פגיעה איסכמיה reperfusion התרמה בעור האוזן עכבר Intravital multiphoton הדמיה של המערכת החיסונית

Summary

פרוטוקול זה מתאר את האינדוקציה של מודל איסכמיה-רה-פרפוזיה (IR) על עור אוזן עכבר באמצעות הידוק מגנט. באמצעות מודל הדמיה intravital שהותקן, אנחנו לומדים בתגובות דלקתיות vivo-רה-פרפוזיה פוסט. הרציונל מאחורי הפיתוח של טכניקה זו היא להרחיב את ההבנה של איך לויקוציטים להגיב פגיעה בעור IR.

Abstract

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

Introduction

איסכמיה reperfusion פציעה (IRI) מתרחשת כאשר יש היפוקסיה חלף עקב החסימה של זרימת דם (איסכמיה) ואחריו מחדש חמצון הבא של הרקמות (רה-פרפוזיה). בעור, איסכמיה-רה-פרפוזיה (IR) הוא חשב להיות אחד הגורמים התורמים בפתופיזיולוגיה של פצעי לחץ, שם מנוחה במיטה ממושכת גוזר מאושפזים בבתי חולים לטווח ארוך על פשע. בחולים אלה, הוא את העור ואת השרירים הבסיסיים חשופים כל זמן בלחץ משקל המופעל על פני שטחים של בליטה גרמית, שגרמו לפציעה מקומית כי, אם אינו מטופל, עלול להפוך נימק ^1.

הנזקים המעורבים IRI הם שתיים. במהלך איסכמיה, על חסימת כלי דם מובילה לירידה דרסטית של אספקת חמצן לרקמות. התוצאה היא ירידה של ATP ו- pH, אשר מנטרל ATPases מעורב חילוף חומרים תאיים. בתורו, רמות סידן הסלולר ספייק, והדגישו או פגום גאמות עוברים אפופטוזיס או נמק ^2. שחרור תוכן תאי או דפוסים מולקולריים הקשורים ניזק (לח), כמו HMGB1, תורם את התגובה הדלקתית ^3. העלבון השני מתרחש במהלך רה-פרפוזיה. למרות שרמות החמצן pH משוחזרים במהלך רה-פרפוזיה, זו התוצאה בדור של מינים חמצן תגובתי (ROS), אשר מוביל חמצון של שומנים תאיים, DNA וחלבונים. כתוצאה מכך, מתווכים פרו-דלקתיים מופעלים, אשר מגדירה את תגובה דלקתית משני המערבת את הגיוס של תאים חיסוניים לאתר הדלקתי ^2. בעוד מפל של אירועים ביוכימיים שהובילו את התגובה הדלקתית תוארה היטב, הסדרת במרחב ובזמן של פעילות התא החיסון אינם מובנים היטב.

כאן אנו מתארים מודל IR חזק על עור עכבר אוזן באמצעות הידוק פשוט מגנט. יחד עם הדמיה intravital multiphoton (MP-IVM), אנוהוקם מודל ללמוד את התגובות הדלקתיות vivo ב המתרחשות לאחר רה-פרפוזיה מתרחש. הרציונל מאחורי פיתוח השימוש בטכניקה זו הוא לנסות להבין איך היא ביניים שחדר לתאים להגיב IR בזמן אמת.

מודלים קיימים של IR באמצעות טכניקת ההידוק בכנף העור הם פולשני מאוד, כפי שהם דורשים ההשתלה כירורגית של לוחות פלדה ב בכנף העור, מה שהופך אותם פחות מ-אידיאלי עבור מחקרים אימונולוגית ^4. טכניקת הידוק דומה פולשני תוארה ב ^5,6 אגף עור עכבר. עם זאת, בשל השילוב של מרכיב הדמית intravital בשיטה זו, אנו בחרנו ב- עור האוזן כאתר IR הממוקד, כפי שהוא עוקף תנועות עקב נשימה מציע יציבות במהלך הדמית ^7,8. יתר על כן, תת לויקוציטים כי היקף interstitium זהים בין עור האוזן ואת אגף העור, אם כימספרים ופרופורציות עשויים להשתנות מעט ^9. לכן, עור האוזן ייצג אתר הדמיה אידיאלי.

