Kapillarelektrophorese Trennung des monoklonalen Antikörpers Isoformen eine Neutral Kapillare

Zusammenfassung

Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.

Zusammenfassung

Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.

Einleitung

Monoklonale Antikörper (mAb) sind Biotherapeutikum Proteine mit steigendem Interesse aufgrund ihrer Handlungsfähigkeit gegen mehrere chronische und degenerative Krankheiten ^1. Wie andere Biomoleküle sind mAbs anfällig mehrere physikalisch - chemische Modifikationen in allen Phasen ihres Lebenszyklus zu unterziehen (dh von Biosynthese zum Endprodukt). Solche Modifikationen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf : Desamidierung, Glykosylierung, Oxidation, Cyclisierung, Isomerisierung, Aggregation und proteolytische Spaltung ^2. Daher analytische Techniken der Lage intrinsische Isoformen zu lösen sind erforderlich mAbs Heterogenität und Stabilität, um zu überwachen, um Qualitätsanforderungen herzustellen.

Kapillarelektrophorese (CE) ist ein Hochleistungstrenntechnik outinside eines schmalen Quarzglasröhre (& mgr; m-Bereich) gefüllt durch mit einem Hintergrundelektrolyten (BGE). Bei Anlegen eines elektrischen Feldes (bis zu 30.000 V), geladenes Moleküls wandern in Richtung der Elektrode mit entgegengesetzter Ladung (dh elektrogetriebene Trennung). Die Verwendung von hohen Spannungen in CE ermöglicht schnelle Analysen und erhöhte Effizienz, die der Elektrophorese klassischen Gel überlegen sind. Die Kapillarzonenelektrophorese (CZE) ist eine CE-basierte Technik routinemäßig in der biopharmazeutischen Industrie für die Produktqualität Beurteilung verwendet ^3-9. Im Gegensatz zu anderen Formen der CE (zB Kapillar - Gel - Elektrophorese, Kapillar - isoelektrische Fokussierung) oder Chromatographie-basierte Methoden können CZE ohne Verwendung von Denaturierungsmitteln oder Festphasen - Schnittstellen durchgeführt werden, so dass die Analyse der inhärenten Heterogenität der mAbs nahe an ihrem nativen Zustand ¹⁰ . CZE Trennung von mAb - Isoformen auftritt innerhalb einer Fused-Silica - Kapillare mit einem hydrophilen Polymer (neutral Kapillare) abgedeckt und auf der Basis ihrer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilität, die durch Ladung, Masse, Größe und Form (oder hydrodynamischen Volumen) ¹¹ ausgeschlossen ist. mAb-Einheiten detektiert, wennsie mobilisiert und durch das Erfassungsfenster, das ⁴ durch ein Ultraviolett (UV) Absorptionsdetektor bei 214 nm gemessen wird.

Die erfolgreiche Umsetzung dieser Analysetechnik wird vor und während des Experiments zu Details über angemessene Aufmerksamkeit abhängen. Acting sonst wird die Kosten und die Zeit erhöhen, um die Analyse durchzuführen, was letztlich zu konstanten Versagen und Frustration führen.

Hier präsentieren wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung, eine erfolgreiche Analyse von mAb Heterogenität durch CZE durch die detaillierte Erläuterung der Herstellung von Lösungen und Proben durchzuführen, die Herstellung von CE-System, das Instrument Verfahren einzurichten, die Datenerfassung und das Verarbeiten. Für die Zwecke dieses Tutorial, eine rekombinante vollständig humanen Anti-Tumor-Nekrose-Faktor alpha (anti-TNF) mAb als Proteinmodell verwendet wird; jedoch kann dieses Protokoll leicht für die Analyse von anderen Proteinen unter Berücksichtigung kurze Änderungen angepasst werden. EINußerdem, mehrere Empfehlungen zu mildern sind mögliche Probleme vorgeschlagen. Der Leser wird aufgefordert, zu streng, die vorgeschlagene Protokoll folgen, da die Wahrscheinlichkeit erhöhen, um erfolgreich zu sein.

