Indução de Acidente Vascular Cerebral Isquêmico e isquemia-reperfusão em ratos usando a técnica de oclusão da artéria Oriente e Visualização de infarto Área

Resumo

We describe a mouse model of stroke induced by the occlusion of the middle cerebral artery using a silicone coated suture. The protocol can be applied to induce permanent occlusion or a temporary ischemia, followed by reperfusion.

Resumo

Cerebrovascular disease is highly prevalent in the global population and encompasses several types of conditions, including stroke. To study the impact of stroke on tissue injury and to evaluate the effectiveness of therapeutic interventions, several experimental models in a variety of species were developed. They include complete global cerebral ischemia, incomplete global ischemia, focal cerebral ischemia, and multifocal cerebral ischemia. The model described in this protocol is based on the middle cerebral artery occlusion (MCAO) and is related to the focal ischemia category. This technique produces consistent focal ischemia in a strictly defined region of the hemisphere and is less invasive than other methods. The procedure described is performed on mice, given the availability of several genetic variants and the high number of tests standardized for mice to aid in the behavioral and neurodeficit evaluation.

Introdução

O estudo de doenças cardiovasculares, tais como acidente vascular cerebral, baseia-se na utilização de modelos in vivo. Para compreender a possível implicação de isquemia, toxicidade da droga, e / ou de tratamento, existe a necessidade de usar um modelo adequado, padronizada, fiável e reprodutível da doença, o que permite estudos comparativos entre os grupos de tratamento. Neste artigo, nós estamos usando ratos, dada a disponibilidade de um grande número de ratos transgénicos e modelos de avaliação padronizados. Raking pontuação para avaliar comportamento motor e déficits seguintes AVC isquêmico experimental ea seguinte de recuperação foram desenvolvidos ^{1, 2.}

Vários modelos de acidente vascular cerebral isquêmico estão disponíveis, tais como isquemia cerebral global, completa, isquemia global incompleta, isquemia cerebral multifocal e isquemia cerebral focal. O último grupo é também a categoria de acidente vascular cerebral em pacientes mais prevalente. A maioria dos eveNTS é iniciada pela formação de uma oclusão embólica ou trombótica na ou perto da artéria cerebral média (MCA). Tendo em conta estes parâmetros, o modelo apresentado imita a etiologia da doença de acidente vascular cerebral humano e faz com que os resultados obtidos altamente relevantes ^3. No entanto, a tradução de descobertas a partir de modelos animais para o tratamento da doença em seres humanos tem provado ser um desafio. Até agora, apenas a utilização de tecido trombolítica activador do plasminogénio tem sido aprovado para o tratamento de acidente vascular cerebral isquémico agudo ^4.

Entre os modelos de isquemia cerebral focal no rato, o modelo de circulação derrame cerebral posterior e modelo de trombose venosa cerebral são altamente invasivo, diminuindo a sua aplicabilidade e restringir a gama de análises que podem ser realizadas. No entanto, outras técnicas, tais como o modelo de embolia, modelo fototrombose, modelo de acidente vascular cerebral de endotelina-1 induzida, e a oclusão da artéria cerebral média sutura intraluminal (Hmodelo CAO), estão disponíveis para utilização sem estas limitações. O modelo MCAO é uma técnica descrita neste protocolo. Ela oferece um método de confiança de indução de isquemia cerebral focal que pode ser prontamente reperfundidos e realizada de um modo de alto rendimento. Existem duas abordagens para este modelo, ou seja, os métodos Zea-Longa e Koizumi. Eles diferem ligeiramente na forma como a sutura oclusão é inserido na vasculatura. Na técnica de Zea Longa-, a sutura é inserida através da artéria carótida externa ^5. A técnica aqui apresentada é modificado a partir do método Koizumi, em que o fio de sutura de oclus é inserida através da artéria carótida comum ^6.

O modelo MCAO foi aplicado com sucesso para avaliar diferentes eventos que ocorrem durante o acidente vascular cerebral isquêmico. Após reperfusão, edema cerebral pode ser observada juntamente com a ruptura da barreira sangue-cérebro. Pico da morte neuronal é geralmente observada em 24 h; No entanto, ele revolta-se para os níveis basais após 7 dias ^7. Nos seres humanos, o sexo ea idade são variáveis importantes na determinação do resultado do curso, o que também é observado em camundongos e ratos ^{8, 9, 10.} Várias publicações têm utilizado o modelo MCAO para demonstrar a eficácia do tratamento ^{11, 12, 13, 14.}

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade de Miami Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC), de acordo com os Institutos Nacionais de diretrizes de Saúde (NIH). É necessária a utilização de equipamento estéril e técnicas assépticas.