בנוסף, רוב הנתונים שנמצאו ממודלי IRI אלה מוגבלים הערכות מקרוסקופית (לדירוג של כיבים) וניתוחים מיקרוסקופים של אינדיקטורים דלקתיים סיום ^10. באמצעות מודל זה, ויזואליזציה בזמן אמת של התגובה התאית של נויטרופילים לאחר רה-פרפוזיה בעור של עכבר כתב ניאון מופעלת. מודל הדמית אוזן intravital שפורסם בעבר מנוצל ⁸ עם שינויים נוספים (איורים 1, 2).

Protocol

כל הניסויים העוסקים בבעלי החיים נערכו בהתאם לכל שימוש בבעלי החיים הרלוונטי והנחיות טיפול ותקנות.

1. בחירה של עכברי כתב ניאון

1. השתמש 6 ל- 12 שבועות בן LysM-eGFP ¹¹ עכברים (לא העדפה או זכרים או נקבות).
   הערה: שימוש עכברי כתב ניאון תא ספציפי שונים מאפשר ההדמיה של תאים חיסוניים שונים in vivo. בנימה זו, במחזור נויטרופילים (תאי ^היי GFP), במחזור מונוציטים (תאי ^lo GFP), ו מקרופאגים עורי (תאים ^lo GFP) ניתן דמיינו. עם משמשים את הפרמטרים הדמיה, רק את האותות וצחים נויטרופילים GFP חיובי יזוהו.
   הערה: רשימה של זני עכבר כתב ניאון חיסוני תאים ספציפיים מתאימים לסוג כזה של מחקר הדמית עור ניתן למצוא סימוכי 8.
   הערה: מומלץ מאוד כי עכברים לבקנים לשמש הדמיה, כמו חזירעכברי טד נוטים יותר ניזקים. הסיבה לכך היא כי עור אוזן פיגמנט הוא הרבה יותר רגיש שנקר ליזר מושרה (שמעיד על שריפת רקמות). כתוצאה מכך, גיוס נויטרופילים וצבירה אפשר לראות גם במהלך המצב היציב ^8,12.
2. שמור על העכברים ספציפיים הפתוגן ללא (SPF) תנאים עם מחזורי אור כהה 12 שעות.

2. עכבר הרדמה

1. להרדים את העכבר עם זריקה תוך הצפק של xylazine קטמין (8 μL g ^-1 משקל גוף), מורכב מתערובת של 15 מ"ג מ"ל ^-1 קטמין ו 1 מ"ג מ"ל ^-1 xylazine מומס במים סטריליים.
2. מניחים את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף שלה ב 37 מעלות צלזיוס לאורך כל ההליך הכנה. בדוק הרדמה מספיק ידי התבוננות היעדר רפלקס קמצוץ הבוהן.
   הערה: אחרי השעה הראשונה, מינונים ברבעון הבאים של הרדמה יהיו צורך תת-עוריתד יימשך כ 0.5 שעות כל אחד. עווית שפם או הזנב עשויה גם להצביע על כך ההרדמה מתפוגגת וכי נדרש למעלה למעלה.
3. השתמש סיכת עיניים על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.

3. אפילציה

1. בזהירות להחיל קרם מקריח לשני השלישים העליונים של אוזן עכבר הגבה באמצעות applicators כותנה-טיפ.
2. חכה 2 - 3 דקות לפני הסרת הקרם באמצעות applicators כותנה-טיפ רטוב באופן יסודי אך עדין.
   הערה: אל תאפשרו הסרת שיער קרם להישאר על אוזן העכבר במשך זמן רב מדי, מכיוון שהוא עלול לגרום דלקת ^13,14.

