免疫応答の生体内多光子イメージングのためのマウスの耳の皮膚に虚血再灌流傷害を誘導します

要約

このプロトコルは、磁石クランプを使用して、マウスの耳の皮膚上の虚血再灌流（IR）モデルの誘導を説明します。カスタム構築された生体イメージングモデルを使用して、我々は、in vivo炎症反応後の再灌流に留学します。この技術の開発の背後にある理論的根拠は、白血球が皮膚のIR傷害に応答する方法の理解を拡張することです。

要約

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

概要

虚血再灌流障害（IRI）一過性低酸素症が原因で組織（再灌流）のその後の再酸素化に続いて血流（虚血）の障害物に存在する場合に発生します。皮膚では、虚血再灌流（IR）は、長時間の安静が負傷で長期入院患者を素因褥瘡の病態生理に貢献する要因の一つであると考えられています。これらの患者では、皮膚およびその下の筋肉の両方が絶えず、放置すれば、壊死¹になることがあり、ローカライズ負傷で、その結果、骨隆起の領域の上に加わる重量圧力にさらされています。

IRIに関係する被害が2つある。虚血の間、血管の閉塞は、組織への酸素供給の大幅な低下をもたらします。これは、細胞の代謝に関与するATPアーゼを不活性化ATPおよびpHの低下をもたらします。ターンでは、細胞内カルシウムレベルは、スパイク、と強調またはcを損傷しましたellsは、アポトーシスまたは壊死^2を受けます。細胞内の内容や損傷関連分子パターン（DAMP）のリリースは、HMGB1のように、炎症反応³に貢献しています。第二の侮辱は、再灌流の間に発生します。酸素およびpHレベルは、再灌流時に復元されているが、これは、細胞内の脂質、DNA、及びタンパク質の酸化をもたらす、反応性酸素種（ROS）の生成をもたらします。その結果、前炎症性メディエーターは、炎症部位²への免疫細胞の動員を伴う二次的炎症反応をオフ設定する、活性化されます。炎症反応に至る生化学的事象のカスケードが十分に説明されたが、免疫細胞の活動の空間的及び時間的調節は、十分に理解されていません。

ここでは、簡単なマグネットクランプを使用して、マウスの耳の皮膚に堅牢なIRモデルについて説明します。我々は、多光子生体イメージング（MP-IVM）と相まって再灌流が行われた後に発生するin vivoでの炎症反応を研究するためのモデルを確立しました。この技術の開発と利用の背後にある論理的根拠は、間質および浸潤細胞の両方をリアルタイムでIRへの対応方法を理解しようとすることです。

彼らはそれらをより少なくより理想的な免疫学的研究⁴のための作り、皮膚の側腹部に鋼板の外科的移植を必要とする皮膚の脇腹にクランプ技術を用いて、IRの既存のモデルは、非常に侵襲的です。同様の非侵襲的なクランプ技術は、マウス皮膚フランク^5,6に記載されています。それは、呼吸による動きを回避し^、7,8を画像化^する時の安定性を提供していますようにしかし、この方法では生体イメージングコンポーネントを組み込むのは、代わりに、対象となるIRサイトとして耳の皮膚を選びました。また、間質にまたがる白血球サブセットはあるが、耳の皮膚と皮膚フランク間で同一であります数字と割合はわずか^9を異なる場合があります。したがって、耳の皮膚は、理想的な撮像部位を表します。

また、これらのIRIモデルから取り出され、ほとんどのデータは、巨視的評価（潰瘍のグレーディング）とエンドポイントの炎症の指標¹⁰の顕微鏡分析に限定されています。このモデルを用いて、蛍光レポーターマウスの皮膚における再灌流後の好中球の細胞応答のリアルタイム可視化が有効になっています。以前に公開された生体内耳イメージングモデルは、追加の修飾（ 図1、図2）を用いて^8に使用されます。

