Induzierende Ischemia-Reperfusionsschaden in der Maus-Ohr-Haut für intravital Multiphotonenionisation Imaging von Immunantworten

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Induktion einer Ischämie-Reperfusion (IR) Modell auf Mausohrhaut mit Magnetspann. Mit Hilfe eines speziell angefertigten intravital Bildgebung Modell untersuchen wir in vivo Entzündungsreaktionen post-Reperfusion. Das Grundprinzip hinter der Entwicklung dieser Technik besteht darin, das Verständnis zu verlängern, wie Leukozyten Haut IR Verletzung reagieren.

Zusammenfassung

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

Einleitung

Ischämie-Reperfusionsverletzung (IRI) tritt auf, wenn eine vorübergehende Hypoxie aufgrund der Behinderung des Blutflusses (Ischämie) durch eine nachfolgende Wiedersauerstoffversorgung der Gewebe (Reperfusion) gefolgt ist. In der Haut, Ischämie-Reperfusion (IR) gilt als einer der Faktoren für die Pathophysiologie von Dekubitus zu sein, wo längere Bettruhe langfristige Krankenhauspatienten zu Verletzungen prädisponiert. Bei diesen Patienten sowohl die Haut und die darunter liegenden Muskeln sind ständig Gewichtsdruck ausgesetzt über Bereiche der Knochenvorsprung ausgeübt wird, in lokalisierten Verletzungen führt , die, wenn sie unbehandelt, nekrotischen ¹ werden kann.

Die Schäden in einer IRI beteiligt sind zweifach. Während der Ischämie führt die Okklusion von Blutgefäßen zu einem drastischen Abfall der Sauerstoffzufuhr zu den Geweben. Dies führt zu einer Abnahme von ATP und pH, die ATPasen involviert in den Zellstoffwechsel inaktiviert. Im Gegenzug Spike zellulären Kalziumspiegel und gestresst oder c beschädigtells Apoptose oder Nekrose ^2. Die Freisetzung von intrazellulären Inhalte oder Schäden associated molecular patterns (DAMP), wie HMGB1, trägt zu der entzündlichen Reaktion ^3. Die zweite Beleidigung tritt während der Reperfusion. Obwohl Sauerstoff und pH-Werte während der Reperfusion wiederhergestellt werden, führt dies zu der Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die auf die Oxidation von intrazellulären Lipiden führt, DNA und Proteinen. Folglich werden pro-inflammatorischen Mediatoren aktiviert, die aus setzt eine sekundäre Entzündungsreaktion, die die Rekrutierung von Immunzellen zur Entzündungsstelle ² umfasst. Während die Kaskade biochemischer Ereignisse bis zu der Entzündungsreaktion führen gut beschrieben worden ist, sind die räumliche und zeitliche Regulierung der Immunzellaktivitäten nicht gut verstanden.

Hier beschreiben wir eine robuste IR-Modell auf Mausohrhaut mit einfachen Magnetspann. In Verbindung mit Multiintravital Bildgebung (MP-IVM), werden wirwurde ein Modell , um die in - vivo - Entzündungsreaktionen zu untersuchen , die auftreten , nach der Reperfusion stattfindet. Der Grund für die Entwicklung und Anwendung dieser Technik ist, um zu versuchen, zu verstehen, wie sowohl interstitielle und infiltrierenden Zellen IR in Echtzeit zu antworten.

Bestehenden Modellen von IR die Spanntechnik auf der Haut Flanke verwenden , sind sehr invasiv, da sie die chirurgische Implantation von Stahlplatten in der Haut Flanke erfordern, so dass sie weniger als ideal für immunologische Studien ^4. Eine ähnliche nicht-invasive Spanntechnik ist in der Maushaut Flanke ^5,6 beschrieben. Da jedoch der Einbau der intravitalAbbildungsKomponente in diesem Verfahren haben wir stattdessen die Ohrhaut als IR Stelle gezielt, da sie Bewegungen aufgrund von Atem umgeht und bietet Stabilität ^7,8 während der Bildgebung. Außerdem Leukozytenuntergruppen, die das Interstitium umspannen identisch sind zwischen dem Ohrhaut und der Haut flankieren, obwohl dieZahlen und Proportionen können geringfügig ⁹ variieren. Somit stellt die Ohrhaut eine ideale Abbildungsstelle.