אינדוקציה 4. של איסכמיה ו reperfusion פגיעה

1. השתמש מגנטים ניאודימיום מצופה זהב, N42 כיתה, 12 מ"מ קוטר x 2 מ"מ עובי, ועם דירוג גאוס של כ -3,000 לגרום איסכמיה בעור העכבר האוזן.
   הערה: במקרה זה, לנוכח הגומות של המגנטים denotes הקוטב הצפוני שלה.
2. חריץ המגנטים לתוך מדריכי הפלסטיק האישיים שלהם.
   הערה: מדריך הפלסטיק משמש כדי להקל על המיקום ופרדה של מגנטי חוזק הגבוה. בשל הכח המגנטי החזק שלהם עדיין התנגדות נמוכה שביר, אל תניחו מגנטים בודדים בסמיכות זה לזה או מתכות אחרות. גרוטאות לשבבים עלולות להתרחש אם הם מושכים אחד כלפי שניים.
3. מקם את המגנט הראשון (הגבה) כגון רק שהקצה נמצא בקשר עם המגנט השני (הגחון) (איור 3 א)
   הערה: פעולה זו מונעת מגנטים מ snapping יחד לפני שהם הוצבו כראוי.
4. מקם שני המגנטים כך מגנט הגחון שוכב על (איור 3 א) האוזן.
   הערה: לפני איסכמיה מושרת, להבטיח כי העכבר נשמר על 37 מעלות צלזיוס, כי ההרדמה מספיק נשמרה (ראה שלב 2.2).
5. ברגע מוכן, בזהירות ולתת מגנטים מתאחדים (איור 3 א ).
   הערה: למטרות הדמיה, מהדק רק מחצית האוזן כך אזור IR והלא-IR ניתן לצפות.
6. לאחר 1.5 שעות של איסכמיה, להסיר את המגנטים על ידי סיבוב משם המגנטים זה מזה באמצעות מדריכים פלסטיק, המאפשר רה-פרפוזיה להתקיים.
   הערה: יש להקפיד על מנת למנוע את האוזניים מן הקמטים כאשר ממוקמים המגנטים. איסכמיה Incomplete ניכרה אם כלי דם גדול הגלויים macroscopically מחדש Perfuse מייד (כלומר, דם ממלא את הכולים מייד) לאחר המגנטים יוסרו. למרות רה-פרפוזיה אינה מתרחשת מיד לאחר הסרת מגנטים, חסימה של כלי דם הוא רק חולף. ככזה, הוא הכרחי כדי להכין את אוזן עכבר הדמיה מהר ככל האפשר.

5. הזרקה של סוכני תיוג כלי הדם

1. מיד לאחר הסרת מגנט, לנהל לווריד (באמצעות הזרקה לווריד רטרו מסלולית או זנב) אוונס כחול (10 מ"ג מ"ל ^-1ב PBS או תמיסת מלח; 1 μL g ^-1 משקל גוף) או סוכן אחר תיוג כלי דם של בחירה.
   הערה: לפני הזריקה, להבטיח כי ההרדמה מספיק עדיין נשמרה על ידי ביצוע צביטת בוהן עדינה.

