Induzindo a lesão de isquemia-reperfusão na pele da orelha de rato por Intravital Multiphoton imagem de respostas imunes

Resumo

Este protocolo descreve a indução de um modelo de isquemia-reperfusão (IR) em pele de orelha de rato usando íman de fixação. Usando um modelo de imagens intravital custom-built, estudamos nas respostas inflamatórias in vivo pós-reperfusão. A lógica por trás do desenvolvimento desta técnica é ampliar a compreensão de como leucócitos responder a uma lesão IR pele.

Resumo

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

Introdução

lesão de isquemia-reperfusão (IRI) ocorre quando há uma hipoxia transitória devido à obstrução do fluxo sanguíneo (isquemia), seguido por uma subsequente re-oxigenação dos tecidos (reperfusão). Na pele, isquemia-reperfusão (IR) é pensado para ser um dos fatores que contribuem para a fisiopatologia das úlceras de pressão, onde repouso prolongado predispõe os pacientes do hospital de longo prazo para a lesão. Nesses pacientes, a pele e os músculos subjacentes são constantemente expostos a pressão do peso exercido sobre áreas de proeminência óssea, resultando em lesões localizadas que, se não tratada, pode tornar-se necrótica ^1.

Os danos envolvidos em um IRI são duas. Durante a isquemia, a oclusão de vasos sanguíneos conduz a uma redução drástica da entrega de oxigénio aos tecidos. Isto resulta numa diminuição de ATP e pH, que inactiva ATPases envolvidas no metabolismo celular. Por sua vez, os níveis de cálcio celular pico, e salientou ou danificado cells sofrem apoptose ou necrose ^2. A liberação de conteúdo intracelular ou padrões moleculares danos associados (DAMP), como HMGB1, contribui para a resposta inflamatória ^3. O segundo insulto ocorre durante a reperfusão. Embora os níveis de oxigénio e de pH são restaurados durante a reperfusão, isto resulta na geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS), o que leva à oxidação de lípidos intracelulares, DNA e proteínas. Por conseguinte, os mediadores pró-inflamatórios são activados, o que desencadeia uma resposta inflamatória secundária que envolve o recrutamento das células imunes para o local inflamatório ^2. Enquanto a cascata de acontecimentos bioquímicos que conduzem à resposta inflamatória tem sido bem descrito, a regulação espacial e temporal das actividades celulares imunitárias não são bem compreendidos.

Aqui, descrevemos um modelo IR robusta na pele de orelha de rato usando simples aperto ímã. Juntamente com a imagem multiphoton intravital (MP-IVM), nósestabeleceu um modelo para estudar as respostas inflamatórias in vivo que ocorrem após a reperfusão ocorre. A lógica por trás do desenvolvimento e uso desta técnica é tentar entender como ambas as células intersticiais e infiltrando responder a IR em tempo real.

Modelos existentes de IR utilizando a técnica de fixação na lateral da pele são altamente invasivo, uma vez que exigem a implantação cirúrgica de placas de aço no flanco da pele, tornando-os menos do que o ideal para estudos imunológicos ^4. Uma técnica de fixação não-invasiva semelhante foi descrito na pele do rato ^5,6 flanco. No entanto, devido à incorporação da componente de imagem intravital neste método, que em vez escolheu a pele da orelha como o local de IR alvo, uma vez que contorna os movimentos devidos à respiração e oferece estabilidade durante a imagiologia de ^7,8. Além disso, subconjuntos de leucócitos que se estendem por o interstício são idênticos entre a pele da orelha e o flanco da pele, embora onúmeros e proporções podem variar ligeiramente ^9. Assim, a pele da orelha representa um local de imagem ideal.

Além disso, a maioria dos dados obtidos a partir destes modelos IRI são limitadas a avaliações macroscópicas (classificação de úlceras) e análises microscópicas de endpoint indicadores inflamatórios ^10. Utilizando este modelo, a visualização em tempo real, da resposta celular de neutrófilos após a reperfusão na pele de um rato repórter fluorescente é activado. Um modelo de imagem da orelha intravital publicado anteriormente é utilizado ⁸ com modificações adicionais (Figuras 1, 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

Todos os experimentos que lidam com animais vivos foram conduzidos de acordo com todo uso de animais relevantes e diretrizes e regulamentos de cuidados.