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プロトコル

生きた動物を扱うすべての実験は、関連するすべての動物の使用およびケアガイドラインと規則に基づいて行われました。

蛍光レポーターマウスの1選択

1. 6〜12週齢のLysM-EGFP ¹¹マウス（男性または女性のいずれかについて問わない）を使用します。
   注：様々な細胞特異的蛍光レポーターマウスの使用は、in vivoで異なる免疫細胞の可視化を可能にします。この株は、単球（GFPの^LO細胞 ）、および皮膚のマクロファージ（GFPの^LO細胞 ）を可視化することができる、循環好中球（GFP ^hi細胞）を循環します。撮像パラメータを使用すると、GFP陽性好中球からの唯一の明るい信号が検出されます。
   注：皮膚イメージング研究のこのタイプに適した免疫細胞特異的蛍光レポーターマウス株のリストは文献8に見出すことができます。
   注：非常pigmenとして、アルビノマウスはイメージングのために使用することをお勧めしますテッドマウスは、光損傷になりやすいです。着色された耳の皮膚が（組織の燃焼を示す）レーザ誘起スペックルにはるかに敏感であるためです。結果として、好中球の動員および蓄積も定常状態^8,12の間に観察されてもよいです。
2. 12時間の明暗サイクルの特定の病原体を含まない（SPF）条件下でマウスを保管してください。

2.マウスの麻酔

1. 15 mgのmLの^-1ケタミンおよび1mg ml ^-1の滅菌水に溶解したキシラジンの混合物からなるケタミン-キシラジン（8μLのグラム^-1体重）の腹腔内注射でマウスを麻酔。
2. 調製手順全体で、37℃でその体温を維持するために加熱パッド上にマウスを置きます。つま先ピンチ反射の欠如を観察することにより、十分な麻酔のために確認してください。
   注：最初の一時間後、麻酔薬のその後の四半期の用量を皮下投与する必要がありますdは約0.5時間ごとに続きます。ウィスカーのけいれんや尾も麻酔がオフに着用し、トップアップが必要であるとされていることを示すことができます。
3. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に眼科潤滑剤を使用してください。

3.脱毛

1. 綿チップアプリケーターを使用して、背側のマウスの耳の上部の三分の二に脱毛クリームを慎重に適用されます。
2. 徹底したが、穏やかな方法で湿った綿チップアプリケーターを使用してクリームを削除する前に3分 - 2のを待ちます。
   注：それは炎症^13,14を誘導することができるように、脱毛クリームが長すぎるために、マウスの耳に滞在しないようにしてください。

虚血および再灌流障害の4誘導

1. マウスの耳皮膚における虚血を誘導するために、直径12mm×2ミリ厚の金メッキ、N42グレードのネオジム磁石を使用し、約3,000のガウス定格。
   注：この場合、磁石のディンプル顔が電王TESそのN極。
2. 個々のプラスチックガイドに磁石をスロット。
   注意：プラスチック製ガイドは、高強度の磁石の配置および分離を容易にするのに役立ちます。それらの強力な磁力破損し、まだ低抵抗のために、相互に、または他の金属に近接して個々の磁石を配置しないでください。彼らは互いの方向に引っ張った場合に破損や分裂が発生することがあります。
3. 唯一のエッジが第二（腹側）の磁石（ 図3a）に接触するように第1（背側）の磁石を配置
   注：これは、彼らが適切に配置されている前に一緒にスナップから磁石を防ぐことができます。
4. 腹側の磁石が耳（ 図3a）に平らになるように両方の磁石を配置します。
   注：虚血が誘導される前に、マウスを37℃に維持され、その十分な麻酔が（ステップ2.2参照）が維持されていることを確認してください。
5. 準備ができたら、慎重に（ 図3a磁石が一緒に来てみましょう）。
   注：IR及び非IR領域を観察できるように、画像化目的のために、耳の半分だけをクランプ。
6. 虚血の1.5時間後、再灌流が行わできるように、プラスチック製のガイドを使用して互いに離れる磁石をねじることによって磁石を削除します。
   注意：注意は、磁石が配置されたときにしわから耳を防ぐために注意しなければなりません。肉眼で見える主要な血管が直ちに再灌流場合不完全虚血は明らかである磁石が除去された後（ すなわち、血液は直ちに血管を埋めます）。再灌流は、磁石を除去した直後に発生していないが、血管閉塞は、一過性です。このように、迅速に、可能な画像化するためのマウスの耳を調製することが不可欠です。

血管標識剤の5インジェクション

1. すぐに磁石を除去した後、エバンスブルー（10mgのミリリットル（眼窩後または尾静脈注射を介して）を静脈内投与し^-1PBSまたは生理食塩水で。 1μLのグラム^-1体重）または選択した別の血管標識剤。
   注：注射する前に、十分な麻酔がまだピンチ穏やかなつま先を実行することによって維持されていることを確認してください。

