Bağışıklık Yanıtları intravital multiphoton Görüntüleme Fare Kulak Skin uyaran İskemi-reperfüzyon yaralanması

Özet

Bu protokol mıknatıs sıkma kullanarak fare kulak cilt üzerinde bir iskemi-reperfüzyon (İR) modeli indüksiyon açıklar. Özel bir dahili Intravital görüntüleme modeli kullanarak, in vivo inflamatuvar yanıt sonrası reperfüzyon eğitim. Bu tekniğin gelişiminin arkasındaki mantık lökosit cilt IR hasarı nasıl cevap anlayışı yaygınlaştırmaktır.

Özet

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

Giriş

geçici hipoksi nedeniyle dokuların (reperfüzyon) bir sonraki yeniden oksijenlenme ardından kan akışının (iskemi) tıkanması olduğunda iskemi reperfüzyon hasarı (IRI) oluşur. Deride, iskemi-reperfüzyon (İR) uzun süreli yatak istirahati yaralanma uzun vadeli hastane hasta yatkınlık basınç ülserlerinin patofizyolojisi, katkıda bulunan faktörlerden biri olduğu düşünülmektedir. Bu hastalarda, deri ve alttaki kaslar hem sürekli, tedavi edilmediği takdirde, nekrotik ¹ olabilir lokalize yaralanmalarla sonuçlanan, kemikli öne alanları üzerine uygulanan ağırlık basınca maruz kalmaktadır.

Bir IRI katılan zarar iki yönlüdür. iskemi sırasında kan damarlarının tıkanması dokulara oksijen dağılımının ciddi bir düşüşe yol açar. Bu hücre metabolizmasında rol oynayan ATPazlar inaktive ATP ve pH, bir azalma ile sonuçlanır. Buna karşılık, hücresel kalsiyum düzeyleri başak ve stresli veya c hasarlıarşın apoptosisi ve nekrosisi ² geçer. Hücre içi içeriğinin veya hasar ilişkili moleküler desenleri (DAMP) serbest bırakılması, HMGB1 gibi, inflamatuar yanıt ³ katkıda bulunur. İkinci hakaret reperfüzyon sırasında oluşur. oksijen ve pH düzeyleri reperfüzyon sırasında geri edilir olsa da, bu, hücre içi lipidlerin, DNA ve protein oksidasyonuna neden reaktif oksijen türlerinin üretimi (ROS) ile sonuçlanır. Sonuç olarak, pro-enflamatuar medyatörler enflamatuar bölge ² bağışıklık hücrelerinin alınmasını içeren ikinci bir enflamatuvar yanıtı tetikler olan aktif hale gelir. enflamatuvar yanıta yol açan biyokimyasal olay zincirinin de tarif edilmiş olmakla birlikte, immün hücre faaliyetlerinin uzamsal ve geçici ayarı iyi anlaşılmış değildir.

Burada, basit mıknatıs sıkma kullanarak fare kulak cilt üzerinde sağlam bir kızılötesi modeli açıklanmaktadır. multiphoton intravital görüntüleme (MP-IVM) ile birleştiğinde, bizreperfüzyon gerçekleşir sonrasında meydana in vivo enflamatuar yanıtları incelemek için bir model oluşturdu. Bu tekniğin geliştirilmesi ve kullanımı arkasındaki mantığı interstisyel ve infiltre hücreler hem gerçek zamanlı IR nasıl tepki anlamaya çalışmaktır.

Onlar immünolojik çalışmalar ⁴ için az daha ideal hale getirerek, cilt kanadını çelik levha cerrahi implantasyon gerektiren cilt kanadında sıkıştırma tekniğini kullanarak IR mevcut modeller, son derece invaziv. Benzer bir invasif olmayan sıkıştırma tekniği fare deri dış yan yüz ^5,6 tarif edilmiştir. O nefes nedeniyle hareketlerini circumvents ve ^7,8 görüntüleme sırasında istikrar sunuyor Ancak, bu yöntemde intravital görüntüleme bileşeninin birleşmesinin, bunun yerine, hedeflenen IR sitesi olarak kulak cildi seçti. Ayrıca, interstisyuma kapsayan lökosit alt-gruplar da, kulak, deri ve deri kanadı arasındaki özdeşsayılar ve oranlar biraz ⁹ değişebilir. Böylece, kulak cilt ideal bir görüntüleme bölgesini temsil eder.