Darüber hinaus abgerufen die meisten Daten aus diesen IRI Modelle sind begrenzt auf makroskopische Auswertungen (Einstufung von Geschwüren) und mikroskopische Analysen von Endpunktentzündungsindikatoren ^10. Unter Verwendung dieses Modells Echtzeit-Visualisierung der zellulären Antwort von Neutrophilen nach der Reperfusion in der Haut eines fluoreszierenden Reporter Maus aktiviert. Eine zuvor veröffentlichte intravital Ohr Abbildungsmodell ⁸ mit zusätzlichen Modifikationen verwendet (1, 2).

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Protokoll

Alle Experimente mit lebenden Tieren zu tun wurden in Übereinstimmung mit allen relevanten Tier Verwendung und Pflege Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

1. Wahl des fluoreszierenden Reporter-Mäuse

1. Verwenden 6- bis 12-Wochen alten LysM-eGFP ¹¹ Mäuse (keine Präferenz entweder für Männer oder Frauen).
   Anmerkung: Die Verwendung verschiedener zellspezifischen fluoreszierenden Reportermäusen ermöglicht die Visualisierung von verschiedenen Immunzellen in vivo. In diesem Stamm zirkulierenden Neutrophile (GFP ^Hallo - Zellen), können Monozyten (GFP ^lo Zellen) und Makrophagen dermal (GFP ^lo Zellen) zirkulierende visualisiert werden. Mit der Abbildungsparameter verwendet wird, nur die hellen Signale von GFP-positive Neutrophile erkannt.
   Hinweis: Eine Liste von immunzellspezifischen fluoreszierenden Reportermausstämme geeignet für diese Art von Hautabbildungs ​​Studie kann in Referenz 8 gefunden werden.
   Hinweis: Es wird dringend empfohlen, dass Albino-Mäuse für die Bildgebung verwendet werden, wie pigmented Mäuse sind anfälliger für Lichtschäden. Dies liegt daran, dass die pigmentierte Ohrhaut zu laserinduzierten Sprenkelung (indikativ Gewebe Brennen) viel empfindlicher ist. Als Ergebnis neutrophilen Rekrutierung und Akkumulation kann sogar ^8,12 während des stationären Zustands beobachtet werden.
2. Halten Sie die Mäuse in spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen mit 12-h-Hell-Dunkel-Zyklen.

2. Maus Anesthesia

1. Anästhesieren die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin-Xylazin (8 & mgr; l g ^-1 Körpergewicht), bestehend aus einer Mischung von 15 mg ml ^-1 Ketamin und 1 mg ml ^-1 Xylazin in sterilem Wasser gelöst.
2. Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen auf seine Körpertemperatur auf 37 ° C während des gesamten Herstellungsverfahrens aufrechtzuerhalten. Achten Sie auf ausreichende Anästhesie durch ein Fehlen einer Zehe Prise Reflex zu beobachten.
   Hinweis: Nach der ersten Stunde, anschließende Quartal Dosen von Narkose müssen subkutan eine zu verabreichended wird jeder für etwa 0,5 Stunden dauern. Das Zucken der Whisker oder der Schwanz kann auch bedeuten, dass die Betäubung ausgeschaltet trägt und dass ein Top-up ist nicht erforderlich.
3. Verwenden Sie ophthalmische Schmiermittel auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern.

3. Depilation

1. Anwendung sorgfältig Enthaarungscreme auf die oberen zwei Drittel des Ohres dorsalen Maus mit Baumwolle-Spitze Applikatoren.
2. Warten Sie 2 - 3 Minuten vor der Sahne nassen Baumwollspitze Applikatoren in einer gründlichen, aber schonend zu entfernen.
   Hinweis: Nicht Enthaarungscreme erlauben zu lange auf der Maus Ohr zu bleiben, da es ^13,14 Entzündung auslösen können.

