حمل إصابة نقص التروية ضخه في الجلد الأذن ماوس لحيوي داخلي Multiphoton التصوير من الاستجابات المناعية

Summary

يصف هذا البروتوكول تحريض نموذج نقص التروية ضخه (الأشعة تحت الحمراء) على الجلد الأذن الماوس باستخدام المغناطيس لقط. باستخدام نموذج التصوير حيوي داخلي مبنية خصيصا، ندرس في الاستجابات الالتهابية الجسم الحي بعد ضخه. الأساس المنطقي وراء تطوير هذه التقنية هو توسيع نطاق فهم كيفية استجابة الكريات البيض إلى إصابة الأشعة تحت الحمراء الجلد.

Abstract

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

Introduction

تحدث إصابة نقص التروية ضخه (IRI) عندما يكون هناك نقص الأكسجة عابرة بسبب انسداد تدفق الدم (نقص التروية)، يليه إعادة الأوكسجين اللاحق للأنسجة (ضخه). في الجلد، ويعتقد أن نقص التروية ضخه (IR) ليكون واحدا من العوامل التي تسهم في الفيزيولوجيا المرضية لقرحة الضغط، حيث الراحة في الفراش لفترات طويلة يهيئ المرضى في المستشفيات على المدى الطويل للإصابة. في هؤلاء المرضى، ويتعرض كل من الجلد والعضلات الأساسية باستمرار للضغط الوزن المبذولة على مناطق من بروز عظمي، مما أدى إلى وقوع إصابات المترجمة التي، إذا ما تركت دون علاج، يمكن أن تصبح نخرية ^1.

الأضرار تشارك في المعهد الجمهوري الدولي ذات شقين. خلال نقص التروية، وانسداد الأوعية الدموية يؤدي إلى انخفاض حاد في وصول الأكسجين إلى الأنسجة. وهذا يؤدي إلى انخفاض ATP ودرجة الحموضة، والذي يعطل ATPases تشارك في الأيض الخلوي. بدوره، مستويات الكالسيوم الخلوية السنبلة، وأكدت أو ألحقت أضرارا جملتعلمي اللغة اإلنكليزية الخضوع موت الخلايا المبرمج أو نخر ^2. الافراج عن محتويات الخلايا أو الضرر المرتبطة أنماط الجزيئية (الخام)، مثل HMGB1، ويسهم في الاستجابة الالتهابية ^3. وتحدث هذه الإهانة الثانية خلال ضخه. على الرغم من أن تتم استعادة مستويات الأوكسجين ودرجة الحموضة أثناء ضخه، وهذا يؤدي إلى توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS)، الأمر الذي يؤدي إلى أكسدة الدهون داخل الخلايا، والحمض النووي، والبروتينات. ونتيجة لذلك، يتم تنشيط وسطاء الموالية للالتهابات، والذي ينطلق من الاستجابة الالتهابية الثانوية ينطوي على تجنيد الخلايا المناعية لموقع التهابات ^2. في حين أن سلسلة من الأحداث البيوكيميائية التي أدت إلى استجابة التهابية وصفت بشكل جيد، والتنظيم المكاني والزماني للأنشطة الخلايا المناعية ليست مفهومة جيدا.

هنا، نحن تصف نموذج IR قوي على الجلد الماوس الأذن باستخدام بسيط المغناطيس لقط. إلى جانب التصوير multiphoton حيوي داخلي (MP-IVM)، ونحنأقامت نموذجا للدراسة في الجسم الحي الاستجابات الالتهابية التي تحدث بعد يأخذ ضخه مكان. الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذه التقنية هو محاولة لفهم كيفية استجابة كل من خلايا الخلالية والتسلل إلى الأشعة تحت الحمراء في الوقت الحقيقي.

