La inducción de la lesión por isquemia-reperfusión en la piel de la oreja del ratón para intravital n fotones de imágenes de la respuesta inmune

Resumen

Este protocolo describe la inducción de un modelo de isquemia-reperfusión (IR) en la piel de oreja de ratón utilizando sujeción imán. El uso de un modelo de imágenes intravital hecha a la medida, se estudia en las respuestas inflamatorias in vivo después de la reperfusión. La razón fundamental detrás del desarrollo de esta técnica es extender la comprensión de cómo los leucocitos responden a la lesión IR piel.

Resumen

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

Introducción

la lesión por isquemia-reperfusión (IRI) se produce cuando hay una hipoxia transitoria debido a la obstrucción del flujo sanguíneo (isquemia) seguido de una posterior re-oxigenación de los tejidos (reperfusión). En la piel, se cree que por isquemia-reperfusión (IR) para ser uno de los factores que contribuyen a la fisiopatología de las úlceras por presión, en reposo en cama prolongado predispone a los pacientes del hospital a largo plazo a las lesiones. En estos pacientes, la piel y los músculos subyacentes están constantemente expuestos a la presión ejercida sobre el peso áreas de prominencia ósea, lo que resulta en lesiones localizadas que, si no se tratan, pueden llegar a ser necrótico ^1.

Los daños que participan en un IRI son dos. Durante la isquemia, la oclusión de los vasos sanguíneos conduce a una caída drástica de la entrega de oxígeno a los tejidos. Esto se traduce en una disminución de ATP y del pH, que inactiva ATPasas implicadas en el metabolismo celular. A su vez, los niveles de calcio celulares pico, y destacaron oc dañadosells sufren apoptosis o necrosis ^2. La liberación del contenido intracelular o patrones moleculares asociados de daños (DAMP), al igual que la HMGB1, contribuye a la respuesta inflamatoria ^3. El segundo insulto se produce durante la reperfusión. Aunque los niveles de oxígeno y pH se restauran durante la reperfusión, esto da como resultado la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), que conduce a la oxidación de los lípidos intracelulares, el ADN y las proteínas. En consecuencia, los mediadores pro-inflamatorios se activan, lo que pone en marcha una respuesta inflamatoria secundaria que implica el reclutamiento de células inmunes en el sitio inflamatorio ^2. Mientras que la cascada de eventos bioquímicos que conducen a la respuesta inflamatoria ha sido bien descrita, la regulación espacial y temporal de las actividades de las células inmunes no son bien entendidos.

A continuación, describimos un modelo IR robusta en la piel de oreja de ratón usando sencilla sujeción del imán. Junto con las imágenes multifotónica intravital (MP-IVM), queestablecido un modelo para estudiar las respuestas inflamatorias in vivo que se producen después de la reperfusión se lleva a cabo. La razón de ser del desarrollo y el uso de esta técnica es tratar de comprender cómo tanto las células intersticiales e infiltrantes responden a IR en tiempo real.

Los modelos existentes de IR utilizando la técnica de sujeción en el flanco de la piel son altamente invasivo, ya que requieren la implantación quirúrgica de placas de acero en el flanco de la piel, haciendo que sean menos que ideales para estudios inmunológicos ^4. Una técnica de sujeción no invasivo similar se ha descrito en el ^5,6 ratón piel flanco. Sin embargo, debido a la incorporación del componente de imagen intravital en este método, en vez elegimos la piel de la oreja como el sitio IR específica, ya que evita los movimientos debidos a la respiración y ofrece una estabilidad durante la formación de imágenes ^7,8. Por otra parte, subconjuntos de leucocitos que abarcan el intersticio son idénticos entre la piel de la oreja y el flanco de la piel, aunque elnúmeros y proporciones pueden variar ligeramente ^9. Por lo tanto, la piel de la oreja representa un sitio de formación de imágenes ideal.

Además, la mayoría de los datos recuperados de estos modelos IRI están limitados a evaluaciones macroscópicas (clasificación de las úlceras) y análisis microscópicos de indicadores de inflamación de punto final ^10. Usando este modelo, la visualización en tiempo real de la respuesta celular de los neutrófilos después de la reperfusión en la piel de un ratón reportero fluorescente está habilitada. Un modelo de formación de imágenes oído intravital publicado anteriormente se utiliza ⁸ con modificaciones adicionales (Figuras 1, 2).