1. Escolha do Mice repórter fluorescentes

1. Use de 6 a 12 semanas de idade LysM-eGFP ¹¹ ratos (sem preferências para machos ou fêmeas).
   Nota: O uso de vários ratinhos repórter fluorescente específico de células permite a visualização de diferentes células imunitárias in vivo. Nesta estirpe, os neutrófilos (células GFP ^hi) circulante, monócitos (células GFP ^LO), e os macrófagos dérmicos (células GFP ^LO) circulante pode ser visualizado. Com os parâmetros de imagiologia usado, apenas os sinais luminosos de neutrófilos GFP-positiva será detectado.
   Nota: Uma lista de estirpes de rato fluorescente repórter-imune específica de células adequadas para este tipo de estudo de imagem da pele pode ser encontrado na referência 8.
   Nota: É altamente recomendável que os ratos albino ser usado para geração de imagens, como pigmencamundongos ted são mais propensas a photodamage. Isto é porque a pele da orelha pigmentada é muito mais sensível a salpicar induzida por laser (indicativo de queima de tecido). Como resultado, o recrutamento dos neutrófilos e acumulação pode ser observado, mesmo durante o estado estacionário ^8,12.
2. Mantenha os ratos (SPF) condições específicas isentos de agentes patogénicos com ciclos de luz-escuro de 12 h.

2. Rato Anestesia

1. Anestesiar o rato com uma injecção intra-peritoneal de cetamina-xilazina (8 mL g ^-1 de peso corporal), composto por uma mistura de 15 mg mL ^-1 de cetamina e 1 mg mL ^-1 de xilazina dissolvido em água estéril.
2. Colocar o rato sobre uma almofada de aquecimento para manter a sua temperatura do corpo a 37 ° C durante todo o procedimento de preparação. Verifique para anestesia suficientes observando a ausência de um reflexo toe pitada.
   Nota: Após a primeira hora, as doses subsequentes trimestre de anestésico terá de ser administrado por via subcutânea umad terá a duração de aproximadamente 0,5 h cada um. O movimento das vibrissas ou a cauda também pode indicar que a anestesia é esgotando e que a top-up é necessário.
3. Use lubrificante oftálmica nos olhos para evitar a secura e sob anestesia.

3. Depilação

1. Cuidadosamente aplicar creme depilatório para os dois terços superiores da orelha de rato dorsal utilizando aplicadores de algodão de ponta.
2. Espere por 2-3 min antes de remover o creme usando aplicadores de algodão-tip molhadas de uma forma profunda mas gentil.
   Nota: Não permita que creme de depilação para permanecer na orelha de rato por muito tempo, pois pode induzir a inflamação ^13,14.

4. indução de isquemia e reperfusão

1. Use banhados a ouro, N42-grade imãs de neodímio, 12 mm de diâmetro x 2 mm de espessura e com uma classificação Gauss de aproximadamente 3.000 para induzir isquemia na pele de orelha de rato.
   Nota: Neste caso, a face de covinhas dos imans denotes seu pólo norte.
2. Encaixar os ímãs em suas guias de plástico individuais.
   Nota: O guia de plástico serve para facilitar a colocação e a separação dos imans de alta resistência. Devido à sua forte força magnética ainda uma baixa resistência à ruptura, não coloque imans individuais em estreita proximidade uns com os outros ou com outros metais. Sucata e fragmentação pode ocorrer se eles puxam para o outro.
3. Posicionar o primeiro (dorsal) imã de tal forma que apenas a borda está em contacto com o segundo (ventral) ímã (Figura 3a)
   Nota: Isto evita que os ímãs de encaixe juntos antes de terem sido devidamente posicionado.
4. Posicione os dois ímãs de tal modo que o íman ventral está acomodada na orelha (Figura 3a).
   Nota: Antes de isquemia é induzida, garantir que o mouse é mantida a 37 ° C e que a anestesia suficiente é mantida (veja o passo 2.2).
5. Depois de pronto, cuidadosamente deixar os ímãs vêm juntos (Figura 3a ).
   Nota: Para fins de imagiologia, clamp apenas metade da orelha de modo que pode ser observada uma IR e região não-IR.
6. Após 1,5 h de isquemia, remover os imans rodando os imans de distância umas das outras utilizando as guias de plástico, permitindo a reperfusão a ter lugar.
   Nota: É preciso ter cuidado para evitar que as orelhas fiquem enrugados quando os ímãs são colocados. Isquemia incompleta é evidente se os vasos sanguíneos major macroscopicamente visíveis re-orvalhar imediatamente (ou seja, o sangue enche os vasos imediatamente) depois que os ímãs são removidos. Embora a reperfusão não ocorre imediatamente após a remoção dos ímans, oclusão de vasos sanguíneos é de apenas transitória. Como tal, é imperativo para preparar a orelha de rato para geração de imagens tão rapidamente quanto possível.