4. Induktion von Ischämie und Reperfusion Injury

1. Verwenden vergoldet, N42-Grade-Neodym-Magneten, 12 mm Durchmesser x 2 mm dick und mit einem Gauß-Rating von etwa 3000 Ischämie im Mausohr Haut zu induzieren.
   Anmerkung: In diesem Fall wird die genoppte Fläche der Magneten DeNOtes sein Nordpol.
2. Slot die Magnete in ihre einzelnen Kunststoffführungen.
   Hinweis: Die Kunststoff-Führung die Platzierung und die Trennung der hochfesten Magneten zu erleichtern dient. Aufgrund ihrer starken Magnetkraft noch geringe Bruchfestigkeit, außerdem nicht mit Einzelmagneten in enger Nähe zueinander oder zu anderen Metallen. Bruch und Splittern kann auftreten, wenn sie aufeinander zu ziehen.
3. Positionieren Sie den ersten (dorsale) Magneten , so dass nur der Rand ist in Kontakt mit dem zweiten (ventralen) Magneten (3a)
   Hinweis: Dies verhindert, dass die Magnete aus schnappen zusammen, bevor sie richtig positioniert ist.
4. Positionieren Sie die beiden Magneten , so dass der ventralen Magnet liegt flach auf dem Ohr (Abbildung 3a).
   Hinweis: Vor dem Ischämie induziert wird, gewährleisten, dass die Maus auf 37 ° C gehalten wird und daß eine ausreichende Anästhesie aufrechterhalten wird (siehe Schritt 2.2).
5. Einmal fertig, lassen Sie sorgfältig die Magnete zusammen kommen (3a ).
   Anmerkung: Für Abbildungszwecke klemmen nur die Hälfte des Ohrs, so dass ein IR und nicht-IR-Bereich beobachtet werden kann.
6. Nach 1,5 h von Ischämie, entfernen Sie die Magnete durch die Magnete voneinander entfernt Verdrehen der Kunststoffführungen verwenden, so dass der Reperfusion stattfinden soll.
   Hinweis: Es muss die Ohren von Falten, wenn die Magnete angeordnet sind, zu verhindern. Unvollständige Ischämie ist offensichtlich , wenn die makroskopisch sichtbaren großen Blutgefäße wieder perfuse sofort (dh Blut füllt die Gefäße sofort) , nachdem die Magnete entfernt werden. Obwohl Reperfusion nur transient tritt nicht unmittelbar nach dem Entfernen des Magneten ist Blutgefäßverschluss. Als solches ist es zwingend notwendig, die Maus Ohr für die Abbildung so schnell wie möglich vorzubereiten.

5. Die Injektion von Blutgefäß Markierungsmittel

1. Unmittelbar nach dem Magnetentfernung, verabreichen intravenös (über retro-orbitale oder Schwanzveneninjektion) Evans - Blau (10 mg mL ^-1in PBS oder Kochsalzlösung; 1 & mgr; l g ^-1 Körpergewicht) oder ein anderes Blutgefäß Markierungsmittel der Wahl.
   Hinweis: Vor der Injektion sicherzustellen, dass eine ausreichende Anästhesie noch, indem sanfte Zehen Einklemmen gehalten wird.