Protocolo

Todos los experimentos se ocupan de animales vivos se realizaron de acuerdo a todo el uso de animales relevante y directrices y regulaciones de cuidado.

1. Elección de ratones indicador fluorescente

1. Utilizar de 6 a 12 semanas de edad LysM-eGFP ¹¹ ratones (sin preferencia por machos o hembras).
   Nota: El uso de varios ratones reportero fluorescente de células específicas permite la visualización de diferentes células inmunes in vivo. En esta cepa, los neutrófilos circulantes (células GFP ^hi), monocitos (células GFP ^LO), y los macrófagos (células dérmicas GFP ^lo) que circula puede ser visualizado. Con los parámetros de imagen empleadas, sólo se detectará las señales luminosas de neutrófilos GFP-positivas.
   Nota: Una lista de las cepas fluorescente indicador de ratón inmune específica de células adecuadas para este tipo de estudio por imágenes de la piel se puede encontrar en la Referencia 8.
   Nota: Es muy recomendable que los ratones albinos ser utilizado para obtener imágenes, como pigmentaciónratones TED son más propensos a fotodaño. Esto es porque la piel de la oreja pigmentada es mucho más sensible a speckling inducida por láser (indicativo de la quema de tejido). Como resultado, el reclutamiento de neutrófilos y la acumulación se pueden observar incluso durante el estado estacionario ^8,12.
2. Mantener los ratones en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) con ciclos de luz-oscuridad de 12 h.

2. Ratón Anestesia

1. Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de ketamina-xilazina (8 l ^g-1 de peso corporal), compuesto por una mezcla de 15 mg ml ^-1 de ketamina y 1 mg ml ^-1 xilacina disuelto en agua estéril.
2. Coloque el ratón sobre una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal a 37 ° C durante todo el procedimiento de preparación. Compruebe si hay suficientes anestesia mediante la observación de una ausencia de un reflejo del dedo del pie sujetador.
   Nota: Después de la primera hora, tendrán que ser administrado por vía subcutánea una dosis cuartos posteriores de anestesiad tendrá una duración de aproximadamente 0,5 horas cada una. La contracción de los bigotes o la cola también puede indicar que la anestesia se está desvaneciendo y que se requiere una recarga.
3. Utilice lubricante oftálmica en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.

3. Depilación

1. Con cuidado aplique crema depilatoria a los dos tercios superiores de la oreja dorsal del ratón, utilizando aplicadores de algodón con punta.
2. Espere durante 2 - 3 minutos antes de retirar la crema usando aplicadores con punta de algodón mojado de una manera minuciosa pero delicada.
   Nota: No permita que la crema de depilación para alojarse en la oreja de ratón durante demasiado tiempo, ya que puede inducir inflamación ^13,14.

4. Inducción de isquemia y lesión por reperfusión

1. Utilice, N42 grado imanes de neodimio chapados en oro de 12 mm de diámetro x 2 mm de espesor y con una calificación de aproximadamente 3.000 Gauss para inducir isquemia en la piel de oreja de ratón.
   Nota: En este caso, la cara con hoyuelos de los imanes DenoTES su polo norte.
2. Slot los imanes en sus guías de plástico individuales.
   Nota: La guía de plástico sirve para facilitar la colocación y la separación de los imanes de alta resistencia. Debido a su fuerte fuerza magnética sin embargo, una baja resistencia a la rotura, no coloque imanes individuales en estrecha proximidad entre sí o con otros metales. La rotura y astillamiento pueden ocurrir si retiran uno hacia el otro.
3. Coloque el primer imán (dorsal) de tal manera que sólo el borde está en contacto con la segunda (ventral) imán (Figura 3a)
   Nota: Esto evita que los imanes de romperse juntos antes de que se han colocado correctamente.
4. Coloque ambos imanes de tal manera que el imán quede plano ventral en la oreja (Figura 3a).
   Nota: Antes de que se indujo la isquemia, asegúrese de que el ratón se mantiene a 37 ° C y se mantiene que la anestesia suficiente (véase el paso 2.2).
5. Una vez listo, permiten cuidadosamente los imanes se unen (Figura 3a ).
   Nota: Para fines de imagen, utilice únicamente la mitad de la oreja de manera que se puede observar un IR y la región no-IR.
6. Después de 1,5 horas de isquemia, quitar los imanes retorciendo los imanes de distancia el uno del otro usando las guías de plástico, lo que permite que tenga lugar la reperfusión.
   Nota: Se debe tener cuidado para evitar que se arruguen los oídos cuando se colocan los imanes. Isquemia incompleta es evidente si los vasos sanguíneos principales macroscópicamente visibles-perfuse re inmediatamente (es decir, la sangre llena los vasos inmediatamente) después se retiran los imanes. Aunque la reperfusión no se produce inmediatamente después de la eliminación de los imanes, la oclusión de los vasos sanguíneos sólo es transitoria. Como tal, es imperativo para preparar la oreja de ratón para obtener imágenes de la mayor rapidez posible.

