在鼠耳皮肤的免疫反应的活体多光子成像诱导缺血再灌注损伤

摘要

这个协议描述了在使用磁铁的夹紧小鼠耳部皮肤缺血再灌注（IR）模型的诱导。使用定制的活体成像模型，我们研究的体内炎症反应再灌注后。这项技术的发展背后的基本原理是延长白细胞如何皮肤缺血再灌注损伤反应的认识。

摘要

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

引言

时，有一个短暂缺氧由于随后组织（再灌注）的随后重新氧合血流量（缺血）的阻塞发生缺血再灌注损伤（IRI）。在皮肤中，缺血 - 再灌注（IR）被认为是起作用的因素，压力性溃疡的病理生理学，其中长期卧床易患长期医院病人受伤的一个。在这些患者中，无论是在皮肤和下面的肌肉经常暴露于施加在骨突出的区域重压力，导致局部损伤的是，如果不进行治疗，可能会变得坏死^1。

参与了IRI的损失是双重的。期间缺血，血管的闭塞导致的氧气输送的急剧下降到组织。这导致的ATP和pH值，其中失活参与细胞代谢ATP酶的减少。反过来，细胞钙含量秒杀，并强调或损坏Ç厄尔发生凋亡或坏死^2。细胞内的内容，或者损害相关分子模式（湿气）的发布，像HMGB1，有助于炎症反应^3。再灌注过程中出现的第二个侮辱。虽然氧和pH水平在再灌注期间恢复，这会导致产生的活性氧（ROS），从而导致细胞内脂质，DNA和蛋白质的氧化。因此，促炎介质被激活，从而衬托涉及免疫细胞向炎症部位²招募次级炎症反应。而生化事件导致对炎症反应的级联已经很好地描述，所述免疫细胞活动的空间和时间调节都不能很好地理解。

在这里，我们描述了如何使用简单的磁性定位鼠耳皮肤一个强大的IR模式。再加上多光子活体成像（MP-IVM），我们建立了一个模型来研究再灌注发生后发生的体内炎症反应。开发和利用这种技术的基本原理是试图实时了解两者间质和浸润细胞对IR的反应。

使用夹紧技术在皮肤侧面的IR的现有模型是高度侵入性的，因为它们需要在皮肤侧面钢板的手术植入，使其低于理想免疫学研究^4。类似的非侵入性的夹紧技术已在小鼠皮肤侧翼^5,6进行了描述。但是，由于在该方法中，活体成像成分的掺入，我们改为选择耳朵皮肤作为目标的IR部位，因为它绕过由于呼吸运动和成像^7,8-期间提供稳定性。此外，跨越间质白细胞亚群是耳朵皮肤和皮肤侧面之间是相同的，虽然数字和比例可能会略有变化^9。从而，耳朵皮肤表示理想成象部位。

此外，从这些IRI模型检索大多数数据是有限的，以宏观评价（溃疡分级）和端点炎症指标¹⁰微观分析。利用该模型，嗜中性粒细胞中的荧光报道小鼠的皮肤再灌注后的细胞反应的实时可视化被启用。以前发表的活耳成像模型被利用⁸与另外的修饰（ 图1，图2）。

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研究方案

所有处理活的动物实验均按照所有相关动物的使用和保护准则和条例进行。

1.荧光记者小鼠的选择

1. 使用6至12周龄LysM结构-eGFP的¹¹只小鼠（无偏爱或者男性或女性）。
   注意:使用各种细胞特异性荧光报道小鼠能够在体内不同的免疫细胞的可视化。在该菌株中，循环嗜中性粒细胞（GFP ^喜细胞），循环单核细胞（GFP ^LO细胞）和真皮的巨噬细胞（GFP ^LO细胞）可以被可视。与所使用的摄像参数，只能从GFP阳性嗜中性粒细胞的明亮的信号将被检测到。
   注:适合这类肌肤的影像学研究的免疫细胞特异性荧光记者小鼠品系的清单可以参考8被发现。
   注意:强烈建议小白鼠用于成像，猪人泰德小鼠更容易产生光损伤。这是因为着色耳朵皮肤是多少（指示组织燃烧）激光诱导斑点更敏感。其结果是，中性粒细胞募集和积累可能即使在稳态^8,12被观察到。
2. 保持在具有12小时光照 - 黑暗周期无特定病原体（SPF）的条件下的小鼠。