6. Platzierung des Ohres auf dem Imaging-Plattform

1. Schneiden 2 Stück Abdeckband 1,5 cm lang und 1,8 cm in der Breite.
2. Lassen Sie die Klebeseiten zusammenkleben, während etwa 1 mm von Klebstoff entlang ihrer Breite zu verlassen.
3. Schneiden Sie das Abdeckband in zwei, in Längsrichtung, seine Platzierung innerhalb des Schlitzes am Ohr Plattform aufzunehmen.
4. Einfügen dieses Abdeckband etwa auf halbem Weg durch den Schlitz, so dass die Klebeseite nach oben zeigt.
5. Bewegen Sie die Maus auf dem Heizkissen, so dass das Ohr abgebildet werden soll, neben dem Kreppband-Streifen.
6. Durch die Verwendung von zwei PBS-angefeuchteten Wattespitze Applikatoren, drücken Sie vorsichtig das Ohr gegen den Klebestreifen.
7. Mit dem Streifen als Führer, bringen Sie die Mausohrdurch den Schlitz einstellen, während gleichzeitig die Maus näher an der Bühne.
8. Um das Klebeband entfernen, fügen Sie zuerst einen Tropfen PBS die Haftung des Bandes zu reduzieren.
9. Trennen Sie die Mausohr vom Abdeckband so schonend wie möglich einen feinen Pinsel.
10. Glätten Sie das Ohr an Ohr Plattform vorsichtig mit einem feuchten Baumwollspitze Applikator über dem Ohr rollen.
11. Geben Sie einen Tropfen PBS unter dem Deckglas (die in ihrer Position auf dem Deckglas Halter gehalten wird unter Verwendung von Fett; Abbildung 2) und sanft über das Ohr auf . Top mit mehr PBS, falls erforderlich.
    Hinweis: Der Deck Halter erhöht die Stabilität während der Bildgebung.
12. Legen Sie die Sonde Rektaltemperatur und schließen Sie die Kabel an das Heizungssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Stellen Sie die Temperatur des Körpers Heizkissen auf 37 ° C und das Ohr Bühnenplattform bis 35 ° C.

7. Multiphotonenionisation Mikroskop Setund Imaging-Parameter

Hinweis: Dieses Protokoll verwendet einen einzigen Strahl, Multi Mikroskop mit einem abstimmbaren (680 - 1.080 nm) Ti: Sa-Laser (3,3 W bei 800 nm, Pulslänge von 140 fs, 80 MHz Repetitionsrate) mit einem 20x Wasser Objektiv (NA = 1.0) für intravital Bildgebungsstudien.

