الشعرية الكهربائي فصل حيدة النسيلة الأجسام المضادة الإسوية باستخدام الشعرية محايد

Summary

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Abstract

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Introduction

الاجسام المضادة (MABS) هي بروتينات biotherapeutic مع تزايد الاهتمام نظرا لقدرتها على التحرك ضد العديد من الأمراض المزمنة والتنكسية ^1. مثل الجزيئات الحيوية الأخرى، MABS عرضة للخضوع العديد من التعديلات الفيزيائية في جميع مراحل دورة حياتها (أي، من الحيوي إلى المنتج النهائي). وتشمل هذه التعديلات، ولكن لا تقتصر على: نزع الأميد، بالغليكوزيل، والأكسدة، cyclization، المماكبة، وتجميع والانقسام بروتين ^2. وبالتالي، هناك حاجة إلى تقنيات تحليلية قادرة على حل الإسوية الجوهرية لمراقبة MABS عدم التجانس والاستقرار من أجل وضع مواصفات الجودة.

الشعرية الكهربائي (م) هو تقنية فصل عالية الأداء التي تقوم outinside من أنبوب تنصهر السيليكا الضيق (مجموعة ميكرون) مليئة بالكهرباء الخلفية (BGE). بناء على طلب من مجال كهربائي (تصل إلى 30،000 V)، جزيء مشحونةالصورة الهجرة نحو القطب مع المسؤول المعاكس (أي مدفوعة الكهربائية الفصل). استخدام الفولتية العالية في CE يسمح التحاليل السريعة وزيادة الكفاءة، والتي تعلو على الكهربائي للهلام الكلاسيكية. الكهربائي منطقة الشعرية (تشيكيا) هو أسلوب قائم على CE تستخدم بشكل روتيني في صناعة الأدوية الحيوية لتقييم جودة المنتج ^3-9. وخلافا لغيرها من وسائط CE (على سبيل المثال، هلام الشعرية الكهربائي، الشعرية ISOELECTRIC التركيز) أو أساليب تعتمد على اللوني، ويمكن إجراء تشيكيا دون استخدام denaturants أو واجهات الحالة الصلبة، والسماح للتحليل التباين المتأصل في MABS قريبة من الدولة الأصلية الخاصة بهم ¹⁰ . الفصل تشيكيا من الأشكال الإسوية ماب يحدث داخل الشعرية تنصهر السيليكا مغطاة ماء البوليمر (الشعرية محايد) ويقوم على التنقل الكهربي مختلفة، والتي يحكمها تهمة والكتلة والحجم والشكل (أو حجم الهيدروديناميكية) ^11. تم الكشف عن الأنصاف ماب عندمافهي تتحرك وتمر عبر نافذة الكشف، التي لمست من قبل كاشف الأشعة فوق البنفسجية (UV) الامتصاصية في 214 نانومتر ^(4).

والتنفيذ الناجح لهذه التقنية التحليلية يعتمد على الاهتمام المناسب لتفاصيل قبل وأثناء التجربة. يتصرف خلاف ذلك سيزيد من التكلفة والوقت لإجراء التحليل، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الفشل المستمر والإحباط.

هنا، نقدم دليل خطوة بخطوة لإجراء تحليل الناجح لماب عدم التجانس التي كتبها تشيكيا من خلال شرح مفصل لتحضير محاليل والعينات، وإعداد نظام CE، أساليب أداة إعداد، والحصول على البيانات، و تجهيز. لغرض هذا البرنامج التعليمي، المؤتلف الإنسان بالكامل ألفا المضادة للعامل نخر الورم يستخدم (مكافحة TNFα) ماب كنموذج البروتين. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تخصيصها بسهولة لتحليل البروتينات الأخرى التي تفكر في التعديلات وجيزة. اdditionally، يقترح المشاكل المحتملة عدة توصيات للتخفيف. ومما يشجع القارئ على تتبع بدقة البروتوكول المقترح، واحتمال أن تنجح سوف تزيد.