イメージングプラットフォーム上で耳の6配置

1. テープに長さ1.5センチ、幅1.8センチマスキングの2枚をカット。
2. 接着剤の側面は、その幅に沿って接着剤の約1ミリメートルを残しながら、一緒に固執することができます。
3. 耳のプラットフォーム上のスリット内にその配置に対応するために、長さ方向、二つにマスキングテープをカットします。
4. 接着面が上を向くように、スリットの途中については、このマスキングテープを挿入します。
5. 加熱パッド上にマウスを置き、画像化されるの耳はマスキングテープストリップの隣ようなものであること。
6. 2 PBSで湿らせたコットンチップアプリケーターを使用して、静かに接着剤ストリップに対して耳を押してください。
7. ガイドとしてストリップを使用して、マウスの耳をもたらしますスリットから同時に近いステージに向かってマウスを調整しながら。
8. 粘着テープを削除するには、最初のテープの接着性を減少させるためにPBSのドロップを追加します。
9. 細かい絵筆を使ってできるだけ穏やかマスキングテープからのマウスの耳を区切ります。
10. そっと耳の上に湿った綿チップアプリケーターを圧延することによって耳のプラットフォームに対して耳を平らに。
11. （グリースを使用して、カバースリップホルダーの位置に保持されている; 図2）カバースリップの下にPBSのドロップを入れて、そっと耳の上に置きます。必要に応じて、より多くのPBSでトップアップ。
    注意：カバースリップホルダーは、撮影時の安定性を高めます。
12. 直腸温度プローブを挿入し、製造元の指示に従って加熱システムに配線を接続します。
    注：37°Cにボディ加熱パッドの温度と35℃に耳ステージプラットフォームを設定します。

7.多光子顕微鏡セットアップおよびイメージングパラメータ

注：このプロトコルは調整可能で、多光子顕微鏡を単一のビームを使用しています（680 - 1080 nm）でのTi：サレーザー（3.3 W nmの800で、140フェムト秒のパルス長、80 MHzの繰り返し率）20X水目的とした数（NA = 1.0）生体内イメージング研究のために。

1. イメージングソフトウェアを開きます。
2. 製造元の指示に従ってレーザーを合わせます。
3. 950 nmの励起波長を調整します。
   注：GFPとエバンスブルーは、950 nmで同時に励起することができます。
4. 500μmの² scanfield、505 X 505ピクセルの解像度、および単一ラインスキャンで800ヘルツの走査周波数：プレビューするには、次の設定を使用します。 「プレビュー」をクリックします。
5. 減衰器（レーザー）の電源を切り替えます。熱損傷を引き起こす可能性がある、すべての重要な信号はレーザパワーの過剰な量に撮像視野を公開せずにピックアップされることを確認してください。
   注：場合は、低減衰器の電力で起動し、増加シグナlは薄暗いです。早い時点での間質の再灌流後の点からの好中球が存在しないであろうように、前者は、好中球より調光されているように、マクロファージは、必要最小限の電力を決定するためのゲージとして使用することができます。
   注：このステップは、初めて実行する場合は、無傷の血管の完全性が期待されている非虚血性ゾーン、で設定を調整し、減衰力の設定を容易にします。レーザー出力が不安定でない限り、その後の実験では、これらの設定は、多くの変更を必要としません。
6. PMTの設定を調整します。
   注：PMTのための最大の最適なゲイン電圧については、製造元に確認してください。推奨される閾値を超えてPMT電圧を設定すると、より高い信号対雑音比をもたらすであろう。一般的な推奨事項は、信号があまりにも暗くなるべき推奨閾値にPMTのゲインの電圧を設定するために、必要に応じて減衰力を増大させることです。
7. に近接している撮像領域を選択します大規模なエバンスブルー漏出することを特徴と虚血のエッジ、。
8. GFPは、それぞれ、50分の525のバンドパス（BP）と655/40 BPフィルターを使用して、エバンス青の信号を収集します。第二高調波発生のための真皮区画内のコラーゲン繊維の（SHG）信号、42分の475 BPフィルターを使用しています。
9. 使用可能な画像解析ソフトウェアの互換性のある形式で画像を保存するフォルダを作成します。
10. 500μmの² scanfield、505 X 505ピクセルの解像度、および単一ラインスキャン中の走査周波数は400Hz：取得するには、次の設定を使用します。
11. 4ミクロンのステップサイズで100ミクロンのzスタックは、好中球浸潤をモニターするために、1分間隔で、時間をかけて繰り返して取得することができます。
    注：特に高い遊走速度、細胞トラッキング分析中に困難をもたらす可能性がより長く1分である間隔で、白血球（ 例えば、好中球）のために。この場合、ユーザは、いずれかの交流の厚さを減少させることができます走査周波数をquisitionスタックまたは増加。
    注：虚血性ゾーンの必要な取得スタックが（あるいはより高いSHG強度を特徴とする）圧縮の結果として、小さく見えるかもしれないが、その後の再灌流は耳を膨潤させる大規模な炎症になります。 Z方向の大幅なドリフトが期待されています。このように、大zスタックの取得は、ドリフトに適応する必要があります。
12. イメージングを通して、しっとりとした水に浸漬対物レンズ耳を保つために定期的にPBSおよび水をトップアップ。
    注：典型的な実験は、通常、2続く - 4時間。実験デザインに応じて、十分に制御された麻酔体制と相まって、イメージングの期間を延長することは可能です。