1. Öffnen Sie die Imaging-Software.
2. Richten der Laser gemäß den Anweisungen des Herstellers.
3. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 950 nm.
   Hinweis: GFP und Evans blau bei 950 nm gleichzeitig angeregt werden können.
4. Zur Vorschau, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 500 & mgr; m ² Scanfeld, 505 x 505 Pixel Auflösung und eine Abtastfrequenz von 800 Hz in einer einzigen Zeile Scan. Klicken Sie auf "Vorschau".
5. Schalten Sie den Dämpfer (Laser) Leistung. Stellen Sie sicher, dass alle wesentlichen Signale ohne Aussetzen des Abbildungsfeldes zu übermäßigen Mengen an Laserleistung aufgenommen, die Hitzeschäden hervorrufen kann.
   Hinweis: Beginnen Sie mit einer niedrigen Dämpfungsglied Leistung und erhöhen, wenn der Signal dim. Als Neutrophilen fehlen wird aus dem Interstitium zu frühen Zeitpunkten nach der Reperfusion, können Makrophagen als Maß verwendet werden, um die minimale Leistung erforderlich, um zu bestimmen, wie der ehemalige Dimmer als Neutrophile sind.
   Hinweis: Wenn dieser Schritt zum ersten Mal zu tun ist, passen Sie die Einstellungen in den nicht-ischämische Zone, wo intakte Gefäß Integrität erwartet wird, und wird die Einstellung der Dämpfungsleistung zu erleichtern. In nachfolgenden Experimenten, diese Einstellungen nicht viel geändert werden müssen, es sei denn die Laserleistung instabil ist.
6. Passen Sie die PMT-Einstellungen.
   Hinweis: Prüfen Sie mit dem Hersteller für die maximale optimale Verstärkung Spannung für die PMT. Einstellen der PMT-Spannung über den empfohlenen Schwellwert wird in einem höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis führen. Die allgemeine Empfehlung ist die PMT-Verstärkung Spannung auf den empfohlenen Grenzwert zu setzen und die Dämpfung Leistung wie nötig zu erhöhen, sollte zu schwach das Signal sein.
7. Wählen Sie eine Abbildungsregion, die in unmittelbarer Nähe zuder Rand der Ischämie, gekennzeichnet durch massive Evans Blau Leckage.
8. Sammeln GFP und Evans Blau-Signale mit 525/50 Bandpass (BP) und 655/40 BP-Filter sind. Für Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) Signale von Kollagenfasern in der Haut Fach, verwenden Sie ein 475/42 BP-Filter.
9. Erstellen Sie einen Ordner, um die Bilder in einem Format zu speichern, die für die verfügbare Bildanalyse-Software kompatibel ist.
10. Zum Erwerb, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 500 & mgr; m ² Scanfeld, 505 x 505 Pixel Auflösung und eine Abtastfrequenz von 400 Hz in einer einzigen Zeile Scan.
11. Ein 100 & mgr; m z-Stapel mit einer Schrittweite von 4 um kann wiederholt über die Zeit in 1 min Intervallen erfasst werden, Neutrophilen-Infiltration zu überwachen.
    Hinweis: Vor allem für Leukozyten (zB Neutrophile) mit einer höheren Wanderungsgeschwindigkeit, ein Intervall , das länger als 1 min ist , kann in Schwierigkeiten bei der Zellverfolgungsanalyse führen. In diesem Fall kann der Benutzer entweder die Dicke der ac reduzierenwerb stapeln oder die Scan-Frequenz erhöhen.
    Anmerkung: Während der erforderliche Akquisitionsstapel der ischämischen Zone kann kleiner als Folge der Kompression erscheinen (alternativ durch eine höhere SHG Intensitäts gekennzeichnet), führt anschließende Reperfusion in massiven Entzündung, die das Ohr verursacht, quellen. Signifikante Drifts in der Z-Richtung gerechnet. Als solches ist der Erwerb eines großen z-Stack notwendig, um die Drift zu berücksichtigen.
12. Während der gesamten Imaging, ganz oben auf der PBS und Wasser regelmäßig auf die Ohr feucht und die Objektivlinse in Wasser getaucht zu halten.
    Hinweis: Ein typisches Experiment in der Regel für 2 dauert - h 4. Je nach Versuchsanordnung, und in Verbindung mit einer gut gesteuerten Anästhesie Regime ist die Dauer der bildgebenden Verlängerung möglich.

8. Terminieren des Experiment

1. Euthanize die Maus durch Erstickung mit Kohlendioxid nach der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Institution procedures.
   Hinweis: einschläfern immer die Maus nach anerkannten Methoden bestimmt, wie von den Regeln der Institution, Vorschriften und Richtlinien. Wenn wiederholte Abbildung benötigt wird, halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, bis die Betäubung nachlässt. Sobald die Maus genügend Bewusstsein wiedererlangt hat und mobil ist, kehren Sie mit der Maus in seinen Käfig.

9. Bildanalyse

Anmerkung: Die Daten von der Bildgebungsexperiment erzeugt wird, durch verschiedene Softwarepakete visualisiert werden.

1. Öffnen Sie die Bildanalyse-Software.
2. Surpass-Modus Under, importieren Sie die Datei (Open → wählen Sie eine beliebige Datei in den gewünschten Ordner → Klicken Sie auf "Öffnen").
3. Bearbeiten Pseudofarben, wenn die Standardfarben gelten nicht (Edit → Displayeinstellungen → Unter der Registerkarte Kanal, wählen Sie die gewünschte Farbe aus der Farbpalette).
4. Stellen Sie die Helligkeit, den Kontrast und Hintergrund (Bearbeiten → Anzeige Einstellung → Toggle Max und Min-Werte).
5. Stellen Sie sicher, dass die Datei Dimensionen korrekt sind (Bearbeiten → Bildeigenschaften → Unter der Registerkarte Geometrie, überprüfen Sie die Voxelgröße. In diesem Protokoll X = 0,99, Y = 0,99, und Z = 4).
   Hinweis: Man leite X und Y durch die Scanfeld Dimension durch die Pixelauflösung geteilt wird. Z ist die Dicke zwischen jeder Scheibe.
   Hinweis: Die Ausgabe dieser Datensätze können als maximale Projektion Filme präsentiert werden.
   Hinweis: Tracking - Analyse erforderlich ist , um vollständig die zellulären Aktivitäten und Interaktionen , um charakterisieren ihre Funktion in vivo zu verstehen. Detaillierte Anweisungen von Zellverfolgung der Punktfunktion in der Software kann in dem Protokoll in Referenz 15 zu finden.
   Hinweis: Es gibt viele Möglichkeiten zur Quantifizierung von Leukozyten-Migration, deren Einzelheiten können 16 in dem Übersichtsartikel in Reference.