5. La inyección de agentes de marcaje Vaso sanguíneo

1. Inmediatamente después de retirar el imán, administrar por vía intravenosa (a través de retro-orbital o inyección en la vena de la cola) de azul de Evans (10 mg ml ^-1en PBS o solución salina; 1 l ^g-1 de peso corporal) u otro agente de marcaje de los vasos sanguíneos de elección.
   Nota: Antes de la inyección, asegúrese de que la anestesia suficiente todavía se mantiene mediante la realización de pellizco del dedo del pie suave.

6. Colocación de la oreja en la Plataforma de Imagen

1. Corte 2 pedazos de cinta adhesiva de 1,5 cm de longitud y 1,8 cm de ancho.
2. Permitir a los lados adhesivos se peguen entre sí dejando aproximadamente 1 mm de adhesivo a lo largo de su anchura.
3. Cortar la cinta de enmascarar en dos, a lo largo, para dar cabida a su colocación dentro de la ranura en la plataforma de la oreja.
4. Inserte esta cinta de enmascarar a mitad de camino a través de la hendidura, de manera que el lado adhesivo hacia arriba.
5. Coloque el ratón sobre el cojín eléctrico, de tal manera que el oído en ser fotografiado está al lado de la tira de cinta adhesiva.
6. Mediante el uso de dos aplicadores de algodón levemente humedecido con PBS, presionar suavemente la oreja contra la tira adhesiva.
7. El uso de la tira como una guía, llevar el oído de ratóna través de la ranura mientras se ajusta simultáneamente el ratón más cerca hacia el escenario.
8. Para retirar la cinta adhesiva, añadir primero una gota de PBS para reducir la adhesividad de la cinta.
9. Se separa la oreja de ratón de la cinta de enmascarar lo más suavemente posible utilizando un pincel fino.
10. Aplanar la oreja a la plataforma de la oreja haciendo rodar suavemente un aplicador con punta de algodón húmedo sobre el oído.
11. Ponga una gota de PBS debajo de la cubreobjetos (que se mantiene en posición en el soporte de cubreobjetos con grasa; Figura 2) y suavemente se coloca sobre la oreja. Rellene con PBS más si es necesario.
    Nota: El titular cubreobjetos aumenta la estabilidad durante la exploración.
12. Insertar la sonda de temperatura rectal y conectar los cables al sistema de calefacción de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    Nota: Ajuste la temperatura de la resistencia de calentamiento del cuerpo a 37 ° C y la plataforma fase oreja a 35 ° C.

7. Multifotónica Microscopio Sety los parámetros de imagen

Nota: Este protocolo utiliza un solo haz, microscopio multifotónica con un sintonizable (680 - 1.080 nm) Ti: Sa láser (3,3 W a 800 nm; longitud de pulso de 140 fs; tasa de repetición de 80 MHz) con un objetivo 20X agua (NA = 1.0) para los estudios de imagen intravital.