النماذج الحالية من الأشعة تحت الحمراء باستخدام تقنية تحامل على الجناح الجلد هي الغازية للغاية، كما أنها تتطلب زرع جراحيا من ألواح الصلب في الجهة الجلد، مما يجعلها أقل من مثالية للدراسات المناعية ^4. وقد وصفت تقنية تحامل غير الغازية مماثلة في ^5،6 الماوس الجلد الجناح. ومع ذلك، بسبب إدراج عنصر التصوير حيوي داخلي في هذه الطريقة، ونحن بدلا من ذلك اختارت الجلد الأذن كموقع الأشعة تحت الحمراء المستهدفة، كما تلتف الحركات بسبب التنفس ويوفر الاستقرار أثناء التصوير ^7،8. وعلاوة على ذلك، مجموعات فرعية الكريات البيض التي تمتد الخلالي متطابقة بين الجلد الأذن والجهة الجلد، على الرغم من أنقد تختلف الأرقام والنسب قليلا ^9. وبالتالي، يمثل الجلد الأذن موقع التصوير المثالي.

وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم البيانات التي تم استردادها من هذه النماذج IRI محدودة لتقييم العيانية (الدرجات من القرحة) والتحليلات المجهرية من نقطة النهاية مؤشرات التهابات ^10. استخدام هذا النموذج، يتم تمكين الوقت الحقيقي التصور من الاستجابة الخلوية العدلات بعد ضخه في جلد الفأر مراسل الفلورسنت. ويستخدم نموذج التصوير الأذن حيوي داخلي نشرت سابقا ⁸ مع تعديلات إضافية (الشكلان 1 و 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وأجريت التجارب على التعامل مع الحيوانات الحية وفقا لكل استخدام الحيوانات ذات الصلة والمبادئ التوجيهية واللوائح الرعاية.

1. اختيار الفئران مراسل فلوري

1. استخدام منذ 12 أسابيع 6- لLysM-EGFP ¹¹ الفئران (أي تفضيل للذكور أو إناث).
   ملاحظة: استخدام مختلف الفئران مراسل فلوري خلية محددة يمكن التصور من الخلايا المناعية المختلفة في الجسم الحي. في هذه السلالة، وتعميم العدلات (خلايا GFP ^{مرحبا)،} وتعميم حيدات (خلايا GFP ^لو)، والضامة عن طريق الجلد (خلايا GFP ^لو) يمكن تصور. مع المعلمات التصوير المستخدمة، وسيتم الكشف فقط إشارات مضيئة من العدلات GFP إيجابية.
   ملاحظة: قائمة سلالات الفلورسنت مراسل الماوس المناعي خلايا محددة مناسبة لهذا النوع من الدراسة التصوير الجلد يمكن العثور عليها في المرجع 8.
   ملاحظة: ينصح بشدة أن يتم استخدام الفئران البيضاء للتصوير، كما pigmenالفئران تيد هي أكثر عرضة للphotodamage. وذلك لأن الجلد المصطبغ الأذن هو أكثر من ذلك بكثير حساسية لالتنقيط التي يسببها الليزر (يدل على حرق الأنسجة). ونتيجة لذلك، التوظيف العدلة وتراكم يمكن ملاحظة حتى في حالة مستقرة ^8،12.
2. الحفاظ على الفئران في (SPF) شروط معينة خالية من مسببات المرض مع دورات ضوء الظلام 12 ساعة.

2. الماوس التخدير

1. تخدير الفأر مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين-زيلازين (8 ميكرولتر ز ^-1 وزن الجسم)، ويتألف من خليط من 15 ملغ مل ^-1 الكيتامين و 1 ملغ مل ^-1 زيلازين الذائبة في الماء المعقم.
2. ضع الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية في جميع أنحاء الداخلي الإعداد. تحقق للتخدير كافية من خلال مراقبة غياب منعكس قرصة أخمص قدميه.
   ملاحظة: بعد الساعة الأولى، سوف تحتاج جرعات الربع اللاحقة من مخدر على أن تدار تحت الجلد لد- تستمر لحوالي 0.5 ساعة لكل منهما. قد يشير إلى حركة الشوارب أو الذيل أيضا أن التخدير والخفوت، وأنه لا بد من زيادة الرصيد.
3. استخدام مواد التشحيم العيون على العيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.