5. A injeção de agentes de marcação do navio de sangue

1. Imediatamente após a remoção ímã, administrar por via intravenosa (via retro-orbital ou injeção na veia da cauda) azul de Evans (10 mg mL ^-1em PBS ou solução salina; 1 mL g ^-1 de peso corporal) ou outro agente de rotulagem vaso sanguíneo de escolha.
   Nota: Antes da injecção, certifique-se que a anestesia suficiente ainda é mantida através da realização de beliscar toe suave.

6. Colocação da orelha sobre a plataforma de imagem

1. Corte 2 pedaços de fita adesiva com 1,5 cm de comprimento e 1,8 cm de largura.
2. Permitir que os lados adesivas para ficar juntos mesmo tempo que deixa cerca de 1 mm de adesivo ao longo da sua largura.
3. Cortar a fita adesiva em duas partes, no sentido do comprimento, para acomodar a sua colocação no interior da fenda na plataforma orelha.
4. Inserir esta fita adesiva sobre a meio caminho através da fenda, de modo que o lado adesivo virado para cima.
5. Posicione o mouse sobre a almofada de aquecimento, de modo que o ouvido a ser trabalhada fica ao lado da tira de fita adesiva.
6. O uso de dois aplicadores de algodão-tip PBS-umedecidos, pressione suavemente o ouvido contra a fita adesiva.
7. Utilizando a tira de guia, trazer a orelha de ratoatravés da fenda enquanto ajusta simultaneamente o mouse para mais perto do palco.
8. Para remover a fita adesiva, o primeiro adicionar uma gota de PBS para reduzir a aderência da fita.
9. Separe a orelha de rato a partir da fita adesiva o mais suavemente possível usando um pincel fino.
10. Achatar a orelha contra a plataforma de ouvido rolando delicadamente um aplicador de algodão-ponta úmida sobre a orelha.
11. Colocar uma gota de PBS por baixo da lamela (que é mantido em posição no suporte da lamela utilizando massa lubrificante; Figura 2) e colocá-lo suavemente sobre a orelha. Complete com mais PBS, se necessário.
    Nota: O titular lamela aumenta a estabilidade durante o exame.
12. Inserir a sonda de temperatura rectal e ligar os fios para o sistema de aquecimento de acordo com as instruções do fabricante.
    Nota: Ajustar a temperatura da almofada de aquecimento do corpo a 37 ° C e a plataforma fase orelha a 35 ° C.

7. Multiphoton Microscópio Sete parâmetros de imagem

Nota: Este protocolo usa um único feixe, multiphoton microscópio com um ajustável (680 - 1080 nm) Ti: Sa laser (3,3 W a 800 nm; comprimento de pulso de 140 fs; taxa de repetição de 80 MHz) com um objetivo 20X água (NA = 1.0) para estudos de imagem intravital.