2.鼠标麻醉

1. 麻醉小鼠用腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪（8微升克^-1体重）的，溶解于无菌水中15毫克mL的混合物^-1氯胺酮和1mg毫升^-1甲苯噻嗪组成。
2. 放置在加热垫的鼠标以保持其体温在37℃下在整个制备过程。通过观察一个缺乏脚趾捏反射检查有足够的麻醉。
   注意:在第一个小时后，后续季度剂量的麻醉剂将需要被皮下施用的ð将持续大约每0.5小时。晶须或尾部的抽搐还可以指示麻醉穿着关闭，并且需要补足。
3. 使用对眼睛的眼科润滑剂，以防止干燥时的麻醉下。

3.脱毛

1. 仔细申请脱毛霜向背侧小鼠耳的使用棉尖涂药器的上三分之二。
2. 在彻底，但温和的方式使用湿棉尖涂药除去霜前3分钟 - 等待2。
   注意:不要让脱毛膏停留在小鼠耳太久，因为这可能会诱发炎症^13,14。

4.诱导缺血再灌注损伤的

1. 采用镀金，N42级的钕磁铁，12毫米直径×2毫米厚，并用约3000高斯的评价诱导缺血小鼠耳部皮肤。
   注意:在这种情况下，磁体的微凹面杰诺TES其北极。
2. 插槽磁铁成单个的塑料导轨。
   注意:塑料导轨用来缓解高强度磁铁的位置和分离。由于其强大的磁力破损但抵抗力低，不要靠近各个磁体放置对方或其他金属。如果他们拉向对方可能会发生破损和分裂。
3. 第一（背部）磁体，使得只有边缘与所述第二（腹侧）磁体（ 图3a）接触的位置
   注意:这可以防止磁铁从卡扣在一起它们已被正确地定位之前。
4. 定位两个磁体，使得所述腹磁铁平躺在耳朵上（ 图3a）。
   注意:缺血诱导之前，确保鼠标保持在37℃和足够的麻醉维持（参见步骤2.2）。
5. 一旦准备就绪，精心让磁铁走到了一起（ 图3a ）。
   注意:对于成像目的，夹紧只使红外和非红外区域可被观察到的耳的一半。
6. 缺血1.5小时后，通过加捻彼此磁体远离使用塑料导轨，从而允许再灌注发生移除磁体。
   注意:必须小心，以防止耳从当磁体被置于压痕。如果肉眼可见的主要血管立即再灌流（ 即血液立即充满血管）的磁体被删除后不完全缺血是显而易见的。虽然再灌注不去除磁铁后立即发生，血管闭塞只是暂时的。因此，当务之急是要准备老鼠耳朵尽可能迅速地成像。

5.注射血管贴标代理

1. 磁铁取出后，立即静脉给药（通过眼眶或尾静脉注射），伊文思蓝（10毫克毫升^-1在PBS或盐水; 1μL摹^-1体重）或选择的其他血管标记剂。
   注意事项:注射前，确保有足够的麻醉仍然是通过执行温和的捏脚趾保持。

6.对成像平台耳朵放置

1. 切2个胶带长度1.5厘米和1.8厘米宽的。
2. 使粘合剂双方同时留下1毫米左右的粘合剂沿其宽度粘在一起。
3. 切胶带两种，纵向，耳朵平台上的狭缝内适应其位置。
4. 插入约一半此遮蔽胶带通过狭缝，使得粘合剂面朝上。
5. 加热垫的鼠标的位置，这样，将被成像的耳朵旁边的遮蔽胶带条。
6. 通过使用两个PBS浸湿棉尖涂药，轻轻按压胶条的耳朵。
7. 使用带为指导，把小鼠耳通过狭缝，同时调整鼠标朝舞台更近。
8. 以除去胶带，第一添加PBS一滴以减少带的粘接性。
9. 用细的画笔轻轻地分开遮蔽胶带小鼠耳。
10. 通过轻轻滚动过耳湿润的棉尖涂药拼合靠近耳部平台的耳朵。
11. 放的PBS盖玻片下方的下降（其被保持在使用润滑脂盖玻片夹持位置; 图2），轻轻地将其放置在耳。如有必要，加满PBS多。
    注意:盖玻片​​夹持成像期间增加了稳定性。
12. 插入直肠温度探头，并根据制造商的说明将电线连接到加热系统。
    注:设置体加热垫的温度升高到37℃，并在耳阶段平台至35℃。