1. Preparar o Oclusão Sutura

1. Utilize uma sutura de 0,21 mm de diâmetro para os ratos entre 20-25 g e 0,23 mm para os ratos entre 25 - 35 g de peso corporal. A escolha do tipo de sutura para o procedimento MCAO depende do peso do animal.
2. Usando uma caneta de prata, marque a sutura em 9 mm a partir da ponta de silicone revestido. Isto irá servir como um guia para o comprimento da inserção.

2. preparação para a cirurgia

1. Anestesiar rato com isoflurano misturado com o oxigênio, usando um sistema de anestesia laboratório. Use isoflurano na posição 5 e fluxo de oxigênio a 2 na máquina comercial (Veja a Tabela de Materiais). Transferir o animal ao surgery superfície e manter a anestesia utilizando um cone de nariz (use a configuração 1.5 isoflurano - 2,5 e fluxo de oxigênio a 2).
   1. Certifique-se de que a taxa respiratória do rato é de cerca de 1-2 respiração por segundo, sem ofegante. Além disso, garantir que o animal não apresenta reação estimulação bigodes e reflexo pedal (toe pitada). Monitorar a taxa de respiração e esforço durante a cirurgia, pelo menos a cada 5 min.
2. Colocar uma gota de lubrificante oftálmica em cada olho utilizando uma zaragatoa estéril para evitar que sequem durante o procedimento. Em alternativa, aplicar pomada oftálmica para o olho a partir de um tubo farmacêutica estéril.
3. Virar o animal à sua volta e fazer a barba área da incisão. Depois, desinfectar completamente a área da cirurgia utilizando 70% de etanol, seguido de cloro-hexidina, e o cotonete final com 70% de etanol. Colocar o animal em uma superfície cirúrgica quente sob um microscópio estereoscópico.

3. A dissecção da artéria carótida comum e interna / External Ramificação

1. Utilizando uma tesoura cirúrgica e uma pinça, executar uma incisão na linha média raso no pescoço, por cima do osso do peito para abaixo da mandíbula (cerca de 3-4 cm). campo cirúrgico deve ser colocada em torno da área da cirurgia para impedir que os instrumentos de entrar em contacto com superfícies não-estéreis. O campo cirúrgico foi omitido no vídeo atual para ajudar as filmagens.
2. Utilizando uma pinça, gordo cuidadosamente separados e do tecido conjuntivo para expor a traqueia. Tissue deve facilmente e naturalmente separar a ambos os lados.
3. Coloque um travesseiro (objeto redondo, cerca de 0,5 cm de diâmetro) na parte de trás do pescoço dos ratos para estender o pescoço, expondo ainda mais a área de cirurgia.
4. Abra a incisão utilizando um afastador de tecido ou ganchos.
5. No lado esquerdo do animal, da traqueia, cuidadosamente pinça para além do tecido conjuntivo para expor a artéria carótida comum esquerda (CCA). Tenha cuidado para não danificar os nervos e veias principais empacotados com o CCA.
6. Continue expondo a CCA, tomando cuidado para separar o tecido subjacente, e expor o topo de "Y" de ramificação da artéria cerebral interna (ICA) e da artéria cerebral externa (ECA). Para ajudar no descolamento da CCA, insira as pinças curvas sob o CCA para perfurar o tecido conjuntivo e depois, lentamente, permitir-lhes abrir.

4. Preparação do CCA MCAO para a inserção da sutura

1. Insira 3 segmentos de fio de náilon de cerca de 4 cm de comprimento no âmbito do CCA. Certifique-se de que o CCA não é distorcido tal como esta iria complicar drasticamente a inserção do fio de sutura.
2. No ponto mais baixo possível, feche a sutura inferior usando um nó permanente.
3. Amarre a sutura superior, logo abaixo do ICA / ECA ramificação usando um nó corrediço removível.
4. Amarre a sutura meio usando um nó corrediço removível, mas mantê-lo aberto. É importante deixar bastante espaço, para não dificultar a inserção de sutura.
5. Usando microdissection primavera scissors, realizar uma incisão no CCA entre o fundo e as suturas média. Realizar a incisão 0,2 milímetros, próximo à sutura inferior.