1. Abra o software de imagem.
2. Alinhar a laser de acordo com as instruções do fabricante.
3. Ajustar o comprimento de onda de excitação a 950 nm.
   Nota: GFP e azul Evans pode ser ao mesmo tempo animado em 950 nm.
4. Para visualização, use as seguintes configurações: 500 mm ² scanfield, pixel de resolução 505 x 505, e uma frequência de varredura de 800 Hz em uma única varredura de linha. Clique em "Preview".
5. Alternar o poder atenuador (laser). Assegurar que todos os sinais essenciais são apanhados, sem expor o campo de imagem a quantidades excessivas de potência do laser, o que pode induzir danos provocados pelo calor.
   Nota: Comece com uma potência baixa atenuador e aumentar se o signal é fraca. Como neutrófilos estará ausente do interstício no início do tempo de pós-reperfusão aponta, os macrófagos podem ser utilizadas como um indicador para determinar a potência mínima exigida, já que são mais escuro do que os neutrófilos.
   Nota: Se essa etapa é para ser feito, pela primeira vez, ajuste as configurações na zona de não-isquêmica, onde se espera que a integridade vascular intacta e facilitará a definição do poder atenuador. Em experiências posteriores, estas definições não exigem muita modificação, a menos que a potência do laser é instável.
6. Ajustar as configurações PMT.
   Nota: Verifique com o fabricante para a tensão de ganho ideal máxima para o PMT. Ajustando a tensão PMT para além do limite recomendado vai resultar em uma maior proporção de sinal-para-ruído. A recomendação geral é para definir a tensão de ganho de PMT para o limite recomendado e para aumentar o poder atenuador conforme necessário, caso o sinal seja muito fraca.
7. Selecione uma região de imagem que está em estreita proximidade coma borda da isquemia, caracterizado por o vazamento de azul de Evans em massa.
8. Recolha GFP e os sinais azuis Evans utilizando 525/50 passa banda (PA) e 655/40 filtros BP, respectivamente. Para sinais de geração de segundo harmônico (SHG) de fibras de colágeno dentro do compartimento dérmico, use um filtro 475/42 BP.
9. Crie uma pasta para guardar as imagens em um formato que seja compatível para o software de análise de imagem disponível.
10. Para adquirir, utilizar as seguintes definições: 500 mm ² scanfield, 505 x 505 pixels de resolução e uma varredura de frequência de 400 Hz em uma única varredura de linha.
11. A 100 ^ M-Z-pilha com um tamanho de passo de 4 mm pode ser adquirida repetidamente ao longo do tempo, em intervalos de 1 min, para controlar a infiltração de neutrófilos.
    Nota: Especialmente para leucócitos (por exemplo, neutrófilos) com uma velocidade de migração mais elevada, um intervalo que é maior do que 1 min pode resultar em dificuldades na análise de seguimento célula. Neste caso, o utilizador pode reduzir a espessura da ACaqui- empilhar ou aumentar a frequência de varredura.
    Nota: Embora a pilha de aquisição necessária da zona de isquemia pode parecer menor como resultado da compressão (caracterizado, alternativamente, por uma intensidade mais elevada SHG), reperfusão subsequente resultará na inflamação maciça que faz com que a orelha para inchar. desvios significativos na direcção Z são esperados. Como tal, a aquisição de um grande Z-pilha é necessária para acomodar a deriva.
12. Durante toda a imagem, completar o PBS e água regularmente para manter a orelha úmida e a lente objetiva imersa em água.
    Nota: Uma experiência típica geralmente dura por 2-4 h. Dependendo do desenho experimental, e juntamente com um regime de anestesia bem controlado, prolongar a duração das imagens é possível.

8. concluir o experimento

1. Euthanize o mouse por asfixia com dióxido de carbono de acordo com a instituição Comitê Animal Care Institucional e Uso (IACUC) procedures.
   Nota: Sempre eutanásia o mouse por métodos aprovados conforme determinado por regras, regulamentos e diretrizes da instituição. Se imaging repetido é necessário, manter o mouse sobre a almofada de aquecimento até que a anestesia desgasta fora. Uma vez que o rato recuperou a consciência suficiente e é móvel, devolver o mouse para sua gaiola.

Análise 9. Imagem

Nota: Os dados gerados a partir do experimento de imagem podem ser visualizados por diferentes pacotes de software.