Protokoll

1. Herstellung der Lösungen

1. Bereiten Sie die BGE - Lösung.
   1. Herstellung von 100 ml einer Lösung, bestehend aus 0,05% (m / v) Hydroxypropyl Methylcellulose (HPMC), 200 mM ε-Amino-n-Capronsäure (EACA) und 30 mM Lithiumacetat.
      HINWEIS: HPMC ein viskoelastisches Polymer ist, gießen Sie das Pulver in ein Becherglas, fügen Sie 80 ml Wasser und schließlich den Rührstab hinzufügen. Weiter zu den übrigen Reagenzien, wie sie normalerweise die Zugabe. Schutzbrille tragen beim Umgang mit Lithium-Acetat, wie es zu Augenreizungen führen kann.
   2. Passen Sie auf einen pH-Wert 4,8 ± 0,1 mit 50% (v / v) Essigsäure. Lassen Sie die Lösung für 5 min zur Stabilisierung und ggf. korrigieren.
   3. Fügen Sie Wasser, um bis zu einem endgültigen Volumen von 100 ml in Messkolben.
   4. Filter durch eine hydrophile Membran mit einer 0,2 & mgr; m Porengröße.
   5. Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 7 Tage.
2. Bereiten Sie den internen Standard.
   1. Bereiten Sie 1 mleiner Lösung von 1% (m / v) Histamin besteht.
   2. Filter durch eine hydrophile Membran mit einer 0,2 & mgr; m Porengröße.
   3. Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 1 Tag.

2. Probenvorbereitung

1. Bereiten 180 ul mAb Probe mit Tris-Puffer verdünnt (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan, pH 8,0) auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml.
2. Geben Sie 20 & mgr; l von 1% (m / v) Histamin.
3. Mischen und Zentrifugieren bei 1000 × g für 5 Sek.
4. Legen Sie ein Mikro Fläschchen in einem Universal-Fläschchen.
5. Übertragen Sie die Probe in die Mikro Fläschchen und die Kappe des Universal Fläschchen. Dispense die Probe nach oben, um alle Blasen zu vermeiden einzuführen.
6. Lagerung bei 2-8 ° C für bis zu 1 Tag.
7. Legen Sie die Universal-Fläschchen (mit Mikrofläschchen, die Probenlösung enthält) in der Probeneinlassfach.