5. Oriente oclusão da artéria cerebral

1. Utilizando uma pinça, coloque a sutura MCAO na incisão CCA, guiando-a até o topo. Execute esta etapa rapidamente após o passo 4.5 para prevenir a coagulação e fechamento da abertura CCA. No caso em que a inserção de fio de sutura é bloqueado, usar as pontas de pinça para reabrir a incisão.
2. Gentilmente amarrar a sutura meio da parte de sutura silicone MCAO usando um nó corrediço para restringir o fluxo de sangue em torno dele, mas solta o suficiente para permitir que ele se mova livremente.
3. Cuidadosamente desfazer a sutura superior, certificando-se que a sutura MCAO não escorregar para fora.
4. Inserir o fio de sutura MCAO na ICA por um par de milímetros e, em seguida, voltar a fechar a parte superior de sutura, do mesmo modo como descrito no passo 5.2.
5. Orientar a sutura MCAO para a área de oclusão. Indicação de inserção bem sucedida éevidente pela baixa quantidade de refluxo de sangue a partir da incisão CCA e que a marca de prata 9 milímetros está situado entre a incisão e a bifurcação CCA ACI / CEA. A confirmação adicional de oclusão bem sucedida pode ser obtido utilizando métodos de controlo, tais como um sistema de monitorização de fluxo de sangue a laser Doppler ^{15, 16.}
   NOTA: Uma gota de 90% do fluxo sanguíneo para a área do cérebro do meio no lado área ocluída indica oclusão bem sucedida.
6. Após a oclusão bem sucedida, amarrar a sutura médio e superior com força. Se realizar a inserção farsa, não religamento suturas mas pule em vez de imediato para o passo 7.3.

6. Incisão Encerramento e cuidados pós-operatórios

1. Tuck nas suturas para a área da incisão.
2. Remover afastador ou tecido ganchos e travesseiro.
3. área de sutura limpa utilizando solução salina estéril e um cotonete.
4. Fechar a incisão usando nylon sutura / agulha e fórceps.
5. Administrar anti-inflamatória (por exemplo, carprofeno 10 mg / kg, sc) e analgésicos (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg / kg sc, duas vezes por dia) medicamentos para aliviar o desconforto pós-operatório. Colocar os ratinhos em uma gaiola colocada sobre uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia e dar acesso ad lábio de água e comida amolecida.
6. Monitorizar a recuperação de animais (5-10 min) e para os sinais de acidente vascular cerebral. Eles podem variar de paralisia lateral, leve e circulando a severa contração do flanco contralateral e rolamento. Vários pontos de avaliação são listadas na discussão. Animais que apresentam sinais de dificuldade respiratória ou convulsões graves devem ser sacrificados.
7. Dependendo do protocolo de reperfusão de isquemia, deixar o fio de sutura MCAO em lugar de 30 min a 120 min ou mais. Reduzindo o tempo de oclusão previne a mortalidade.
8. Para a oclusão permanente, deixar a MCAO sutura no lugar, durante 24 horas, no entanto a taxa de mortalidade significativa é que se espera. Após esse intervalo de tempo, proceder à step 7.
   1. Se usando o modelo de oclusão permanente, manter os ratos na gaiola até o ponto final. Naquele tempo, retire sutura (passos 7,1-7,8). Este procedimento também pode ser realizada após a eutanásia.

7. A reperfusão

1. Anestesiar o animal novamente (siga as instruções em 2.1) e remover suturas de fechamento da ferida.
2. Utilizando uma pinça e separadores de tecidos, re-abrir a incisão e expõem a CCA.
3. Remova cuidadosamente a sutura superior e puxe na sutura MCAO até que a parte de silicone revestido situa-se no nó meio.
4. Refazer o nó no topo da sutura para evitar que o sangue flua passar a sutura (não tem que ser um nó corrediço).
5. Cuidadosamente desfazer o nó meio e puxar a sutura após o alto nó, mas mantê-lo dentro do CCA.
6. Feche bem o nó superior para bloquear o fluxo de sangue arterial.
7. Retire completamente a sutura MCAO e fechar firmemente o nó meio.
8. A sutura pode ser MCAOre-utilizada várias vezes. Depois de cada utilização, limpar a sutura com cuidado em 70% de etanol para remover os contaminantes (por exemplo, de sangue ou de tecido), utilizando um gaze estéril. Em seguida, coloque a sutura em uma bolsa de esterilização e esterilizá-lo.
9. Repita os passos de 6,1-6,4 e monitorar a recuperação dos animais.

