem Zeitpunkt entfernen Naht (Schritte 7,1-7,8). Dieses Verfahren kann auch nach der Euthanasie durchgeführt werden.

7. Reperfusion

1. Anesthetize das Tier wieder (folgen Sie den Anweisungen in 2.1) und Wundverschluss Nähte entfernen.
2. Mit einer Pinzette und Gewebe-Separatoren, die Inzision wieder öffnen und die CCA aussetzen.
3. Sie vorsichtig die obere Naht entfernen und vorsichtig auf die MCAO Naht ziehen, bis das Silikon beschichtete Teil in der Mitte Knoten befindet.
4. Wiederholen Sie die oben Knoten auf der Naht Blut zu verhindern, dass das Fließen des Naht passieren (es muss nicht ein Belegknoten sein).
5. Vorsichtig den mittleren Knoten lösen und die Naht nach dem oberen Knoten ziehen, aber es innerhalb des CCA halten.
6. Dicht schließen Sie die obere Knoten Arterie den Blutfluss zu blockieren.
7. Ziehen Sie vollständig die MCAO Naht und schließen dicht den mittleren Knoten.
8. Die MCAO Naht kannwiederverwendet mehrmals. Nach jedem Gebrauch reinigen Sie die Naht vorsichtig in 70% Ethanol Verunreinigungen (zB Blut oder Gewebe) mit einer sterilen Gaze zu entfernen. Danach legen Sie die Naht in einem Sterilisator Beutel und sterilisieren.
9. Wiederholen Sie die Schritte 6,1-6,4 und Tier Erholung zu überwachen.

8. Gewebeanalyse

1. Zur Überwachung des Schlagvolumens, sezieren aus dem Gehirn.
   1. Euthanize die Maus einen zweistufigen Prozess. Zunächst aussetzen, das Tier zu einer Überdosierung von Isofluran bis Atemstillstand. Für TTC-Färbung, enthaupten die Maus sofort und fahren Sie mit Gehirn-Extraktion. Für Hirnschnitt (zB für Immunofärbung Analysen), die Perfusion über eine Herzpunktion vor der Enthauptung zuführen.
   2. den Kopf an der Basis des Schädels und schneiden Sie die Kopfhaut von der Halsöffnung an der Oberseite des Schädels bis zwischen den Augen Cut-off. Mit dem Schädel ausgesetzt, schneiden Sie den Knochen auf beiden Seiten von der Schädelbasis Öffnung beginnenbis zur Augenhöhle. Machen Sie diesen Schnitt entlang der breiten Teil des Schädels. Seien Sie vorsichtig, nicht zu tief zu erreichen mit einer Schere zu schädigen das Gehirn zu verhindern.
   3. Danach schneiden Sie den Knochen zwischen den beiden Augenhöhlen.
2. Mit einer Pinzette, heben Sie die Oberseite des Schädels bis das Gehirn aus. Es sollte nur ein geringer Widerstand sein. Wenn es nicht leicht anheben, Schädel Einschnitte unvollständig sein kann. Hebeln Sie das Gehirn sanft stumpf gebogenen Pinzette. Das Gehirn kann noch durch mehrere Nerven angebracht werden. Fahren Sie langsam, Anlagen auf dem Weg zu entfernen.
3. Legen Sie die frische Gehirn in einem 1 mm Gehirn Matrix, fügen Sie ein paar Tropfen PBS, und in Scheiben schneiden entlang der Matrix mit einer Rasierklinge oder Kryostaten Klinge.
4. Übertragen Sie das Gehirn auf eine 100-mm-Schale und fügen Färbelösung (2% 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid [TTC], gelöst in PBS), um den Boden der Schale zu bedecken. Mit Hilfe von zwei Zangen, trennen Sie alle Gehirnscheiben (vorne nach unten) und legen Sie sie an der Unterseite der Schale um.
   HINWEIS: Die Färbung wird sich lebensfähiges Gewebe rot, mit nicht lebensfähiges Gewebe verbleibenden weißen. Erwärmen der Lösung auf 37 ° C beschleunigt Färbung. Anzeichen für einen Schlaganfall Bereich (weiß) so schnell wie 90 Minuten nach Schlaganfall und bleiben für mehr als 7 Tage sichtbar zu sehen ist. Imaging sollte zusammen mit einem Lineal erfolgen Berechnung des Schlagvolumens zu ermöglichen.
5. Prozess seziert Gehirne für das Schneiden, Immunfärbung, Proteinisolierung oder eine Vielzahl von anderen Verfahren ^{17, 18, 19.}

Ergebnisse

Die Einfügungs Route für die Okklusion Naht wird in Abbildung 1 gezeigt. Die MCAO Naht ist in die Okklusion Bereich geführt werden, in der ICA-gegabelt. Erfolgreiche Verschluss der MCA wird auf Gewebeverletzung, sichtbar durch TTC-Färbung führen. Abbildung 2 zeigt Bilder der Färbung von Schein - behandelten Tier (2A) und von einer 60 min MCAO Ischämie Reperfusion Tier (Färbung bei 90 min oder 24 Stunden nach der Okklusion,

Diskussion

Die erfolgreiche Anwendung des beschriebenen Verfahrens MCAO ist stark abhängig von einem Verständnis der Hirndurchblutung Anatomie. Da die korrekte Platzierung der Naht ist schwer aufgrund des fehlenden direkten visuelle Hinweise zu erkennen, wird wiederholt der Praxis wichtig, das Verfahren zu meistern, bevor es für den Untersuchungen verwendet. Hubvolumen sollten konsistente Ergebnisse zu gewährleisten, werden analysiert. Die Zugabe eines Laser-Doppler-System kann dazu beitragen, die erfolgreiche Okklusion des Bl...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCAO suture 0.23 mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21 mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 - LDPM