3. Herstellung von CE-System.

1. CE Systemreinigung.
   HINWEIS: Verhalten thist Verfahren mindestens einmal pro Woche, um elektrischen Strom Leckage aus Ansammlung von Staub und Schmutz abgeleitet zu vermeiden. Jedoch abhängig von der Anwendung (zB Verwendung eines BGE mit erhöhter Viskosität oder mit hoher Salzkonzentration, Proben mit erhöhter Viskosität) Elektroden und Öffnungshebel erfordern häufig gereinigt mehr zu Kreuzkontamination und Probenverschleppung zu vermeiden.
   1. Schalten Sie den Netzschalter des CE-Gerät aus und öffnen Sie die vordere Tür.
   2. Reinigen Sie die Oberfläche der Probe Abdeckung, Probenhaltesystem (Probe und Puffer Tabletts), Patronenabdeckung, Klemmleiste, Schnittstellenblock und Elektroden mit einem mit Wasser angefeuchteten Vlies wischen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten wischen und trocken vor dem Gebrauch.
   3. Spülen Sie die Öffnungshebel gründlich mit Wasser. Reinigen Sie die Oberfläche mit einem Vlies wischen. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten wischen und trocken vor der Installation.
   4. Reinigen Sie die beiden Enden des Glasfaserkabels vorsichtigly mit einem mit Wasser angefeuchteten Mikrofasertuch. Wiederholen Sie den Vorgang mit einem Ethanol angefeuchteten Tuch.
2. Kassetteneinheit.
   1. Nehmen Sie eine neue neutrale Kapillare (50 & mgr; m Innendurchmesser) aus der Verpackung.
   2. Band nach unten ein Ende der Kapillare Schutzschlauch an der Werkbank. Abrollen, begradigen und die Kapillare aus dem Schlauch ziehen.
   3. Kleben Sie ein Stück Klebeband oder Papier an der Werkbank und fügen Messmarken wie folgt: Länge zum Detektor (30 cm), Kapillar - Fenster (0,2 cm) und einer Länge zum Auslaufende (10 cm) (dh 40,2 cm Gesamtlänge, 30,0 cm effektive Länge).
   4. Richten Sie die Kapillare Fenster auf die 0,2 cm Messmarke im Referenzpapier. Befestigen Sie die Kapillare mit Band und markieren Sie die Kapillare endet 2 mm außerhalb der Messmarken.
   5. Schneiden Sie die Schutzkappe an der Kapillareinlass Ende (das Ende der am weitesten vom Fenster) in einer einzigen geraden Bewegung den Flush Rand des Abspaltungs Stein verwenden.
      1. Tauchen Sie die Kapillare Ende in einem verschlossenen Universal-Fläschchen mit Wasser gefüllt, um dauerhafte Schäden an der kapillaren Innenbeschichtung zu vermeiden. Wiederholen Sie jedes Mal, dieses Verfahren das kapillare Ende für mehr als 1 min der Umgebung ausgesetzt ist.
   6. Legen Sie die Kapillareinlass Ende in die Ausgangsseite der Patrone.
   7. Schieben und die Kapillare durch die Patrone nach Bedarf ziehen, bis die Kapillare Fenster in die Kassette Fenster zentriert ist.
   8. Legen Sie die Blende Stecker (100 & mgr; m × 200 & mgr; m) in das Kassettenfenster.
      HINWEIS: Bestätigen, dass weißes Licht durch das Fenster, wenn zu einer weißen Lichtquelle ausgesetzt wird. Wenn das Licht, das ein bräunliches Aussehen hat durchläuft, ggf. einstellen.
   9. Legen Sie die Kapillare in die vorgeformten Kühlmittelrohrleitung für insgesamt Kapillarlänge von 40,2 cm (mit vorinstallierter Schlauchmutter, Zwinge und O-Ring an beiden Enden in dieser Reihenfolge).
   10. Schieben Sie die Kapillare durch die coolant Schlauch wie nötig, bis die Kapillare an der anderen Seite des Schlauchs erscheint.
   11. Führen Sie das Ende des Kühlmittelrohrleitung in die Ausgangsseite der Patrone und ziehen Sie die Schlauchmutter.
   12. Legen Sie die Kapillareinlass Ende in die Einlassseite der Patrone.
   13. Hub und die Kapillare durch die Patrone nach Bedarf ziehen, bis die Kapillare an der Einlassseite der Kassette angezeigt wird.
   14. Führen Sie das Ende des Kühlmittelrohrleitung in die Einlassseite der Patrone und ziehen Sie die Schlauchmutter.
   15. Schneiden Sie die Schutzkappe an der Kapillarauslass Ende (das Ende nächsten aus dem Fenster) in einer einzigen geraden Bewegung den Flush Rand des Abspaltungs Stein verwenden.
   16. Legen Sie die Dichtung-Halteklammern über die Kapillare Enden und drücken Sie in die richtige Position zu schnappen. Sichtprüfung der Kapillare endet. Wenn sie nicht einmal sind, wiederholen Sie den Vorgang.
   17. Legen Sie die Kapillare Länge Vorlage auf dem Rand der Werkbank.
   18. Legen Sie die Patrone nach unten against die Kapillare Länge Schablone und richten Sie die Kapillare mit den Referenzlinien auf der Vorlage endet. Wenn die Kapillare Messmarken (siehe 3.2.4) nicht mit den Referenzlinien ausrichten, ggf. einstellen.
   19. Halten Sie die Kapillare gegen die kapillare Länge Schablone und schneiden beide Enden der Kapillare auf der Vorlage die flush Kante des Abspalten Stein 2 mm unterhalb der Referenzlinien verwendet wird.
   20. Sichtprüfung der Kapillare mit einem Vergrößerungsglas endet. Wenn Kapillarenden nicht glatt sind, polieren sie das weiche Gesicht des Abspaltungs Stein verwenden.
   21. Legen Sie die Öffnung O-Ring in die Öffnung Zündkerzenloch den O-Ring Einsatzwerkzeug verwendet wird.
   22. Installieren Sie mit einer Kappe bedeckt Universal gefüllt Fläschchen mit Wasser in das Kassettengehäuse und Platz Patrone in Fall sofort mit Kapillar-Enden in Ampullen eingesetzt. Für Kurz- und Langzeitlagerung halten bei 2-8 ° C.
3. Herstellung von Puffer Tabletts.
   1. Füllen Sie und legen Sie mit einer Kappe bedeckt universal Phiolen in dem Puffer Eintritts- und Austrittswannen (Abbildung 1). Wiederholen Sie Fläschchen Positionen in den Spuren 2, 3, 4 und 5 gemäß der Anzahl der zu analysierenden Proben, eine Spur für alle sechs Probeninjektionen platzieren.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Fläschchen-Kappen, um Frittstrom Auslaufen zu verhindern.