1. Abra el software de imágenes.
2. Alinear el láser de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Ajustar la longitud de onda de excitación a 950 nm.
   Nota: GFP y azul de Evans pueden ser simultáneamente excitado a 950 nm.
4. Para vista previa, utilice los siguientes valores: 500 m ² scanfield, 505 x 505 píxeles de resolución y una frecuencia de barrido de 800 Hz en una sola línea de exploración. Haga clic en "Vista previa".
5. Cambiar la potencia de atenuador (láser). Asegúrese de que todas las señales esenciales son recogidos sin exponer el campo de la imagen a cantidades excesivas de la potencia del láser, que pueden inducir el daño por calor.
   Nota: Comience en un atenuador de baja potencia y aumentar si el signal es tenue. Como los neutrófilos estarán ausentes del intersticio en el momento temprano señala post-reperfusión, los macrófagos se pueden usar como un indicador para determinar la potencia mínima necesaria, ya que los primeros son más débiles que los neutrófilos.
   Nota: Si este paso se va a hacer por primera vez, ajustar la configuración de la zona no isquémica, donde se espera que la integridad vascular intacto y facilitará el ajuste de la potencia atenuador. En experimentos posteriores, estos ajustes no requieren mucha modificación a menos que la potencia del láser es inestable.
6. Ajuste la configuración de PMT.
   Nota: Consulte con el fabricante para la tensión máxima ganancia óptima para el PMT. Ajuste de la tensión PMT más allá del umbral recomendado resultará en una mayor relación de señal a ruido. La recomendación general es fijar el voltaje PMT ganar al umbral recomendado y para aumentar la potencia atenuador según sea necesario debe ser la señal demasiado tenue.
7. Seleccionar una región de imagen que se encuentra en las proximidades deel borde de la isquemia, caracterizado por masiva fuga de azul de Evans.
8. Recoger las buenas prácticas agrarias y las señales de color azul Evans utilizando 525/50 de paso de banda (BP) y 655/40 filtros BP, respectivamente. Para las señales de segunda generación armónica (SHG) de las fibras de colágeno dentro del compartimento dérmica, utilizar un filtro de 475/42 BP.
9. Crear una carpeta para guardar las imágenes en un formato que es compatible para el software de análisis de imágenes disponibles.
10. Adquirir, utilice los siguientes valores: 500 m ² scanfield, 505 x 505 píxeles de resolución y un análisis de frecuencia de 400 Hz en una sola línea de exploración.
11. A 100 m z-pila con un tamaño de paso de 4 micras, se puede adquirir repetidamente en el tiempo, a intervalos de 1 min, para controlar la infiltración de neutrófilos.
    Nota: Especialmente para los leucocitos (por ejemplo, neutrófilos) con una velocidad más alta migratoria, un intervalo que es mayor que 1 min puede dar lugar a dificultades durante el análisis de rastreo celular. En este caso, el usuario puede reducir o bien el espesor de la acquisition pila o aumentar la frecuencia de barrido.
    Nota: Mientras que la pila de adquisición requerido de la zona isquémica puede aparecer más pequeña, como resultado de la compresión (como alternativa que se caracteriza por una intensidad SHG superior), la reperfusión posterior resultará en la inflamación masiva que hace que la oreja se hinche. Se espera que las derivas importantes en la dirección Z. Como tal, la adquisición de un gran z-pila es necesario para dar cabida a la deriva.
12. A lo largo de la proyección de imagen, llenar completamente la PBS y agua regularmente para mantener el oído húmedo y la lente del objetivo sumergido en el agua.
    Nota: Un experimento típico por lo general dura de 2 - 4 h. Dependiendo del diseño experimental, y se acopla con un régimen de anestesia bien controlado, que se extiende la duración de la formación de imágenes es posible.

8. Terminación del Experimento

1. La eutanasia a los ratones por asfixia con dióxido de carbono de acuerdo con la institución del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) procedures.
   Nota: Siempre sacrificar al ratón con métodos reconocidos, según lo determinado por las reglas, regulaciones y directrices de la institución. Si se necesita la imagen repetida, mantenga el ratón sobre el cojín eléctrico hasta que el efecto de la anestesia. Una vez que el ratón se ha recuperado el conocimiento suficiente y es móvil, devolver el ratón a su jaula.

Análisis 9. Imagen

Nota: Los datos generados a partir del experimento de imágenes pueden ser visualizadas por los diferentes paquetes de software.