7.多光子显微镜套装和成像参数

注意:此协议使用单光束，多光子显微镜可调（680 - 1080 nm）的钛:萨激光（3.3瓦，800纳米，140飞秒脉冲长度; 80 MHz的重复率）用20X的水物镜（NA = 1.0），用于活体成像研究。

1. 打开图像处理软件。
2. 根据制造商的说明校准激光。
3. 调整激发波长到950纳米。
   注:GFP和伊文思蓝可在950 nm的同时兴奋。
4. 预览，使用以下设置:500微米² scanfield，505点¯x505像素的分辨率，和800赫兹的在一个单一的行扫描的扫描频率。点击"预览"。
5. 切换衰减器（激光）电源。确保所有必需信号被拾取，而不摄像视场暴露于过量的激光的功率，这可能会引起热损伤。
   注:在低功率衰减器启动，如果增加西尼亚l为暗淡。嗜中性粒细胞将不存在从在早期时间间质点 - 再灌注后，巨噬细胞可被用作一个量规来确定所需的最小的功率，因为​​前者比嗜中性粒细胞的调光器。
   注意:如果该步骤是在第一时间内完成，调整在非缺血区，在这里完整血管完整性预期的设置，将促进衰减器功率的设置。在随后的实验中，这些设置不需要太多修饰，除非激光功率是不稳定的。
6. 调整PMT设置。
   注意:检查与制造商的PMT的最大最佳增益电压。设定PMT电压超过推荐阈值将导致更高的信噪比。一般建议的PMT增益电压设置为推荐的门槛，增加了功率衰减器根据需要应信号过于模糊。
7. 选择是在接近成像区域缺血的边缘，其特征在于大量的伊文思蓝的泄漏。
8. 收集GFP和使用五十零分之五百二十五带通（BP）和655/40 BP滤波器，分别Evans蓝信号。对于二次谐波产生（SHG）信号真皮隔间内的胶原纤维，用一个四十二分之四百七十五BP滤波器。
9. 创建一个文件夹来保存图像的格式是可用的图像分析软件兼容。
10. 为了获得，使用以下设置:500微米² scanfield，505点¯x505像素分辨率和扫描频率400赫兹在一个单一的线扫描。
11. 一个100微米的Z堆叠为4微米的步长可重复获得随着时间的推移，在1分钟的间隔，以监测中性粒细胞浸润。
    注意:尤其对于白细胞（ 例如，中性粒细胞）具有较高的迁徙速度，即长于1分钟，可能会导致细胞跟踪分析期间困难的间隔。在这种情况下，用户既可以降低交流的厚度quisition堆叠或增大扫描频率。
    注意:当在缺血区的需要采集栈可以显示为压缩（或者其特征在于较高的SHG强度）的结果小，随后再灌注会导致引起该耳朵膨胀大规模炎症。在Z方向显著漂移预期。这样，一个大的Z堆叠的采集是必要以容纳漂移。
12. 整个成像，补足PBS和水经常保持耳湿润和物镜浸泡在水中。
    注:一个典型的实验一般持续2 - 4小时。根据不同的实验设计，并配上良好控制麻醉制度，延长成像的持续时间是可能的。

8.终止实验

1. 根据该机构的机构动物护理和使用委员会（IACUC）通过二氧化碳窒息安乐死鼠标PRocedures。
   注:由该机构的法规，规章和准则确定的批准方法总是安乐死鼠标。如果需要重复成像，按住鼠标加热垫，直到麻醉消退。一旦鼠标已经恢复足够的意识，是移动，鼠标返回到笼子里。