Abbildung 1: Lage und den Füllstand des Universalfläschchen in den Puffer Einlass und Auslass Tabletts. Füllstände: 1/1 = 1400 & mgr; l, 3/4 = 1300 & mgr; l und 1/2 = 1000 & mgr; l. Abkürzungen: W = Wasser, HCl = 0,1 M Salzsäure. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. CE Systemkomponenten Montage.
   1. Installieren Sie den UV-Detektor.
   2. Installieren Sie die Öffnungshebelindem sie in den Schnittstellenblock nach oben drücken.
   3. Installieren Sie das Glasfaserkabel. Legen Sie die entsprechende Ende mit der Klemmleiste und, während beide Enden halten, drehen im Uhrzeigersinn. Schließen Sie das andere Ende mit dem UV-Detektor.
      HINWEIS: Behandeln Sie das Glasfaserkabel mit Sorgfalt während dieses Verfahrens, da Biegen seiner Fraktur verursachen könnte.
   4. Platz Probe und Puffer Tabletts in den Probenhaltesystem und einrasten.
   5. Legen Sie die Kapillarpatrone in den Schnittstellenblock und, während Sie die Klemmleiste an beiden Enden, ziehen Sie die Knöpfe.

4. Instrument Methoden Set-up

1. Erstellen Sie die Anlage, Laufen und Shutdown-Instrument Methoden nach mit den folgenden Parametern und Tabelle 1: Spannung, max: 30,0 kV; Strom, max: 300,0 uA; Cartridge Temperatur: 20,0 ° C; Probenlagertemperatur: 10,0 ° C; UV-Detektor Anfangsbedingungen: Wellenlänge: 214 nm; Datenrate: 4 Hz; Filter: Normal; Peakbreite (Punkte): 16-25; Absorptions-Signal: Direct.
   HINWEIS: Datenerfassungsrate erhöht werden kann, bis zu 25 Hz, um die Abdeckung der schmalen Trennzonen zu verbessern.

Konditionierungsverfahren Zeitprogramm
Zeit (min)	Event	Wert	Dauer	Inlet Phiole	Outlet Phiole	Zusammenfassung	Bemerkungen
-	Spülen - Druck	2068 mbar	1,0 min	BI: C1	BO: C1	Vorwärts	HCl 0,1 M
-	Spülen - Druck	2068 mbar	2,0 min	BI: B1	BO: C1	Vorwärts	Wasser
-	Spülen - Druck	2068 mbar	10,0 min	BI: E1	BO: C1	Vorwärts	BGE
0.00	Separate - Spannung	15,0 KV	10,0 min	BI: D1	BO: D1	0,17 Min Rampe, normale Polarität	Getrennte
10.00	Spülen - Druck	2758 mbar	10,0 min	BI: E1	BO: C1	Vorwärts	BGE
20,01	Warte ab	-	0,0 min	BI: A1	BO: A1	-	Rinse-Tipps
Laufende Verfahren Zeitprogramm
Zeit (min)	Event	Wert	Dauer	Inlet Phiole	Outlet Phiole	Zusammenfassung	Bemerkungen
-	Spülen - Druck	2068 mbar	1,0 min	BI: C1	BO: C1	Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6	HCl 0,1 M
-	Spülen - Druck	2068 mbar	2,0 min	BI: B1	BO: C1	Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6	Wasser
-	Spülen - Druck	2068 mbar	4,0 min	BI: E1	BO: C1	Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6	BGE
-	Spritzen - Druck	34 mbar	20,0 sec	SI: A1	BO: B1	Außer Kraft setzen, nach vorne	Probeninjektion
-	Warte ab	-	0,4 min	BI: A1	BO: A1	In / Out Fläschchen inc 6	Wash-Tipps
0	Separate - Spannung	15,0 KV	30,0 min	BI: D1	BO: D1	0,17 Min Rampe, normale Polarität, In / Out Fläschchen inc 6	Probentrenn
0,5	Auto Zero	-	-	-	-	-	-
30,01	Stopp-Daten	-	-	-	-	-	-
30,02	Spülen - Druck	2068 mbar	2,0 min	BI: B1	BO: C1	Nach vorne, In / Out Fläschchen inc 6	Wasser
32,03	Warte ab	-	0,0 min	BI: A1	BO: A1	In / Out Fläschchen inc 6	Rinse-Tipps
32,04	Ende	-	-	-	-	-	Ende
Shutdown-Methode Zeitprogramm
Zeit (min)	Event	Wert	Dauer	Inlet Phiole	Outlet Phiole	Zusammenfassung	Bemerkungen
-	Spülen - Druck	2068 mbar	1,0 min	BI: E6	BO: E6	Vorwärts	HCl 0,1 M
-	Spülen - Druck	2068 mbar	6,0 min	BI: F6	BO: F6	Vorwärts	Wasser
-	Lampe - Aus	-	-	-	-	-	-
-	Warte ab	-	0,0 min	BI: A1	BO: A1	-	Rinse-Tipps