6. מיקום של האוזן על פלטפורמת ההדמיה

1. חותכים 2 חתיכות של נייר דבק 1.5 ס"מ אורך ו -1.8 ס"מ רוחב.
2. אפשר הצדדים הדבקים להיצמד זו לזו תוך השארה על 1 מ"מ של דבק לאורך רוחבו.
3. חותכים את קלטת מסוך לשניים, לאורך, כדי להתאים את מיקומה בתוך החריץ על פלטפורמת האוזן.
4. הכנס קלטת מסוך זה בערך באמצע החריץ, כגון שהצד הדבק פונה כלפי מעלה.
5. מקם את העכבר על כרית חימום, כך האוזן להיות צילמו נמצא ליד רצועת בסרט הדבקה.
6. באמצעות שני אפליקטורים כותנה-טיפ-טבולה PBS, לחץ בעדינות על האוזן נגד פס הדבקה.
7. באמצעות הרצועה כמדריך, להביא את אוזן העכברדרך החריץ תוך התאמה והעכבר לקראת השלב בו זמנית.
8. כדי להסיר את הסרט הדביק, ראשון להוסיף טיפה של PBS להפחתת הדביקות של הקלטת.
9. הפרד את אוזן העכבר מהקלטת המיסוך בעדינות ככל האפשר באמצעות מכחול בסדר.
10. שטח את האוזן כנגד במת האוזן על ידי גלגול מוליך כותנת טיפ לח בעדינות מעל האוזן.
11. שים טיפת PBS מתחת coverslip (אשר נשמר בעמדה על בעל coverslip באמצעות גריז; איור 2) בעדינות ולהניח אותה על האוזן. הוספת הכספים עם PBS יותר במידת הצורך.
    הערה: בעל coverslip מגביר את היציבות במהלך הדמיה.
12. הכנס את בדיקת הטמפרטורה רקטלית לחבר את החוטים אל מערכת החימום פי הוראות היצרן.
    הערה: הגדר את הטמפרטורה של כרית חימום גוף ל -37 מעלות צלזיוס ואת פלטפורמת במת האוזן עד 35 ° C.

7. multiphoton מיקרוסקופ הגדרמעלה פרמטרי הדמיה

הערה: פרוטוקול זה משתמש קרן אחת, מיקרוסקופ multiphoton עם מתכונן (680 - 1,080 ננומטר) Ti: ליזר Sa (3.3 W ב 800 ננומטר; אורך הפולס של 140 fs; שיעור החזרה 80 MHz) עם מטרת מים 20X (NA = 1.0) עבור בדיקות הדמיה intravital.