Ayrıca, bu IRI modellerden alınan çoğu veri makroskopik değerlendirmeler (ülserlerin derecelendirme) ve son nokta inflamatuar göstergelerin ¹⁰ mikroskopik analizler sınırlıdır. Bu modeli kullanarak, bir flüoresan raportör fare deri reperfüzyon sonrası nötrofillerin hücre tepkisinin gerçek zamanlı görsel etkindir. Önceden yayınlanmış intravital kulak görüntüleme modeli ek modifikasyon (Şekil 1, 2) ile ⁸ kullanılır.

Protokol

canlı hayvan ile ilgili tüm deneyler ilgili tüm hayvan kullanımı ve bakımı kurallarına ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmıştır.

Floresan Muhabir 1. Farelerin Choice

1. 6- 12 haftalık LysM-eGFP ¹¹ fare (erkek ya da kadın ya hiçbir tercih) kullanın.
   Not: Çeşitli hücreye spesifik flüoresan raportör farelerin kullanılması in vivo olarak farklı bağışıklık hücrelerinin görselleştirme sağlar. Bu soyda, görselleştirilebilir monositler (GFP ^lo hücreleri), ve dermal makrofajlar (GFP ^lo hücreleri) dolaşan nötrofiller (GFP ^yüksek hücreler) dolaşımdaki. görüntüleme parametreleri kullanılan ile, GFP pozitif nötrofillerden sadece parlak sinyaller tespit edilecektir.
   Not: Cilt görüntüleme bu tip çalışmalar için uygun olan immün hücreye spesifik raportör fare suşlarının bir listesi Referans 8 bulunabilir.
   Not: son derece pigmen gibi, albino fareleri görüntüleme için kullanılması önerilirted fareler fotohasar daha yatkındır. pigmentli kulak derisi (doku yakma gösterir) lazer kaynaklı speckling çok daha hassas olmasıdır. Bunun bir sonucu olarak, nötrofil çoğalması ve biriktirme daha kararlı durum ^8,12 sırasında görülebilir.
2. 12 saatlik aydınlık ve karanlık döngüsü ile belirli bir patojen içermeyen (SPF) koşullarda fareler tutun.

2. Fare Anestezi

1. Steril su içinde çözülmüş 15 mg mL karışımı ^-1 ketamin ve 1 mg ml ^-1 ksilazin oluşan ketamin-ksilazin (8 uL ^g-1 vücut ağırlığı) bir intra-peritonal enjeksiyon, ile fare anestezisi.
2. Hazırlık işlem boyunca 37 ° C de vücut ısısını korumak için bir ısıtma pedi üzerinde fare yerleştirin. Bir ayak tutam refleks yokluğu gözlemleyerek yeterli anestezi olup olmadığını kontrol edin.
   Not: ilk bir saat sonra, anestezi sonraki çeyrek dozları deri altından uygulanan bir gerekecektird yaklaşık 0,5 saat her sürecek. bıyık ya da kuyruk seğirmesi de anestezi kapalı giyiyor olduğunu ve bir kontör gerekli olduğunu gösterebilir.
3. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri oftalmik yağ kullanın.

3. Depilasyon

1. Dikkatle pamuk uçlu aplikatör kullanarak dorsal fare kulağın üst üçte ikisi tüy dökücü krem ​​uygulayın.
2. kapsamlı ama nazik bir şekilde ıslak pamuk uçlu aplikatör kullanarak krem ​​çıkarmadan önce 3 dakika - 2 bekleyin.
   Not: inflamasyonu ^13,14 neden olabilir tüy dökücü krem, çok uzun süre fare kulağı kalmak için izin vermeyin.