3. إزالة الشعر

1. تطبيق بعناية كريم مزيل الشعر إلى الأعلى ثلثي الأذن ظهري الماوس باستخدام أدوات تطبيقها القطن طرف.
2. انتظر 2-3 دقائق قبل إزالة كريم باستخدام الرطب تطبيقها القطن غيض بطريقة شاملة ولكن لطيف.
   ملاحظة: لا تسمح لكريم إزالة الشعر للبقاء على الأذن الماوس لفترة طويلة جدا، لأنها قد تحفز التهاب ^13،14.

4. تحريض نقص التروية وضخه إصابة

1. استخدام مطلية بالذهب، N42 الصف المغناطيس النيوديميوم، مم 12 × 2 مم، ومع تصنيف غاوس ما يقرب من 3000 للحث على نقص التروية في الجلد الماوس الأذن.
   ملاحظة: في هذه الحالة، ووجه مدمل من المغناطيس DENOقسم التدريب والامتحانات شمال القطب.
2. فتحة المغناطيس إلى أدلة البلاستيك الفردية.
   ملاحظة: دليل البلاستيك يعمل على تخفيف التنسيب وفصل مغناطيس عالية القوة. بسبب القوة المغناطيسية القوية بعد انخفاض المقاومة للكسر، لا تضع المغناطيس الفردية على مقربة من بعضها البعض أو المعادن الأخرى. قد يحدث الكسر وانشقاق إذا كانت سحب تجاه بعضهم البعض.
3. ضع الأول (الظهرية) المغناطيس بحيث فقط حافة على اتصال مع الثاني (بطني) المغناطيس (الشكل 3A)
   ملاحظة: يمنع هذا المغناطيس من التقاط معا قبل أن يتم وضعه بشكل صحيح.
4. وضع كل من المغناطيس بحيث المغناطيس بطني شقة تقع على الأذن (الشكل 3A).
   ملاحظة: قبل أن يتم الناجم عن نقص التروية، وضمان أن يتم الاحتفاظ الماوس عند 37 درجة مئوية، ويتم الحفاظ على التخدير الكافي (راجع الخطوة 2.2).
5. مرة واحدة على استعداد، دعونا بعناية المغناطيس معا (الشكل 3A ).
   ملاحظة: لأغراض التصوير، المشبك نصف فقط من الأذن بحيث الأشعة تحت الحمراء والمنطقة غير الأشعة تحت الحمراء ويمكن ملاحظة.
6. بعد 1.5 ساعة من نقص التروية، وإزالة المغناطيس قبل التواء المغناطيس بعيدا عن بعضها البعض باستخدام أدلة البلاستيكية، والسماح ضخه لتأخذ مكان.
   يجب توخي الحذر لمنع الآذان من التجعيد عندما يتم وضع مغناطيس: مذكرة. نقص التروية ناقصة واضح إذا كانت الأوعية الدموية الرئيسية واضحة ظاهريا على اعادة يروي فورا (أي الدم يملأ السفن فورا) بعد إزالة المغناطيس. على الرغم من أن لا يحدث ضخه مباشرة بعد إزالة المغناطيس، وانسداد الأوعية الدموية عابرة فقط. على هذا النحو، لا بد من إعداد الأذن الماوس لتصوير بأسرع وقت ممكن.

5. حقن من وكلاء وصفها الأوعية الدموية

1. مباشرة بعد إزالة المغناطيس وإدارة عن طريق الوريد (عبر الرجعية المداري أو ذيل حقن الوريد) ايفانز الأزرق (10 ملغ مل ^-1في برنامج تلفزيوني أو المالحة. 1 ميكرولتر ز ^-1 وزن الجسم) أو آخر الأوعية الدموية وصفها وكيل الاختيار.
   ملاحظة: قبل الحقن، وضمان لا تزال تحتفظ أن التخدير الكافي من أداء طيف معسر أخمص قدميه.