Protocol

1. إعداد حلول

1. إعداد الحل BGE.
   1. إعداد 100 مل من محلول مكون من 0.05٪ (م / ت) السليلوز بروبيل هيدروكسي ميثيل (HPMC)، 200 مم ε الأمينية ن الكابرويك حمض (EACA) و 30 ملي خلات ليثيوم.
      ملاحظة: كما HPMC هو بوليمر اللزجة، صب مسحوق في كوب من الزجاج، إضافة 80 مل من الماء، وأخيرا إضافة شريط التحريك. متابعة إضافة الكواشف المتبقية بشكل طبيعي. ارتداء النظارات الواقية عند التعامل مع خلات الليثيوم لأنها يمكن أن تسبب تهيج العين.
   2. ضبط لقيمة الرقم الهيدروجيني 4.8 ± 0.1 مع 50٪ (ت / ت) وحامض الخليك. يسمح الحل لتحقيق الاستقرار لمدة 5 دقائق وضبط حسب الضرورة.
   3. يضاف الماء إلى أن تصل إلى الحجم النهائي من 100 مل في القارورة الحجمية.
   4. تصفية من خلال غشاء ماء مع حجم 0.2 ميكرون المسام.
   5. متجر في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.
2. إعداد معيار الداخلية.
   1. إعداد 1 ملحل تتكون من 1٪ (م / ت) الهستامين.
   2. تصفية من خلال غشاء ماء مع حجم 0.2 ميكرون المسام.
   3. متجر في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 يوم.

إعداد 2. عينة

1. إعداد 180 ميكرولتر من عينة ماب المخفف مع العازلة تريس (50 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane، ودرجة الحموضة 8.0) إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل.
2. إضافة 20 ميكرولتر من 1٪ (م / ت) الهستامين.
3. خلط وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 5 ثوان.
4. ضع قارورة صغيرة داخل قارورة العالمية.
5. نقل العينة إلى القارورة الصغيرة وسقف القارورة العالمية. الاستغناء العينة صعودا من أجل تجنب إدخال أي فقاعات.
6. متجر في 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 يوم.
7. ضع قارورة العالمي (مع قارورة صغيرة تحتوي على محلول العينة) في علبة عينة مدخل.

3. إعداد نظام CE.