İskemi ve Reperfüzyon Hasarı 4. İndüksiyon

1. fare kulak deride iskemi ikna etmek için, 12 mm çap x 2 mm kalınlığında altın kaplama, N42 dereceli neodimyum mıknatıs kullanın ve yaklaşık 3.000 Gauss derece ile.
   Not: Bu durumda, mıknatısların gamzeli yüzü Denotes kuzey kutbu.
2. bireysel plastik kılavuzlara mıknatıslar yuvası.
   Not: plastik kılavuz yüksek mukavemetli mıknatısların yerleştirilmesini ve ayrılmasını kolaylaştırmak için hizmet vermektedir. Nedeniyle güçlü bir manyetik kuvvet kırılması henüz düşük direnç için, birbirleriyle ya da diğer metallere yakın bireysel mıknatıslar koymayın. Birbirlerine doğru çekin eğer hurda ve dağılma oluşabilir.
3. Sadece kenar, ikinci (alt) mıknatıs (Şekil 3a) ile temas içinde olduğu şekilde, ilk (dorsal) mıknatıs yerleştirin
   Not: Bu düzgün yerleştirilmiş önce birlikte yakalamaya gelen mıknatıslar engeller.
4. Ventral mıknatıs kulak (Şekil 3a) düz yatıyor öyle ki her iki mıknatıslar yerleştirin.
   Not: iskeminin neden olduğu önce, fare, 37 ° C 'de tutulur ve bu yeterli anestezi (adım 2.2) muhafaza edilmesini sağlar.
5. Hazır kez dikkatlice (Şekil 3a mıknatıslar bir araya gelsin ).
   Not: Görüntüleme amaçları doğrultusunda, bir IR olmayan IR bölgesi görülmektedir, böylece kulak sadece yarısını kelepçe.
6. iskemi 1.5 saat sonra, reperfüzyon gerçekleşecek sağlayan, mıknatıslar birbirinden uzağa büküm plastik kılavuzları kullanarak mıknatıslar kaldırın.
   Not: Bakım mıknatıslar konulduğunda kırışmasını kulakları önlemek için alınmalıdır. Mıknatıslar kaldırıldıktan sonra makroskopik olarak görülebilen büyük kan damarları (yani, kan derhal damarları doldurur) hemen-perfuse re eksik iskemi açıktır. reperfüzyon mıknatıslar çıkarılmasından hemen sonra meydana gelmez, ancak, damar tıkanıklığı, sadece geçicidir. nedenle, mümkün olduğunca hızlı görüntüleme fare kulak hazırlamak için zorunludur.

Kan Gemi Etiketleme Ajanlar 5. Enjeksiyon

1. Hemen mıknatıs çıkarılmasından sonra, Evans mavisi (10 mg mL (retroorbital veya kuyruk ven enjeksiyon yoluyla) intravenöz yönetmek ^-1PBS veya tuzlu su içinde; 1 uL g ^-1 vücut ağırlığı) ya da seçtiğiniz başka bir kan damarı etiketleme ajanı.
   Not: Enjeksiyon öncesinde yeterli anestezi hala yumuşak ayak sıkıştırma fonksiyonunu gerçekleştirerek tutulmasını sağlar.

Görüntüleme Platformunda Kulak 6. Yerleştirme

1. bantlamayın uzunluğunda 1.5 cm genişliğinde 1.8 cm maskeleme 2 adet kesin.
2. Yapışkan kenarları genişliği boyunca yapıştırıcı yaklaşık 1 mm terk ederken birbirine yapışmasına izin verin.
3. Kulak platformda yarık içindeki yerleşimi karşılamak için, boylamasına ikiye maskeleme bandı kesti.
4. yapışkan tarafı yukarı bakacak şekilde, yarıktan hakkında yarım bu maskeleme bandı takın.
5. ısıtma yastığı fare yerleştirin yansıması kulak maskeleme bandı şeridi yanında böyle olduğunu.
6. İki PBS nemlendirilmiş pamuk uçlu aplikatör kullanarak, yavaşça yapışkan bant karşı kulağını basın.
7. Bir kılavuz olarak şeridi kullanarak, fare kulağı getirmekyarıktan aynı anda yakın sahnede doğru fareyi ayarlarken.
8. yapışkan bant kaldırmak için, öncelikle bant yapışkanlığını azaltmak için PBS bir damla ekleyin.
9. ince bir fırça kullanarak yavaşça mümkün olduğu kadar maskeleme bandı fare kulağı ayırın.
10. hafifçe kulak üzerinde nemli pamuk uçlu aplikatör yuvarlayarak kulak platformu karşı kulak düzleştirin.
11. (Gres ile lamel tutucu pozisyonda tutulur; Şekil 2) lamel altına PBS bir damla koyun ve yavaşça kulağına üzerine yerleştirin. Gerekirse daha fazla PBS ile kontör.
    Not: lamel tutucu görüntüleme sırasında stabiliteyi arttırır.
12. rektal sıcaklık probu yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre ısıtma sistemine telleri bağlamak.
    Not: 37 ° C vücut ısıtma yastığı sıcaklığı ve 35 ° C, kulak sahne platformundan ayarlayın.

7. multiphoton Mikroskop Setiyukarı ve Görüntüleme Parametreleri

Not: Bu protokol tunable ile multiphoton mikroskobu tek bir ışın kullanır (680 - 1080 nm) Ti: Sa lazer (3.3 W nm 800; 140 fs darbe uzunluğu; 80 MHz tekrarlama oranı) 20X su amacı ile (NA = 1.0) intravital görüntüleme çalışmaları için.