6. موضع الأذن على منصة التصوير

1. قطع 2 قطعة من الشريط اللاصق 1.5 سم في الطول و 1.8 سم في العرض.
2. السماح للالجانبين لاصقة لتلتصق ببعضها البعض مع ترك حوالي 1 ملم من مادة لاصقة على طول عرضه.
3. قطع الشريط اللاصق في اثنين، بالطول، لاستيعاب وضعها داخل شق على منصة الأذن.
4. إدراج هذه اخفاء الشريط حول منتصف الطريق من خلال فتحة، مثل أن الجانب اللاصق يواجه عقوبة تصل.
5. ضع الماوس على وسادة التدفئة، بحيث الأذن للتصوير بجوار الشريط اخفاء الشريط.
6. باستخدام اثنين مبلل برنامج تلفزيوني تطبيقها القطن طرف، اضغط بلطف الأذن ضد شريط لاصق.
7. استخدام الشريط كدليل، وجلب الأذن الماوسمن خلال شق في حين ضبط في وقت واحد الماوس أقرب نحو المرحلة.
8. لإزالة شريط لاصق، لأول مرة إضافة قطرة من برنامج تلفزيوني للحد من الإلتصاق من الشريط.
9. فصل الأذن الماوس من اخفاء الشريط بلطف ممكن باستخدام الفرشاة الجميلة.
10. تتسطح الأذن ضد منصة الأذن من قبل المتداول بلطف قضيب من القطن طرف رطبة على الأذن.
11. وضعت قطرة من برنامج تلفزيوني تحت ساترة (والتي يتم الاحتفاظ بها في الموقف على حامل ساترة باستخدام الشحوم، الشكل 2) وبلطف وضعه على الأذن. أعلى حتى مع أكثر PBS إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: حامل ساترة يزيد من الاستقرار أثناء التصوير.
12. إدراج التحقيق في درجة الحرارة المستقيم وتوصيل الأسلاك إلى نظام التدفئة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: ضبط درجة الحرارة لوحة التدفئة الجسم إلى 37 درجة مئوية، والأذن منصة المسرح إلى 35 درجة مئوية.

7. Multiphoton مجهر مجموعةيصل والتصوير معلمات

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول شعاع واحد، multiphoton المجهر مع الانضباطي (680 - 1080 نانومتر) تي: سا الليزر (3.3 W في 800 نانومتر، ومدة النبضة 140 خ م، و 80 ميغاهيرتز معدل التكرار) مع هدف 20X المياه (NA = 1.0) للدراسات التصوير حيوي داخلي.