1. تنظيف نظام CE.
   ملاحظة: عشر السلوكهو الإجراء مرة واحدة في الأسبوع على الأقل لتجنب تسرب التيار الكهربائي المستمدة من تراكم الغبار والحطام. ومع ذلك، اعتمادا على التطبيق (على سبيل المثال، استخدام BGE مع زيادة اللزوجة أو مع تركيز الملح العالية، والعينات مع زيادة اللزوجة) الأقطاب والعتلات فتح قد يحتاج إلى تنظيفها بشكل متكرر أكثر لمنع التلوث وعينة المرحلة.
   1. إيقاف تشغيل مفتاح الطاقة الصك م، وفتح الباب الأمامي.
   2. تنظيف سطح غطاء عينة عينة، عقد نظام (عينة وعازلة صواني)، غطاء خرطوشة، بار المشبك، كتلة واجهة والأقطاب مع محبوكة مبللة بالماء مسح. كرر الإجراء مع مسح وجاف قبل استخدام مبللة الايثانول.
   3. شطف العتلات فتح جيدا بالماء. تنظيف سطحها مع محبوكة مسح. كرر الإجراء مع مسح وجافة قبل التثبيت مبللة الايثانول.
   4. تنظيف طرفي كابل الألياف البصرية دقيقلاي بقطعة قماش ستوكات مبللة بالماء. كرر الإجراء مع قطعة قماش مبللة الايثانول.
2. خرطوشة.
   1. إزالة الشعرية محايد جديد (50 ميكرون القطر الداخلي) من عبوتها.
   2. الشريط أسفل واحدة من نهاية الأنابيب الشعرية وقائية لطاولة العمل. حل، وتصويب وسحب شعري خارج الأنبوب.
   3. عصا قطعة من الشريط أو ورقة لطاولة العمل وإضافة علامات القياس على النحو التالي: طول للكشف عن (30 سم)، نافذة الشعرية (0.2 سم) وطول إلى نهاية مخرج (10 سم) (أي 40.2 سم الطول الكلي، 30.0 سم طول فعالة).
   4. محاذاة النافذة الشعرية إلى علامة قياس 0.2 سم في ورقة مرجعية. إصلاح الشعرية مع الشريط ووضع علامة الشعرية ينتهي 2 مم خارج علامات القياس.
   5. قطع الغطاء الواقي في نهاية مدخل الشعرية (ابعد حد من نافذة) في حركة واحدة على التوالي باستخدام حافة دافق من الحجر الانفطار.
      1. تزج نهاية الشعرية في قارورة عالمية توج مملوءة بالماء لتجنب تلف دائم في طلاء الداخلي الشعرية. كرر هذا الإجراء في كل مرة يتعرض نهاية الشعرية إلى المحيط لأكثر من 1 دقيقة.
   6. إدراج نهاية الشعرية مدخل إلى الجانب منفذ للخرطوشة.
   7. الشد والجذب الشعرية من خلال خرطوشة حسب الضرورة حتى يتم توسيط نافذة الشعرية إلى إطار خرطوشة.
   8. تضاف المكونات الفتحة (100 ميكرون × 200 ميكرون) في إطار خرطوشة.
      ملاحظة: تأكد من أن الضوء الأبيض يمر من خلال النافذة عندما تتعرض لمصدر الأبيض من ضوء. إذا كان الضوء الذي يمر عبر لديه مظهر اللون البني، وضبط حسب الضرورة.
   9. تضاف الشعرية في أنابيب التبريد شكلت قبل لمجموع طول شعري من 40.2 سم (مع الجوز المثبتة مسبقا الأنابيب، الطويق ويا الدائري عند كلا الطرفين في هذا النظام).
   10. دفع الشعرية من خلال coolanر أنابيب الضرورة حتى يظهر الشعرية في الجانب الآخر من الأنبوب.
   11. إدراج نهاية الأنبوب المبرد إلى جانب منفذ للخرطوشة وتشديد الجوز الأنابيب.
   12. إدراج نهاية الشعرية مدخل إلى الجانب مدخل من الخرطوشة.
   13. الشد والجذب الشعرية من خلال خرطوشة حسب الضرورة حتى يظهر الشعرية في الجانب مدخل من الخرطوشة.
   14. إدراج نهاية الأنبوب المبرد إلى جانب مدخل خرطوشة وتشديد الجوز الأنابيب.
   15. قطع الغطاء الواقي في نهاية الشعرية منفذ (النهاية أقرب من الإطار) في حركة واحدة على التوالي باستخدام حافة دافق من الحجر الانفطار.
   16. إدراج مقاطع ختم التوكيل على نهايات الشعيرات الدموية والضغط على لتستقر في الموقف. بصريا تفقد الشعرية ينتهي. إذا لم تكن حتى، كرر الإجراء.
   17. وضع قالب شعري طول على حافة طاولة العمل.
   18. وضع خرطوشة أسفل AGainst قالب شعري طول ومحاذاة الشعرية ينتهي مع خطوط إشارة على القالب. إذا كانت علامات قياس الشعرية (انظر 3.2.4) لا تتماشى مع خطوط إشارة، وضبط حسب الضرورة.
   19. عقد الشعرية ضد قالب شعري طول وقطع طرفي الشعرية باستخدام حافة دافق من الشق حجر 2 ملم تحت خطوط إشارة على القالب.
   20. بصريا تفقد الشعرية ينتهي مع عدسة مكبرة. إذا نهايات الشعيرات الدموية غير متجانسة، تلميع لهم باستخدام وجه ناعم من الحجر الانفطار.
   21. إدراج فتحة يا الدائري في حفرة فتحة المكونات باستخدام أداة الإدراج يا الدائري.
   22. تثبيت قارورة عالمية توج مملوءة بالماء في حالة خرطوشة وخرطوشة المكان إلى حالة مباشرة مع نهايات الشعيرات الدموية إدراجها في قارورة. لتخزين قصيرة وطويلة المدى حفاظ على 2-8 درجة مئوية.
3. إعداد صواني العازلة.
   1. وتملأ المكان الكون توجقارورة القاعدة في مدخل العازلة وصواني منفذ (الشكل 1). مواقف قنينة كرر في الممرات 2 و 3 و 4 و 5 وفقا لعدد من العينات لتحليلها، ووضع مسار واحد لكل ستة حقن العينة.
      ملاحظة: تجنب ترطيب قبعات قارورة لمنع تسرب الحالي.