1. görüntüleme yazılımı açın.
2. üreticinin talimatlarına göre lazer hizalama.
3. 950 nm dalgaboyu ayarlayın.
   Not: GFP ve Evans mavisi 950 nm aynı anda heyecanlı olabilir.
4. 500 mikron ² scanfield, 505 x 505 piksel çözünürlük, ve tek bir satır tarama 800 Hz tarama frekansı: önizleme için aşağıdaki ayarları kullanın. "Önizleme" ı tıklayın.
5. zayıflatıcı (lazer) güç değiştirir. tüm temel sinyaller ısı hasarına neden olabilir lazer gücü aşırı miktarda, Görüntüleme alanını maruz kalmadan aldı emin olun.
   Not: Düşük zayıflatıcı güç başlayın ve signa eğer artışl loş. Erken zamanda interstisyum sonrası reperfüzyon işaret gelen nötrofiller yok olacak gibi eski nötrofiller daha sönük olduğu gibi, makrofajlar, gerekli minimum güç belirlemek için bir gösterge olarak kullanılabilir.
   Not: Bu adım, ilk kez yapılması gereken ise, bozulmamış vasküler bütünlüğü beklenen olmayan iskemik bölgesi, ayarları ve zayıflatıcı güç ayarı kolaylaştıracaktır. lazer gücü kararsız değilse, bir sonraki deneylerde, bu ayarlar kadar değişiklik gerektirmez.
6. PMT ayarlarını yapın.
   Not: PMT için maksimum optimum kazanç gerilimi üreticisine başvurun. Tavsiye eşiğin ötesinde PMT gerilimi ayarı daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı neden olacaktır. genel tavsiye tavsiye eşik PMT kazanç gerilimini ayarlamak ve sinyal çok loş olmalıdır gerektiği gibi zayıflatıcı gücünü arttırmaktır.
7. yakın bir görüntüleme bölge seçinmasif Evans mavisi sızıntı ile karakterize iskemi kenarı.
8. GFP ve sırasıyla 525/50 bant geçiren (BP) ve 655/40 BP filtrelerini kullanarak Evans mavisi sinyalleri toplayın. dermal bölmesi içinde kollajen liflerinin ikinci harmonik üretimi (SHG) sinyalleri için, bir 475/42 BP filtresi kullanın.
9. Mevcut görüntü analiz yazılımı uyumlu bir formatta görüntü kaydetmek için bir klasör oluşturun.
10. 500 mikron ² scanfield, 505 x 505 piksel çözünürlük, ve tek satır tarama tarama frekansı 400 Hz: elde etmek için, aşağıdaki ayarları kullanın.
11. 4 um'lik bir adım büyüklüğü 100 mikron z yığın nötrofil infiltrasyonu izlemek için, 1 dakika aralıklarla, zaman içinde tekrar tekrar elde edilebilir.
    Not: Özellikle yüksek bir göç hızı, hücre izleme analizi sırasında zorluklara neden olabilir en fazla 1 dakika olan bir aralık ile lökosit (örneğin, nötrofil) dir. Bu durumda, kullanıcı, AC kalınlığını azaltmakedinirken yığını veya tarama sıklığını artırmak.
    Not: iskemik bölgenin gerekli alıcı yığını (alternatif olarak bir üst SHG yoğunluğuna sahip) sıkıştırmanın bir sonucu olarak küçük görünse de, daha sonra reperfüzyon kulak şişmesine yol açar büyük iltihaplanma ile sonuçlanacaktır. Z-yönünde önemli kaymalar beklenmektedir. Bu nedenle, büyük bir z-yığın elde edilmesi kaymalara gereklidir.
12. görüntüleme boyunca nemli ve suya batırılır objektif lens kulak tutmak için düzenli olarak PBS ve su kontör.
    Not: Tipik bir deney genellikle 2 sürer - 4 saat. Deneysel tasarım bağlı ve görüntüleme süresini uzatılması mümkündür, iyi kontrollü anestezi rejimi ile birleştiğinde.

8. Deneme Sonlandırma

1. pr kurumun Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) göre Karbondioksit boğulma fare Euthanizeocedures.
   Not: Kurumun kuralları, yönetmelik ve yönergeler ile belirlenen Daima onaylanmış yöntemlerle fare euthanize. Tekrarlanan görüntüleme gerekiyorsa anestezi kapalı giyer kadar ısıtma yastığı fare tutmak. Fare yeterli bilinci yerine ve hareketli sonra, kendi kafesine fare dönün.

9. Görüntü Analizi

Not: Görüntüleme deneyden üretilen veriler farklı yazılım paketleri tarafından görüntülenmiştir olabilir.