1. فتح برامج التصوير.
2. محاذاة الليزر وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
3. ضبط الطول الموجي الإثارة إلى 950 نانومتر.
   ملاحظة: GFP وايفانز الأزرق يمكن أن يكون سعيدا في وقت واحد في 950 نانومتر.
4. إلى المعاينة، واستخدام الإعدادات التالية: 500 ميكرون ² scanfield، 505 س 505 بكسل القرار، وتردد المسح الضوئي 800 هرتز في مسح سطر واحد. انقر على "معاينة".
5. تبديل المخفف (ليزر) السلطة. التأكد من أن جميع الإشارات الأساسية يتم انتقاؤها من دون تعريض مجال التصوير لكميات كبيرة من الطاقة ليزر، التي ربما تتسبب في ضرر الحرارة.
   ملاحظة: تبدأ في قوة المخفف منخفضة وزيادة إذا كانت الاشاراتل قاتمة. كما العدلات سيكون غائبا عن الخلالي في وقت مبكر يشير بعد ضخه، ويمكن استخدام الضامة كمقياس لتحديد السلطة الحد الأدنى المطلوب، كما في السابق هي باهتة من العدلات.
   ملاحظة: إذا كانت هذه الخطوة ينبغي القيام به لأول مرة، وضبط الإعدادات في منطقة غير الدماغية، حيث من المتوقع سلامة الأوعية الدموية سليمة وسيسهل وضع قوة المخفف. في تجارب لاحقة، هذه الإعدادات لا تتطلب الكثير من التعديل ما لم تكن قوة الليزر غير مستقرة.
6. ضبط إعدادات PMT.
   ملاحظة: تحقق مع الشركة المصنعة للالأقصى الأمثل الجهد مكسب للPMT. ووضع التيار الكهربائي PMT خارج العتبة الموصى بها يؤدي إلى ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. التوصية العامة هي لضبط الجهد الربح PMT إلى عتبة الموصى بها لزيادة القوة المخفف عند الضرورة ينبغي أن تكون إشارة خافت جدا.
7. تحديد منطقة التصوير التي هي على مقربة منعلى حافة نقص التروية، والتي تتميز الهائل ايفانز تسرب الأزرق.
8. جمع GFP وايفانز إشارات الزرقاء باستخدام 525/50 ممر الموجة (BP) و655/40 المرشحات BP، على التوالي. لتوليد التوافقي (SHG) إشارات الثانية من ألياف الكولاجين داخل مقصورة الجلدية، واستخدام 475/42 مرشح BP.
9. إنشاء مجلد لحفظ الصور في تنسيق متوافق للبرمجيات تحليل الصور المتاحة.
10. في اكتساب جنسيتها أو استخدام الإعدادات التالية: 500 ميكرون ² scanfield، 505 س 505 بكسل القرار، ومسح تردد 400 هرتز في مسح سطر واحد.
11. 100 ميكرون ض المكدس مع حجم خطوة من 4 ميكرون يمكن الحصول عليها مرارا وتكرارا على مر الزمن، في 1 فترات دقيقة، لرصد العدلات تسلل.
    ملاحظة: وخاصة بالنسبة للالكريات البيض (على سبيل المثال، العدلات) مع سرعة المهاجرة أعلى، وهي فترة أطول من 1 دقيقة قد يؤدي الى صعوبات خلال تحليل تتبع الخلية. في هذه الحالة، يمكن للمستخدم إما أن تخفف من سماكة ميلانquisition كومة أو زيادة وتيرة المسح الضوئي.
    ملاحظة: على الرغم من كومة اكتساب المطلوبة المنطقة الدماغية قد تظهر أصغر نتيجة للضغط (تتميز بدلا من شدة مجموعات المساعدة الذاتية أعلى)، وضخه بعد ذلك التاريخ التهاب الهائل الذي يتسبب في الأذن وارما. ومن المتوقع الانجرافات كبيرة في Z-الاتجاه. على هذا النحو، واقتناء كبير ض المكدس ضروري لاستيعاب الانجراف.
12. في جميع أنحاء التصوير، أعلى حتى من برنامج تلفزيوني والماء بانتظام للحفاظ على الأذن رطبة والعدسة الشيئية مغمورة في الماء.
    ملاحظة: تجربة نموذجية عادة ما يستمر لمدة 2-4 ساعات. اعتمادا على التصميم التجريبي، وإلى جانب وجود نظام التخدير تسيطر عليها بشكل جيد، تمديد مدة التصوير غير ممكن.

8. إنهاء التجربة

1. الموت ببطء الماوس خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون وفقا لمؤسسة لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم (IACUC) العلاقات العامةocedures.
   ملاحظة: الموت ببطء دائما الماوس عن طريق الطرق المعتمدة على النحو الذي تحدده المؤسسة القواعد والأنظمة، والمبادئ التوجيهية. إذا كانت هناك حاجة التصوير المتكررة، والحفاظ على الماوس على لوحة التسخين حتى ترتدي التخدير خارج. مرة واحدة على الفأرة استعاد وعيه كافية وغير المحمول، وعودة الماوس لقفصه.

تحليل 9. صورة

ملاحظة: البيانات الناتجة عن تجربة التصوير يمكن تصور من قبل حزم البرمجيات المختلفة.