الشكل 1: المركز وملء مستوى قارورة العالمية في مدخل العازلة ومنفذ علب. ملء مستويات: 1/1 = 1400 ميكرولتر، 3/4 = 1300 ميكرولتر و1/2 = 1000 ميكرولتر. الاختصارات: W = الماء، حمض الهيدروكلوريك = 0.1 M حمض الهيدروكلوريك. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. نظام CE مكونات التجمع.
   1. تثبيت كاشف للأشعة فوق البنفسجية.
   2. تثبيت الروافع فتحعن طريق الضغط على ما يصل إلى كتلة واجهة.
   3. تثبيت كابل الألياف البصرية. أدخل الطرف المقابل للشريط المشبك و، في حين عقد كلا الطرفين، وتدوير في اتجاه عقارب الساعة. قم بتوصيل الطرف الآخر للكشف عن الأشعة فوق البنفسجية.
      ملاحظة: التعامل مع كابل الألياف البصرية مع الرعاية أثناء هذا الإجراء منذ الانحناء يمكن أن تسبب كسر لها.
   4. مكان العينة وصواني عازلة في النظام عينة عقد والمفاجئة في الموقف.
   5. وضع خرطوشة الشعرية في كتلة واجهة و، في حين الضغط على شريط المشبك عند كلا الطرفين، وتشديد الرقابة على المقابض.

4. طرق صك مجموعة المتابعة

1. إنشاء تكييف والجري وطرق اغلاق الصك وفقا للمعايير التالية والجدول 1: الجهد، الحد الأقصى: 30.0 كيلو فولت. الحالي، الحد الأقصى: 300.0 أمبير. درجة الحرارة خرطوشة: 20.0 درجة مئوية. درجة حرارة تخزين العينات: 10.0 درجة مئوية. الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن الظروف الأولية: الطول الموجي: 214 نانومتر. معدل البيانات: 4 هرتز؛ مرشح: عادي؛ عرض ذروة (يشير): 16-25. إشارة الامتصاصية: مباشرة.
   ملاحظة: معدل الحصول على البيانات ويمكن زيادة تصل إلى 25 هرتز من أجل تحسين تغطية مناطق الفصل الضيقة.

قارورة لمنافذ

برنامج الوقت طريقة تكييف
الوقت (دقيقة)	حدث	القيمة	مدة	قارورة مدخل	قارورة المخرج	ملخص	تعليقات
-	شطف - الضغط	2068 مليبار	1.0 دقيقة	BI: C1	BO: C1	إلى الأمام	حمض الهيدروكلوريك 0.1 M
-	شطف - الضغط	2068 مليبار	2.0 دقيقة	BI: B1	BO: C1	إلى الأمام	الماء
-	شطف - الضغط	2068 مليبار	10.0 دقيقة	BI: E1	BO: C1	إلى الأمام	BGE
0.00	مستقل - الجهد	15.0 KV	10.0 دقيقة	BI: D1	BO: D1	0.17 الحد الأدنى منحدر، والاستقطاب الطبيعي	فصل
10.00	شطف - الضغط	2758 مليبار	10.0 دقيقة	BI: E1	BO: C1	إلى الأمام	BGE
20.01	انتظر	-	0.0 دقيقة	BI: A1	BO: A1	-	نصائح شطف
تشغيل البرنامج مرة طريقة
الوقت (دقيقة)	حدث	القيمة	مدة	قارورة مدخل	ملخص	تعليقات
-	شطف - الضغط	2068 مليبار	1.0 دقيقة	BI: C1	BO: C1	إلى الأمام، في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6	حمض الهيدروكلوريك 0.1 M
-	شطف - الضغط	2068 مليبار	2.0 دقيقة	BI: B1	BO: C1	إلى الأمام، في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6	ماء
-	شطف - الضغط	2068 مليبار	4.0 دقيقة	BI: E1	BO: C1	إلى الأمام، في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6	BGE
-	حقن - الضغط	34 مليبار	20.0 ثانية	SI: A1	BO: B1	تجاوز، الى الامام	حقن عينة
-	انتظر	-	0.4 دقيقة	BI: A1	BO: A1	في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6	غسل نصائح
0	مستقل - الجهد	15.0 KV	30.0 دقيقة	BI: D1	BO: D1	0.17 الحد الأدنى منحدر، والاستقطاب العادي، في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6	فصل عينة
0.5	Autozero	-	-	-	-	-	-
30.01	وقف البيانات	-	-	-	-	-	-
30.02	شطف - الضغط	2068 مليبار	2.0 دقيقة	BI: B1	BO: C1	إلى الأمام، في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6	ماء
32.03	انتظر	-	0.0 دقيقة	BI: A1	BO: A1	في / خارج المؤتمر الوطني العراقي قارورة 6	نصائح شطف
32.04	النهاية	-	-	-	-	-	النهاية
برنامج الوقت طريقة الاغلاق
الوقت (دقيقة)	حدث	القيمة	مدة	قارورة مدخل	قارورة المخرج	ملخص	تعليقات
-	شطف - الضغط	2068 مليبار	1.0 دقيقة	BI: E6	BO: E6	إلى الأمام	حمض الهيدروكلوريك 0.1 M
-	شطف - الضغط	2068 مليبار	6.0 دقيقة	BI: F6	BO: F6	إلى الأمام	ماء
-	مصباح - إيقاف	-	-	-	-	-	-
-	انتظر	-	0.0 دقيقة	BI: A1	BO: A1	-	نصائح شطف