1. görüntü analiz yazılımı açın.
2. Altında dosyayı içe, Mode Aşmak (Açık → "açık" Click istediğiniz klasöre → herhangi bir dosyayı seçin).
3. Düzenleme sözde renkleri varsayılan renkler geçerli değilse (kanal sekmesinde Düzen → Ekran ayarı →, renk paletinden istediğiniz rengi seçin).
4. parlaklık, kontrast ve arka plan (Değiştir Max ve Min değerleri → Düzenle → Ekran Ayarı) ayarlayın.
5. Dosya boyutları doğru olduğundan emin olun (Düzenle → Görüntü özelliklerini → geometri sekmesi altında, voksel boyutunu kontrol edin. Bu protokolde, X = 0.99, Y = 0.99 ve Z = 4).
   Not: piksel çözünürlüğe göre scanfield boyutu bölerek X ve Y türevi. Z'nin her dilim arasında kalınlığıdır.
   Not: Bu veri setleri çıkış maksimum projeksiyon film olarak sunulabilir.
   Not: Takip analizi tam in vivo fonksiyonlarını anlamak için hücresel faaliyetler ve etkileşimleri tanımlamak için gereklidir. yazılım mevcuttur nokta işlevini kullanarak hücre izleme ayrıntılı talimatlar Referans 15 protokol bulunabilir.
   Not: Referans 16 derlemede bulunabilir olan birçok nicel lökosit göç yolları, ayrıntılar vardır.

Sonuçlar

Şekil 1'de gösterildiği gibi bu protokol, özel bir dahili kulak cilt görüntüleme platformu kullanıyor. Bu platformun çeşitli özellikler, özellikle fizyolojik ayarları koruyarak görüntüleme kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. ısıtmalı pirinç platformda kulak yerleştirilmesi sadece 35 ° C'lik bir fizyolojik sıcaklıkta kulağı tutar, ama aynı zamanda nefes nedeniyle kaçınılmaz hareketlerinden kulak izole eder. pirinç platformunda ...

Tartışmalar

önem

IR cilt bası yarası önde gelen nedenlerinden biridir. (Altta yatan derialtı dokularda ve kaslara kıyasla) Basınç ülserlerinin erken aşamalarında (I ve II) insan derisinin durumunu açıklar. Ancak, immünolojik etiyolojisinde bir anlayış hala yetersizdir. Burada, bu boşluğu gidermek için fare kulak ciltte basit ve sağlam bir IR modeli sunuyoruz. Biz mıknatıs kaldırma (reperfüzyon) sonra aşağı bağışıklık tepkilerini incelemek iki mıknatıs ve daha sonra aralar?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strains
Lysozyme-GFP C57BL/6	Thomas Graf, Center for Genomic Regulation
C57BL/6-C2J	Jackson Laboratories	000058	To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS
Viaflex 0.9% (wt/vol) saline	Baxter Healthcare	F8B1323
Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride	Parnell		Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed
Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride)	Troy Laboratories		Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed.
Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline)	Sigma-Aldrich	46160
Ultrapurified water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Insulin syringe with needle	BD	328838
Transfer pipettes	Biologix Research Company	30-0135
3M paper masking tape	3M	2214
Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm)	Paul Marienfeld	101112
Curved splinter forceps	Aesculap, B. Braun Melsungen	BD312R
Veet hair removal cream	Reckitt Benckiser
Medical cotton-tipped applicators	Puritan Medical Products Company	806-WC
C-fold towels	Kimberly-Clark	20311
Kimwipes delicate task wipes	Kimtech Science	34155
Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick	first4magnets	F656S
Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material)			fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in
High vacuum grease	Dow Corning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
TriM Scope II single-beam two-photon microscope	LaVision BioTec
Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate)	Coherent
Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0)	Olympus	XLUMPLFLN20xW
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue)
495 long-pass	Chroma	T495LPXR
560 lomg-pass	Chroma	T560LPXR
475/42 band-pass	Semrock	FF01-475/42-25
525/50 band-pass	Chroma	ET525/50m
655/40 band-pass	Chroma	NC028647
Name	Company	Catalog Number	Comments
Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly)
A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm)
A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge)
Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation
Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform
Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640106	connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C
Resistive heater blocks RH-2	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640274	Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating.
Temperature controller TC-344B for the ear platform	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640101
Temperature controller TR-200 for mouse heating pad	Fine Science Tools	21052-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Power supply for TR-200	Fine Science Tools	21051-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Heating pad	Fine Science Tools	21060-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives.
Animal rectal probe	Fine Science Tools	21060-01	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip holder
2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length
1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram)
3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place
1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge
1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod
1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging analysis software
Imaris v8.1.2	Bitplane