1. Abra el software de análisis de imágenes.
2. Bajo Supera modo, importar el archivo (Open → seleccionar cualquier archivo en la carpeta deseada → Haga clic en "abrir").
3. Editar seudo colores si los colores por defecto no se aplican (ajuste Edición → Pantalla → En la pestaña del canal, seleccionar el color deseado en la paleta de colores).
4. Ajustar el brillo, el contraste y el fondo (Editar → Ajuste de pantalla → Activar valores máximo y mínimo).
5. Asegúrese de que las dimensiones del archivo son correctos (propiedades Editar → → En la ficha geometría, comprobar el tamaño del voxel. En este protocolo, X = 0.99, Y = 0,99, y Z = 4).
   Nota: Derivar X e Y dividiendo la dimensión scanfield por la resolución de píxeles. Z es el espesor entre cada rebanada.
   Nota: La salida de estos conjuntos de datos se puede presentar como películas de proyección máxima.
   Nota: se requiere un análisis de seguimiento para caracterizar completamente las actividades celulares e interacciones con el fin de comprender su función in vivo. Las instrucciones detalladas de seguimiento de celda utilizando la función de lugar disponible en el software se pueden encontrar en el protocolo de referencia 15.
   Nota: Hay muchas formas de cuantificar la migración de leucocitos, cuyos detalles se pueden encontrar en el artículo de revisión de referencia 16.

Resultados

Este protocolo utiliza una plataforma de imágenes piel de la oreja hecha a la medida, como se muestra en la Figura 1. Varias características de esta plataforma se han diseñado específicamente para facilitar la formación de imágenes mientras se mantiene la configuración fisiológicas. La colocación de la oreja en la plataforma de latón calentado no sólo mantiene el oído a una temperatura fisiológica de 35 ° C, pero también aísla el oído de los movimientos ...

Discusión

Significado

IR es una de las principales causas de las úlceras por presión de la piel. Las etapas tempranas (I y II) de las úlceras por presión describen el estado de la piel humana (en comparación con los tejidos subcutáneos subyacentes y los músculos). Sin embargo, una comprensión de la etiología inmunológica todavía falta. A continuación, presentamos un modelo IR simple y robusto en la piel de oreja de ratón con el fin de llenar este vacío. Simulamos la isquemia mediante la suj...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strains
Lysozyme-GFP C57BL/6	Thomas Graf, Center for Genomic Regulation
C57BL/6-C2J	Jackson Laboratories	000058	To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PBS
Viaflex 0.9% (wt/vol) saline	Baxter Healthcare	F8B1323
Ketamine (100 mg ml−1 ketamine hydrochloride	Parnell		Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed
Ilium Xylazil-20 (20 mg ml−1 xylazine hydrochloride)	Troy Laboratories		Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed.
Evans blue (10 mg ml−1 in PBS or saline)	Sigma-Aldrich	46160
Ultrapurified water
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Insulin syringe with needle	BD	328838
Transfer pipettes	Biologix Research Company	30-0135
3M paper masking tape	3M	2214
Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm)	Paul Marienfeld	101112
Curved splinter forceps	Aesculap, B. Braun Melsungen	BD312R
Veet hair removal cream	Reckitt Benckiser
Medical cotton-tipped applicators	Puritan Medical Products Company	806-WC
C-fold towels	Kimberly-Clark	20311
Kimwipes delicate task wipes	Kimtech Science	34155
Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12mm in diameter and 2mm thick	first4magnets	F656S
Plastic guide, 10cm by 1.5cm (polyvinyl chloride material)			fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in
High vacuum grease	Dow Corning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
TriM Scope II single-beam two-photon microscope	LaVision BioTec
Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate)	Coherent
Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0)	Olympus	XLUMPLFLN20xW
Name	Company	Catalog Number	Comments
Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue)
495 long-pass	Chroma	T495LPXR
560 lomg-pass	Chroma	T560LPXR
475/42 band-pass	Semrock	FF01-475/42-25
525/50 band-pass	Chroma	ET525/50m
655/40 band-pass	Chroma	NC028647
Name	Company	Catalog Number	Comments
Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly)
A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm)
A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Fig. 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge)
Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation
Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform
Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640106	connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35°C
Resistive heater blocks RH-2	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640274	Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating.
Temperature controller TC-344B for the ear platform	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640101
Temperature controller TR-200 for mouse heating pad	Fine Science Tools	21052-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Power supply for TR-200	Fine Science Tools	21051-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Heating pad	Fine Science Tools	21060-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives.
Animal rectal probe	Fine Science Tools	21060-01	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip holder
2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length
1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram)
3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place
1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge
1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod
1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging analysis software
Imaris v8.1.2	Bitplane