الجدول 1: تكييف، تشغيل وبرامج وقت الاغلاق.

5. الحصول على البيانات ومعالجة

1. برمجة مجموعة عينة.
   1. برمجة الشعرية لتكييف باستخدام طريقة تكييف الصك. عند استخدام الشعرية لأول مرة، برنامج أربعة التكرار. خلاف ذلك البرنامج اثنين فقط من تكرار طريقة تكييف.
   2. برمجة عينات لتحليلها باستخدام طريقة أداة تشغيل.
   3. برمجة الشعرية لتخزين باستخدام طريقة أداة الاغلاق وكرر الإجراء المشار إليها في القسم 3.2.22.
2. تشغيل التجربة.
3. تصدير electropherograms.
4. حساب الوقت الهجرة والمحتوى نسبة، وهو الرئيسي الأساسيالإسوية الحمضية الثانية باستخدام العمودي التكامل انخفاض خط الشخصي رحلاني.

النتائج

ويبين الشكل 2 الملف الشخصي التيار الكهربائي نموذجي من 200 ملي EACA، 30 ملي خلات الليثيوم، ودرجة الحموضة 4.8 BGE مع عينة مكافحة TNFα ماب المخفف مع العازلة تريس (50 ملي، ودرجة الحموضة 8.0). كما يمكن ملاحظتها، والحالي هو مستقر في جميع مراحل التحليل ويمكن أ?...

Discussion

في هذا البرنامج التعليمي، وتسليط الضوء على أهمية الممارسات السليمة عندما يحلل إجراء تشيكيا من MABS من أجل زيادة احتمال أن تنجح. ومع ذلك، عند استخدام تشيكيا على أساس روتيني، تنشأ قضايا لا محالة ^12.

للحصول على أفضل النتائج، من ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacial acetic acid	Tecsiquim	AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid	J.T. Baker	9535-05
Histamine dihydrochloride	Fluka	53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose	Fluka	09963
Lithium acetate	Sigma-Aldrich	517992
6-Aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8	Beckman Coulter	477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System	Beckman Coulter	A66528
eCAP Neutral capillary	Beckman Coulter	477441
Vial, Micro, 200 µl	Beckman Coulter	144709
Universal Vial Caps	Beckman Coulter	A62250
Universal Vials	Beckman Coulter	A62251
Cable, Optics, UV/Vis	Beckman Coulter	144093
UV/Vis Detector Module	Beckman Coulter	144733
Cartridge Assembly Kit, Blank	Beckman Coulter	144738