1. Abra o software de análise de imagem.
2. Sob Ultrapasse Mode, importar o arquivo (Open → selecionar qualquer arquivo na pasta desejada → clique em "Abrir").
3. cores Editar pseudo se as cores padrão não se aplicam (ajuste Editar → Visor → Sob a guia de canais, selecione a cor desejada na paleta de cores).
4. Ajustar o brilho, o contraste e fundo (Edit → visualização de ajuste → Alternar Max e valores min).
5. Certifique-se de que as dimensões do arquivo estão corretos (propriedades Editar → Imagem → Na guia geometria, verificar o tamanho do voxel. Neste protocolo, X = 0,99, Y = 0,99 e Z = 4).
   Nota: Derive X e Y, dividindo a dimensão scanfield pela resolução de pixel. Z é a espessura entre cada fatia.
   Nota: A produção destes conjuntos de dados podem ser apresentados como filmes máximos de projecção.
   Nota: análise de rastreamento é necessário para caracterizar completamente as atividades celulares e interações a fim de compreender a sua função in vivo. As instruções detalhadas de acompanhamento de célula usando a função local disponível no software pode ser encontrado no protocolo em 15 de Referência.
   Nota: Há muitas formas de quantificar a migração de leucócitos, cujos detalhes podem ser encontrados no artigo de revisão em 16 de Referência.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Esse protocolo utiliza uma pele de orelha de plataforma de imagem-construído sob encomenda, como se mostra na Figura 1. Várias características desta plataforma são projetados especificamente para facilitar a imagem, mantendo as configurações fisiológicas. Colocar a orelha na plataforma de bronze aquecida não só mantém a orelha a uma temperatura fisiológica de 35 ° C, mas também a partir de isolados do ouvido movimentos inevitáveis ​​devidas à respiraç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

Significado

IR é uma das principais causas de úlceras de pressão pele. Os estágios iniciais (I e II) de úlceras de pressão descrevem a condição da pele humana (em comparação com os tecidos subcutâneos subjacentes e músculos). No entanto, uma compreensão da etiologia imunológica ainda está em falta. Aqui, apresentamos um modelo de IR simples e robusto na pele de orelha de rato, a fim de resolver esta lacuna. Nós simular a isquemia por clampeamento da orelha de rato entre dois ím...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strains
Lysozyme-GFP C57BL/6	Thomas Graf, Center for Genomic Regulation
C57BL/6-C2J	Jackson Laboratories	000058	To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging
Reagents
PBS
Viaflex 0.9% (wt/vol) saline	Baxter Healthcare	F8B1323
Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride	Parnell		Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed
Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride)	Troy Laboratories		Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed.
Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline)	Sigma-Aldrich	46160
Ultrapurified water
Equipment
Insulin syringe with needle	BD	328838
Transfer pipettes	Biologix Research Company	30-0135
3 M paper masking tape	3M	2214
Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm)	Paul Marienfeld	101112
Curved splinter forceps	Aesculap, B. Braun Melsungen	BD312R
Veet hair removal cream	Reckitt Benckiser
Medical cotton-tipped applicators	Puritan Medical Products Company	806-WC
C-fold towels	Kimberly-Clark	20311
Kimwipes delicate task wipes	Kimtech Science	34155
Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick	first4magnets	F656S
Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material)			fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in
High vacuum grease	Dow Corning
Microscope
TriM Scope II single-beam two-photon microscope	LaVision BioTec
Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate)	Coherent
Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0)	Olympus	XLUMPLFLN20xW
Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue)
495 long-pass	Chroma	T495LPXR
560 lomg-pass	Chroma	T560LPXR
475/42 band-pass	Semrock	FF01-475/42-25
525/50 band-pass	Chroma	ET525/50m
655/40 band-pass	Chroma	NC028647
Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly)
A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm)
A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge)
Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation
Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform
Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640106	connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C
Resistive heater blocks RH-2	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640274	Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating.
Temperature controller TC-344B for the ear platform	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640101
Temperature controller TR-200 for mouse heating pad	Fine Science Tools	21052-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Power supply for TR-200	Fine Science Tools	21051-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Heating pad	Fine Science Tools	21060-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives.
Animal rectal probe	Fine Science Tools	21060-01	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C
Coverslip holder
2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length
1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram)
3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place
1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge
1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod
1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base.
Imaging analysis software
Imaris v8.1.2	Bitplane