Tabelle 1: Konditionierung, Laufen und Shutdown - Zeit - Programme.

5. Datenerfassung und -verarbeitung

1. Programmieren Sie die Probe eingestellt.
   1. Programmieren Sie die Kapillare für die Konditionierung der Konditionierung Instrument Methode. Wenn die Kapillare zum ersten Mal verwendet wird, Programm vier Wiederholungen; programmieren sonst nur zwei Wiederholungen des Konditionierungsmethode.
   2. Programm, um die Proben werden analysiert, um die ablaufenden Instrumenten-Methode.
   3. Programmieren Sie die Kapillare zur Speicherung der Shutdown Instrument Methode und wiederholen Sie den in Abschnitt 3.2.22 Verfahren.
2. Führen Sie das Experiment.
3. Exportieren Sie die Elektropherogramme.
4. Berechnen Sie die Migrationszeit und der Anteil an Grund-, Haupt-and sauren Isoformen vertikalen Falllinie Integration des Elektropherogramm-Profil.

Ergebnisse

Figur 2 zeigt den typischen elektrischen Stromprofil eines 200 mM EACA, 30 mM Lithiumacetat, pH 4,8 BGE mit anti-TNF & agr; mAb Probe mit Tris - Puffer (50 mM, pH 8,0). Wie beobachtet werden kann, ist der Strom in der gesamten Analyse stabil und zwischen Werten von 30 bis 35 & mgr; A oszillieren kann. Abbildung 3 zeigt die CZE Elektropherogramm einer Blindprobe , wo der detektierte Peak, der dem Histamin interner Standard entspricht. Es ist für ...

Diskussion

In diesem Tutorial zeigen wir die Bedeutung der richtigen Praktiken bei der Durchführung von CZE von mAb analysiert, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, um erfolgreich zu sein. Wenn jedoch CZE auf einer Routinebasis verwendet wird, Probleme entstehen zwangsläufig ^12.

Für die besten Ergebnisse ist es wichtig, die Hinweise zu folgen, die das ganze Protokoll aufgenommen wurden, da sie den Analytiker schwierige Schritte zu überwinden und zu beheben helfen. Eine wichtige Überle...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glacial acetic acid	Tecsiquim	AT0035-7
ACS grade hydrochloric acid	J.T. Baker	9535-05
Histamine dihydrochloride	Fluka	53300
(Hydroxypropyl) methyl cellulose	Fluka	09963
Lithium acetate	Sigma-Aldrich	517992
6-Aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A2504
eCAP Tris Buffer, 50.0 mM,  pH 8	Beckman Coulter	477427
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System	Beckman Coulter	A66528
eCAP Neutral capillary	Beckman Coulter	477441
Vial, Micro, 200 µl	Beckman Coulter	144709
Universal Vial Caps	Beckman Coulter	A62250
Universal Vials	Beckman Coulter	A62251
Cable, Optics, UV/Vis	Beckman Coulter	144093
UV/Vis Detector Module	Beckman Coulter	144733
Cartridge Assembly Kit, Blank	Beckman Coulter	144738