9.图像分析

注意:从成像实验产生的数据可以通过不同的软件包进行可视化。

1. 打开成像分析软件。
2. 在超越模式，导入文件（打开→选择想要的文件夹→所有文件，点击"打开"）。
3. 如果默认的颜色不适用编辑伪彩色（编辑→显示调整→在通道选项卡，选择从调色板中所需的颜色）。
4. 调整亮度，对比度和背景（编辑→显示调整→切换最大值和最小值）。
5. 确保文件的尺寸是否正确（编辑→图像属性→在几何选项卡，勾选体素的大小。在这个协议中，X = 0.99，Y = 0.99和Z = 4）。
   注意:通过由像素分辨率除以scanfield尺寸派生X和Y。 Z是每个切片之间的厚度。
   注意:这些数据集的输出可以表示为最大投影电影。
   注意:需要跟踪分析，以了解它们的体内功能完全表征细胞活性和相互作用。使用该软件可当场功能细胞追踪详细说明可在协议参考15中找到。
   注:有量化白细胞迁移的方法很多，详情可以在评论文章中引用16被发现。

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结果

该协议使用一个定制的耳部皮肤成像平台， 如图1。这个平台的几个特点专门设计，以方便成像，同时保持生理的设置。放置耳加热黄铜平台上不仅保持在35℃的生理温度耳，但它也隔离由于呼吸不可避免动作耳。在加入黄铜平台上的金属夹的创建一个间隙，以防止在盖玻片固定器从施加在耳朵上的重量，从而保持不间断的血流量。阶段平台也被设计成容纳一?...

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讨论

意义

IR为皮肤褥疮的主要原因之一。褥疮的早期阶段（I和II）描述的人的皮肤的状态（相对于底层皮下组织和肌肉）。然而，免疫病因的了解仍然缺乏。在这里，我们存在于小鼠耳部皮肤一个简单而强大的IR模式，以消除这一差距。我们通过夹紧两个磁铁和随后的小鼠耳研究磁铁去除（再灌注）后，下游的免疫反应模拟缺血。通过使用磁铁来产生一个固定的时间周期上每个耳朵?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strains
Lysozyme-GFP C57BL/6	Thomas Graf, Center for Genomic Regulation
C57BL/6-C2J	Jackson Laboratories	000058	To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging
Reagents
PBS
Viaflex 0.9% (wt/vol) saline	Baxter Healthcare	F8B1323
Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride	Parnell		Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed
Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride)	Troy Laboratories		Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed.
Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline)	Sigma-Aldrich	46160
Ultrapurified water
Equipment
Insulin syringe with needle	BD	328838
Transfer pipettes	Biologix Research Company	30-0135
3 M paper masking tape	3M	2214
Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm)	Paul Marienfeld	101112
Curved splinter forceps	Aesculap, B. Braun Melsungen	BD312R
Veet hair removal cream	Reckitt Benckiser
Medical cotton-tipped applicators	Puritan Medical Products Company	806-WC
C-fold towels	Kimberly-Clark	20311
Kimwipes delicate task wipes	Kimtech Science	34155
Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick	first4magnets	F656S
Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material)			fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in
High vacuum grease	Dow Corning
Microscope
TriM Scope II single-beam two-photon microscope	LaVision BioTec
Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate)	Coherent
Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0)	Olympus	XLUMPLFLN20xW
Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue)
495 long-pass	Chroma	T495LPXR
560 lomg-pass	Chroma	T560LPXR
475/42 band-pass	Semrock	FF01-475/42-25
525/50 band-pass	Chroma	ET525/50m
655/40 band-pass	Chroma	NC028647
Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly)
A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm)
A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge)
Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation
Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform
Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640106	connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C
Resistive heater blocks RH-2	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640274	Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating.
Temperature controller TC-344B for the ear platform	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640101
Temperature controller TR-200 for mouse heating pad	Fine Science Tools	21052-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Power supply for TR-200	Fine Science Tools	21051-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Heating pad	Fine Science Tools	21060-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives.
Animal rectal probe	Fine Science Tools	21060-01	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C
Coverslip holder
2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length
1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram)
3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place
1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge
1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod
1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base.
Imaging analysis software
Imaris v8.1.2	Bitplane