1. فتح البرنامج تحليل التصوير.
2. تحت فق الوضع، استيراد ملف (فتح → حدد أي ملف في المجلد المطلوب → اضغط على "فتح").
3. تحرير الزائفة الألوان إذا لم يتم تطبيق الألوان الافتراضية (تعديل تحرير → عرض → تحت علامة التبويب قناة، حدد اللون المطلوب من لوحة الألوان).
4. ضبط السطوع والتباين، والخلفية (تحرير → تعديل العرض → تبديل ماكس والقيم مين).
5. تأكد من أن أبعاد الملف صحيحة (تحرير خصائص → → صورة تحت علامة التبويب الهندسة، والتحقق من حجم فوكسل في هذا البروتوكول، X = 0.99، Y = 0.99، وZ = 4).
   ملحوظة: اشتقاق X و Y بقسمة البعد scanfield من قبل بيكسل. Z هو سمك بين كل شريحة.
   ملاحظة: يمكن عرض إخراج هذه مجموعات البيانات كما القصوى الأفلام الإسقاط.
   ملاحظة: مطلوب تحليل تتبع لتوصيف كامل الأنشطة الخلوية والتفاعلات من أجل فهم وظيفتها في الجسم الحي. تعليمات مفصلة لتتبع الخلية باستخدام وظيفة بقعة المتاحة في البرنامج ويمكن العثور عليها في البروتوكول في مرجع 15.
   ملاحظة: هناك العديد من الطرق لقياس الهجرة الكريات البيض، والتفاصيل التي يمكن العثور عليها في المادة مراجعة في مرجع 16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يستخدم هذا البروتوكول الجلد الأذن منصة التصوير مبنية خصيصا، كما هو مبين في الشكل 1. العديد من الميزات من هذه المنصة تم تصميمها خصيصا لتسهيل التصوير مع الحفاظ على إعدادات الفسيولوجية. وضع الأذن على منصة النحاس ساخنة لا يحافظ فقط على الأذن عن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

أهمية

الأشعة تحت الحمراء هي واحدة من الأسباب الرئيسية للقرحة الضغط الجلد. في المراحل المبكرة (الأول والثاني) من قرحة الضغط تصف حالة الجلد البشري (بالمقارنة مع الأنسجة تحت الجلد الكامنة والعضلات). ومع ذلك، فهم المسببات المناعية ما ز...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strains
Lysozyme-GFP C57BL/6	Thomas Graf, Center for Genomic Regulation
C57BL/6-C2J	Jackson Laboratories	000058	To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging
Reagents
PBS
Viaflex 0.9% (wt/vol) saline	Baxter Healthcare	F8B1323
Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride	Parnell		Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed
Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride)	Troy Laboratories		Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed.
Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline)	Sigma-Aldrich	46160
Ultrapurified water
Equipment
Insulin syringe with needle	BD	328838
Transfer pipettes	Biologix Research Company	30-0135
3 M paper masking tape	3M	2214
Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm)	Paul Marienfeld	101112
Curved splinter forceps	Aesculap, B. Braun Melsungen	BD312R
Veet hair removal cream	Reckitt Benckiser
Medical cotton-tipped applicators	Puritan Medical Products Company	806-WC
C-fold towels	Kimberly-Clark	20311
Kimwipes delicate task wipes	Kimtech Science	34155
Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick	first4magnets	F656S
Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material)			fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in
High vacuum grease	Dow Corning
Microscope
TriM Scope II single-beam two-photon microscope	LaVision BioTec
Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate)	Coherent
Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0)	Olympus	XLUMPLFLN20xW
Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue)
495 long-pass	Chroma	T495LPXR
560 lomg-pass	Chroma	T560LPXR
475/42 band-pass	Semrock	FF01-475/42-25
525/50 band-pass	Chroma	ET525/50m
655/40 band-pass	Chroma	NC028647
Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly)
A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm)
A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge)
Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation
Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform
Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640106	connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C
Resistive heater blocks RH-2	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640274	Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating.
Temperature controller TC-344B for the ear platform	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640101
Temperature controller TR-200 for mouse heating pad	Fine Science Tools	21052-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Power supply for TR-200	Fine Science Tools	21051-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Heating pad	Fine Science Tools	21060-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives.
Animal rectal probe	Fine Science Tools	21060-01	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C
Coverslip holder
2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length
1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram)
3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place
1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge
1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod
1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base.
Imaging analysis software
Imaris v8.1.2	Bitplane