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Ergebnisse

Dieses Protokoll verwendet einen speziell angefertigten Ohrhaut Imaging - Plattform, wie in Abbildung 1 dargestellt. Einige Merkmale dieser Plattform sind speziell Bildgebung zu erleichtern konzipiert, während physiologische Einstellungen beibehalten. Platzieren des Ohres auf der beheizten Messing Plattform nicht hält nur das Ohr bei einer physiologischen Temperatur von 35 ° C, aber es Isolate auch das Ohr von unvermeidlichen Bewegungen durch Atmung. Die Zugabe eines ...

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Diskussion

Bedeutung

IR ist eine der führenden Ursachen von Haut Dekubitus. Die frühen Stadien (I und II) von Dekubitus beschreiben den Zustand der menschlichen Haut (wie auf die zugrunde liegenden subkutanen Gewebe und Muskeln im Vergleich). Allerdings fehlt ein Verständnis für die immunologische Ätiologie noch. Hier präsentieren wir eine einfache und robuste IR-Modell auf Mausohrhaut, um diese Lücke zu schließen. Wir simulieren Ischämie mit der Maus Ohr zwischen zwei Magneten Spann- und anschli...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strains
Lysozyme-GFP C57BL/6	Thomas Graf, Center for Genomic Regulation
C57BL/6-C2J	Jackson Laboratories	000058	To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging
Reagents
PBS
Viaflex 0.9% (wt/vol) saline	Baxter Healthcare	F8B1323
Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride	Parnell		Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed
Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride)	Troy Laboratories		Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed.
Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline)	Sigma-Aldrich	46160
Ultrapurified water
Equipment
Insulin syringe with needle	BD	328838
Transfer pipettes	Biologix Research Company	30-0135
3 M paper masking tape	3M	2214
Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm)	Paul Marienfeld	101112
Curved splinter forceps	Aesculap, B. Braun Melsungen	BD312R
Veet hair removal cream	Reckitt Benckiser
Medical cotton-tipped applicators	Puritan Medical Products Company	806-WC
C-fold towels	Kimberly-Clark	20311
Kimwipes delicate task wipes	Kimtech Science	34155
Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick	first4magnets	F656S
Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material)			fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in
High vacuum grease	Dow Corning
Microscope
TriM Scope II single-beam two-photon microscope	LaVision BioTec
Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate)	Coherent
Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0)	Olympus	XLUMPLFLN20xW
Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue)
495 long-pass	Chroma	T495LPXR
560 lomg-pass	Chroma	T560LPXR
475/42 band-pass	Semrock	FF01-475/42-25
525/50 band-pass	Chroma	ET525/50m
655/40 band-pass	Chroma	NC028647
Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly)
A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm)
A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge)
Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation
Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform
Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640106	connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C
Resistive heater blocks RH-2	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640274	Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating.
Temperature controller TC-344B for the ear platform	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640101
Temperature controller TR-200 for mouse heating pad	Fine Science Tools	21052-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Power supply for TR-200	Fine Science Tools	21051-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Heating pad	Fine Science Tools	21060-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives.
Animal rectal probe	Fine Science Tools	21060-01	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C
Coverslip holder
2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length
1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram)
3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place
1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge
1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod
1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base.
Imaging analysis software
Imaris v8.1.2	Bitplane