8.実験の終了

1. 広報機関の施設内動物管理使用委員会（IACUC）に従って、二酸化炭素窒息によりマウスを安楽死させますocedures。
   注：金融機関の規則、規制、ガイドラインによって決定されるように、必ず承認された方法により、マウスを安楽死させます。繰り返しイメージングが必要な場合は、麻酔が切れるまで、加熱パッド上でマウスを保持します。マウスが十分な意識を取り戻し、モバイルになっていたら、そのケージにマウスを返します。

9.画像解析

注：イメージング実験から生成されたデータが別のソフトウェアパッケージで可視化することができます。

1. 画像解析ソフトウェアを開きます。
2. 下のファイルをインポートし、モードを突破（オープン→は「開く」をクリックし任意のフォルダ→内の任意のファイルを選択します）。
3. 編集偽色デフォルトの色が適用されない場合（チャネル]タブで[編集]→ディスプレイの調整→は、カラーパレットから希望の色を選択します）。
4. 明るさ、コントラスト、バックグラウンド（トグル最大と最小値→[編集]→[表示調整）を調整します。
5. ファイルのサイズが正しいことを確認します（[編集]→[画像のプロパティ→ジオメトリ]タブの下で、ボクセルサイズをご確認ください。このプロトコルでは、X = 150、Y = 150、およびZ = 4）。
   注：ピクセル解像度によってscanfield寸法を分割することによって、XとYを求めよ。 Zは、各スライスの間の厚さです。
   注：これらのデータ・セットの出力が最大値投影動画として提示することができます。
   注：トラッキング分析は完全にin vivoでそれらの機能を理解するために、細胞活動との相互作用を特徴づけるために必要とされます。ソフトウェアで利用可能なスポット関数を使用して、細胞トラッキングの詳細な手順については、リファレンス15内のプロトコルに記載されています。
   注：リファレンス16でのレビュー記事に記載されています詳細は白血球遊走を定量化する多くの方法があります。

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結果

図1に示すように、このプロトコルは、特注の耳の皮膚画像化プラットフォームを使用します。このプラットフォームのいくつかの特徴は、特に、生理学的設定を維持しながら、撮像を容易にするように設計されています。加熱された真鍮製のプラットフォーム上で耳を配置すると、35℃の生理的温度で耳を維持するが、それはまた、呼吸のために避けら?...