1. פתח את תוכנת ההדמיה.
2. יישר את הלייזר על פי הוראות היצרן.
3. להתאים את אורך הגל עירור על 950 ננומטר.
   הערה: GFP וכחול אוונס יכול להיות נרגש בו זמנית ב 950 ננומטר.
4. כדי לצפות בתצוגה מקדימה, השתמש את ההגדרות הבאות: 500 מיקרומטר ² scanfield, 505 x 505 פיקסלים ברזולוציה, ואת תדר סריקה של 800 רץ ב סריקת שורה אחת. לחץ על "תצוגה מקדימה".
5. למתג את הכוח מחליש (לייזר). ודא שכל אותות חיוניים נאספות בלי לחשוף בתחום ההדמיה כדי כמויות עודפות של כוח לייזר, אשר עשוי לגרום נזק חום.
   הערה: התחל בהספק מחליש נמוך ולהגדיל אם סייגl מעומעמת. כפי נויטרופילים ייעדר מן interstitium בשלב מוקדם מצביע שלאחר reperfusion, מקרופאגים יכול לשמש מד כדי לקבוע את הכוח המינימלי הנדרש, כמו לשעבר הם דימר מאשר נויטרופילים.
   הערה: אם צעד זה צריך להיעשות בפעם הראשונה, להתאים את הגדרות באזור שאינו איסכמי, שם שלמות כלי דם ללא פגע צפויה ויאפשר את ההגדרה של הכח המחליש. בניסויים הבאים, הגדרות אלו אינן מחייבות שינוי הרבה אלא אם כוח לייזר אינו יציב.
6. התאם את הגדרות PMT.
   הערה: בדוק עם היצרן עבור מתח רווח המקסימאלי האופטימלי עבור PMT. הגדרת מתח PMT מעבר לסף המומלץ תגרום יחס אות לרעש גבוה. ההמלצה הכללית היא לקבוע את מתח רווח PMT אל הסף המומלץ להגדיל את הכח מחליש לפי צורך צריכה את האות להיות כהה מדי.
7. בחר אזור הדמיה כי הוא בסמיכותקצה איסכמיה, המאופיינת דליפה כחולה מסיבי אוונס.
8. אסוף GFP אותות אוונס כחול באמצעות bandpass 525/50 (BP) ומסננים BP 655/40, בהתאמה. עבור דור הרמוני שניים (SHG) אותות של סיבי קולגן בתוך תא עורי, להשתמש במסנן 475/42 BP.
9. צור תיקייה לשמור את התמונות בפורמט תואם עבור תוכנת ניתוח תמונה הזמינה.
10. לרכוש, להשתמש בהגדרות הבאות: 500 מיקרומטר ² scanfield, 505 x 505 פיקסלים ברזולוציה, וכן רץ סריקה בתדר 400 סריקת שורה אחת.
11. 100 מיקרומטר Z- מחסנית עם גודל צעד של 4 מיקרומטר ניתן לרכוש שוב ושוב לאורך זמן, ב 1 במרווחים דקות, כדי לפקח חדירת נויטרופילים.
    הערה: במיוחד עבור לויקוציטים (למשל, נויטרופילים) עם מהירות נדידה גבוהה, מרווח ארוך יותר מזה של 1 דק 'עלול לגרום קשיים במהלך ניתוח מעקב תא. במקרה זה, המשתמש יכול גם להפחית את העובי של acquisition מחסנית או להגדיל את תדירות הסריקה.
    ההערה: כאשר מחסנית הרכישה הנדרשת של אזור איסכמי עשויה להופיע קטנה כתוצאה של הדחיסה (המאופיינת לחלופין על ידי עוצמת SHG גבוהה), רה-פרפוזיה עוקבת תגרום לדלקת מסיבית שגורמת לאוזן להתנפח. מרחף מהותי-בכיוון Z צפוי. ככזה, רכישת z-ערימה גדולה יש צורך להתאים את הסחף.
12. במהלך ההדמיה, הדף את PBS ומים באופן קבוע כדי לשמור על האוזן לחה העדשה האובייקטיבית השקועה במים.
    הערה: ניסוי טיפוסי בדרך כלל נמשך 2 - 4 h. בהתאם לעיצוב ניסיוני, בשילוב עם משטר הרדמה מבוקר היטב, הארכת משך ההדמיה אפשרית.

8. סיום הניסוי

1. להרדים את העכבר על ידי מחנק פחמן דו חמצני על פי טיפול בבעלי החיים המוסדי של מוסד ועדת שימוש (IACUC) יחסי ציבורocedures.
   הערה: תמיד להרדים את העכבר על ידי שיטות אשרו כפי שנקבע על ידי הכללים של המוסד, תקנות והנחיות. אם הדמיה חוזרת ונשנית נדרשת, לשמור את העכבר על כרית החימום עד ההרדמה פגה. לאחר העכבר שב להכרתו הנאותה והנו גורם נייד, להחזיר את העכבר לכלוב שלה.

ניתוח תמונה 9.

הערה: נתונים שנוצרו מניסוי ההדמיה ניתן דמיינו ידי חבילות תוכנה שונות.