Análise 8. Tissue

1. Para monitorar o volume de curso, dissecar o cérebro.
   1. Eutanásia do rato utilizando um processo de duas etapas. Em primeiro lugar, expor o animal a uma overdose de isoflurano até parar de respirar. Para a coloração TTC, decapitar o mouse imediatamente e proceder à extracção do cérebro. Para o cérebro de corte (por exemplo, para as análises imuno), realização de perfusão através de uma punção cardíaca antes da decapitação.
   2. Cut-off da cabeça na base do crânio e cortar o couro cabeludo da abertura em gargalo para o topo do crânio até entre os olhos. Com a cabeça exposta, cortar o osso ao longo de ambos os lados a partir da abertura da base do crânioaté a cavidade ocular. Faça este corte ao longo da vasta parte do crânio. Tenha cuidado para não chegar muito profundo com uma tesoura para evitar danos ao cérebro.
   3. Em seguida, corte o osso entre as duas órbitas.
2. Utilizando uma pinça, levante a parte superior do crânio para expor o cérebro. Deve haver apenas uma pequena resistência. Se não levantar facilmente, incisões crânio pode estar incompleta. Retire o cérebro suavemente com uma pinça curva sem corte. O cérebro ainda pode ser anexado por vários nervos. Proceder-se lentamente, removendo anexos ao longo do caminho.
3. Colocar o cérebro fresco em uma matriz de cérebro de 1 mm, adicionar um par de gotas de PBS, e o corte ao longo da matriz, utilizando uma lâmina de barbear ou lâmina de criostato.
4. Transferir o cérebro para uma placa de 100 mm e adicionar solução de coloração (2% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio [TTC] dissolvidos em PBS) para cobrir o fundo do prato. Utilizando duas pinças, separada de todas as fatias do cérebro (parte da frente virada para baixo) e colocá-los em ordem, na parte inferior do prato.
   NOTA: A coloração vai virar tecido viável vermelho, com o tecido não viável restante branco. Aquecer a solução a 37 ° C irá acelerar coloração. Sinais de área de acidente vascular cerebral (branco) pode ser visto como o mais rapidamente 90 min após acidente vascular cerebral e permanecem visíveis durante mais de 7 dias. Imagem deve ser feito juntamente com uma régua para permitir o cálculo do volume de derrame.
5. Cérebros processam dissecados para seccionamento, imuno-coloração, isolamento de proteínas, ou uma variedade de outros procedimentos de ^{17, 18, 19.}

Resultados

O percurso de inserção do fio de sutura oclusão é demonstrado na Figura 1. A sutura MCAO é para ser encaminhado para a área de oclusão, bifurcando na ICA. oclusão bem sucedida do MCA vai levar à lesão tecidual, visível por coloração TTC. A Figura 2 apresenta imagens de manchas de animais com tratamento simulado (Figura 2A) e de um 60 min de reperfusão de isquemia MCAO animais (coloração em 90 minutos ou 24 horas após a o...

Discussão

A utilização com sucesso do método descrito MCAO é altamente dependente de uma compreensão da anatomia do fluxo sanguíneo cerebral. Desde o posicionamento correto da sutura é difícil discernir devido à falta de pistas visuais diretos, a prática repetida é importante dominar o procedimento antes de usá-lo para estudos de investigação. volume de curso devem ser analisados ​​para garantir resultados consistentes. A adição de um sistema de laser Doppler pode ajudar a determinar o sucesso da oclusão do f...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCAO suture 0.23 mm	Doccol	702345PK5Re
MCAO suture 0.21 mm	Doccol	702145PK5Re
Silver pen	staples	503205
Anesthesia machine	Vetequip	901806
Surgical scissors	Fine science tool	14558-09
Surgical forceps straight tip	Fine science tool	00108-11
Surgical forceps angled tip	Fine science tool	00109-11
Spring scissors	Fine science tool	15000-08
Nylon suture	Braintree scintific	SUT-S 104
Closing suture	VWR	95057-036
Isoflurane	Piramal
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride	FisherSci	50-121-8005
Brain block	Braintree scintific	BS-A 5000C
Cryostat blade	VWR	89202-606
Optional:
Periflux Laser doppler system	Perimed	Periflux 5000
Monitoring unit	Perimed	PF 5010 - LDPM