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ディスカッション

意義

IRは、皮膚褥瘡の主要な原因の一つです。 （下層の皮下組織と筋肉と比較して）褥瘡の初期段階（IおよびII）は、ヒトの皮膚の状態を記述する。しかしながら、免疫学的病因の理解がまだ不足しています。ここでは、このギャップに対処するために、マウスの耳の皮膚上で簡単かつ堅牢なIRモデルを提示します。我々は2つの磁石と、その後磁石の除去（再灌流）の後?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strains
Lysozyme-GFP C57BL/6	Thomas Graf, Center for Genomic Regulation
C57BL/6-C2J	Jackson Laboratories	000058	To be crossed with Lysozyme-GFP to generate albino Lysozyme-GFP for skin imaging
Reagents
PBS
Viaflex 0.9% (wt/vol) saline	Baxter Healthcare	F8B1323
Ketamine (100 mg mL−1 ketamine hydrochloride	Parnell		Ketamine is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed
Ilium Xylazil-20 (20 mg mL−1 xylazine hydrochloride)	Troy Laboratories		Xylazil-20 is a controlled drug and all relevant local regulations should be followed.
Evans blue (10 mg mL−1 in PBS or saline)	Sigma-Aldrich	46160
Ultrapurified water
Equipment
Insulin syringe with needle	BD	328838
Transfer pipettes	Biologix Research Company	30-0135
3 M paper masking tape	3M	2214
Deckglaser microscope cover glass (22 mm × 32 mm)	Paul Marienfeld	101112
Curved splinter forceps	Aesculap, B. Braun Melsungen	BD312R
Veet hair removal cream	Reckitt Benckiser
Medical cotton-tipped applicators	Puritan Medical Products Company	806-WC
C-fold towels	Kimberly-Clark	20311
Kimwipes delicate task wipes	Kimtech Science	34155
Gold-plated, N42-grade neodymium magnets, 12 mm in diameter and 2 mm thick	first4magnets	F656S
Plastic guide, 10 cm by 1.5 cm (polyvinyl chloride material)			fold in half lengthwise, bind with masking tape and slot magnet in
High vacuum grease	Dow Corning
Microscope
TriM Scope II single-beam two-photon microscope	LaVision BioTec
Tunable (680–1,080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Ti:sapphire laser (≥3.3 W at 800 nm; pulse length of 140 fs, 80 MHz repetition rate)	Coherent
Water-dipping objectives (20×, NA = 1.0)	Olympus	XLUMPLFLN20xW
Miscroscope filter and mirror sets (for imaging GFP, SHG, Evans Blue)
495 long-pass	Chroma	T495LPXR
560 lomg-pass	Chroma	T560LPXR
475/42 band-pass	Semrock	FF01-475/42-25
525/50 band-pass	Chroma	ET525/50m
655/40 band-pass	Chroma	NC028647
Skin-imaging stage platform (refer to diagram for assembly)
A metal base plate (126 mm × 126 mm × 1 mm)
A brass platform for the ear (79 mm × 19 mm; 1 mm thickness at side, 0.5 mm thickness in the middle; Figure 1) with slit (1.7 mm × 1 mm; 1.5 mm away from long edge)
Two plastic blocks (10 mm in height)—for heat insulation
Curved holder, for positioning the control thermistor on the ear platform
Interface cable CC-28 with DIN connector and thermistors, one for the temperature control and the other for the temperature monitor	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640106	connect the interface cable to both resistive heater blocks set at 35 °C
Resistive heater blocks RH-2	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640274	Resistive heater blocks can heat the brass ear platform up to over 100 °C within minutes. Ensure that the control thermistor has been properly secured in the holder in order to avoid overheating.
Temperature controller TC-344B for the ear platform	(Warner Instruments (Harvard Apparatus)	640101
Temperature controller TR-200 for mouse heating pad	Fine Science Tools	21052-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Power supply for TR-200	Fine Science Tools	21051-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives
Heating pad	Fine Science Tools	21060-00	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives.
Animal rectal probe	Fine Science Tools	21060-01	Unit is no longer for sale. Ask manufacturer for alternatives. After connecting the rectal probe and heating pad to the temperature controller TR-200, set the temperature to 37 °C
Coverslip holder
2 plastic rods, 1 cm in diameter, 10 cm in length
1 plastic adaptor with holes drilled to accommodate rods (refer to diagram)
3 plastic tightening screws for keeping plastic rods in place
1 metal plate, 6 cm x 2.5 cm, with a 2 cm square cut at 1 end, 2 mm edge away from short edge
1 pair of nut and bolt for attaching metal plate to plastic rod
1 acrylic base (4 cm x 5 cm x 1.5 cm) with magnet to hold coverslip holder on skin-imaging stage platform. 1 rod is permanently fixed onto base.
Imaging analysis software
Imaris v8.1.2	Bitplane