1. פתח את תוכנת ניתוח הדמיה.
2. לעלות מצב תחת, לייבא את הקובץ (פתוח → לבחור כל קובץ בתיקייה הרצויה → לחץ "לפתוח").
3. צבעים פסאודו ערוך אם מצבעי ברירת מחדל אינו חלים (לכיוון תצוגה → ערוך → בכרטיסיית הערוץ, בחרו את הצבע הרצוי מתוך לוח הצבעים).
4. התאם את הבהירות, הניגודיות, ורקע (Edit → לכיוון תצוגת → מקס Toggle וערכי מינ ').
5. ודא כי ממדי הקובץ נכון (Edit → מאפייני תמונה → בכרטיסיית הגיאומטריה, לבדוק את גודל voxel. בפרוטוקול זה, X = 0.99, Y = 0.99, ו- Z = 4).
   הערה: לגזור X ו- Y על ידי חלוקת מימד scanfield ידי פיקסל ברזולוציה. Z הוא העובי בין כל פרוסה.
   הערה: תפוקת ערכות נתונים אלה ניתן להציג סרטי הקרנת מקסימלית.
   הערה: ניתוח מעקב נדרש לאפיין את פעילות הסלולר מלא ואינטראקציות על מנת להבין את תפקידם in vivo. הוראות מפורטות של מעקב תאים באמצעות פונקצית המקום הפנויה בתוכנה ניתן למצוא בפרוטוקול סימוכין 15.
   הערה: ישנן דרכים רבות של הגירה לויקוציטים לכימות, שפרטיו ניתן למצוא במאמר ביקורת ההפניה 16.

תוצאות

פרוטוקול זה משתמש פלטפורמת הדמית עור שהותקנה אוזן, כפי שמוצג באיור 1. מספר תכונות של פלטפורמה זו נועדו במיוחד כדי להקל הדמיה תוך שמירת הגדרות פיסיולוגיות. הצבת האוזן על פלטפורמת פליז המחוממת לא רק שומרת על האוזן בטמפרטורה פיזיולוגית של 35 מע...

Discussion

מַשְׁמָעוּת

IR הוא אחד הגורמים המובילים של פצעי לחץ עור. בשלבים הראשונים (I ו- II) של פצעי לחץ לתאר את מצבו של העור האנושי (לעומת רקמות תת עורית הבסיסית והשרירים). עם זאת, הבנה של האטיולוגיה אימונולוגיים עדיין לוקה בחסר. כאן, אנו מציגים מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strains
Lysozyme-GFP C57BL/6	Thomas Graf, Center for Genomic Regulation
C57BL/6-C2J	Jackson Laboratories	000058	To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS
Viaflex 0.9% (wt/vol) saline	Baxter Healthcare	F8B1323
Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride	Parnell		Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed
Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride)	Troy Laboratories		Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed.
Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline)	Sigma-Aldrich	46160
Ultrapurified water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Insulin syringe with needle	BD	328838
Transfer pipettes	Biologix Research Company	30-0135
3M paper masking tape	3M	2214
Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm)	Paul Marienfeld	101112
Curved splinter forceps	Aesculap, B. Braun Melsungen	BD312R
Veet hair removal cream	Reckitt Benckiser
Medical cotton-tipped applicators	Puritan Medical Products Company	806-WC
C-fold towels	Kimberly-Clark	20311
Kimwipes delicate task wipes	Kimtech Science	34155
Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick	first4magnets	F656S
Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material)			fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in
High vacuum grease	Dow Corning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
TriM Scope II single-beam two-photon microscope	LaVision BioTec
Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate)	Coherent
Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0)	Olympus	XLUMPLFLN20xW
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue)
495 long-pass	Chroma	T495LPXR
560 lomg-pass	Chroma	T560LPXR
475/42 band-pass	Semrock	FF01-475/42-25
525/50 band-pass	Chroma	ET525/50m
655/40 band-pass	Chroma	NC028647
Name	Company	Catalog Number	Comments
Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly)
A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm)
A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge)
Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation
Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform
Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640106	connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C
Resistive heater blocks RH-2	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640274	Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating.
Temperature controller TC-344B for the ear platform	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640101
Temperature controller TR-200 for mouse heating pad	Fine Science Tools	21052-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Power supply for TR-200	Fine Science Tools	21051-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Heating pad	Fine Science Tools	21060-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives.
Animal rectal probe	Fine Science Tools	21060-01	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip holder
2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length
1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram)
3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place
1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge
1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod
1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging analysis software
Imaris v8.1.2	Bitplane