الإنتاج والإدارة العلاجية الجذعية الوسيطة / اللحمية الخليوي (MSC) الأجسام الشبه الكروية معبى في الثقافات 3-D تحت ظروف كره خالية

Summary

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Abstract

الجذعية الوسيطة / الخلايا اللحمية (اللجان الدائمة) على وعود كبيرة في الهندسة الحيوية والطب التجديدي. اللجان الدائمة يمكن عزلها عن أنسجة البالغين متعددة عبر الالتزام القوي للالبلاستيك زراعة الأنسجة ومن ثم مزيد من التوسع في المختبر، والأكثر شيوعا باستخدام مصل بقري جنيني (FBS). منذ FBS يمكن أن يسبب اللجان الدائمة لتصبح مناعة، وجودها في الثقافات MSC يحد كلا التطبيقات السريرية والتجريبية من الخلايا. لذلك، دراسات توظيف تعريف كيميائيا (XF) وسائل الاعلام خالية من XENO للثقافات MSC قيمة للغاية. وقد أرجع العديد من الآثار المفيدة للاللجان الدائمة لقدرتها على تنظيم الالتهاب والمناعة، وذلك أساسا من خلال إفراز العوامل المناعية مثل نخر الورم حفز عامل الجينات 6 (TSG6) والبروستاغلاندين E2 (PGE2). ومع ذلك، اللجان الدائمة تتطلب تفعيل لإنتاج هذه العوامل ومنذ أثر من اللجان الدائمة في كثير من الأحيان عابرة، برز اهتمام كبير لاكتشاف طرق من قبل تنشيط خلايا PRIOr لاستخدامها، وبالتالي القضاء على الوقت الضائع لالتنشيط في الجسم الحي. هنا نقدم بروتوكولات لتفعيل كفاءة أو اللجان الدائمة الرئيسية في ثلاثي الأبعاد (3D) الثقافات في ظل ظروف XF محددة كيميائيا وإدارة هذه اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا في الجسم الحي. على وجه التحديد، وصفنا أولا طرق لتوليد MSC كروية الأنسجة الصغيرة أو "الكروية" في شنقا قطرات باستخدام XF المتوسطة وشرح كيفية المجالات والمتوسطة مكيفة (CM) يمكن حصاده لمختلف التطبيقات. ثانيا، نحن تصف شاشات التعبير الجيني في المختبر المقايسات الفنية لتقييم بسرعة على مستوى تفعيل لجنة السلامة البحرية في الكروية، مع التركيز على إمكانات المضادة للالتهابات ومضاد للسرطان من خلايا. ثالثا، نحن تصف طريقة رواية لحقن الكروية MSC سليمة في التجويف البريتوني الماوس في الجسم الحي اختبار فعالية. وعموما، فإن البروتوكولات التغلب على هذه الوثيقة التحديات الكبرى للحصول على اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا تحت تعريف كيميائيا يخدع XFditions وتوفر نظاما مرنا لإدارة الكروية MSC للعلاج.

Introduction

وقد أظهرت الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة (اللجان الدائمة) إمكانات كبيرة لمختلف النهج الطب التجديدي. تم عزل اللجان الدائمة في البداية باعتبارها عنصرا انسجة نخاع العظام ولكن تم الحصول عليها منذ من العديد من أنسجة البالغين الأخرى، بما في ذلك الأنسجة الدهنية ^{1، 2، 3.} ومن المثير للاهتمام، تحتضن طريقة العزلة الرئيسي خاصية رائعة من اللجان الدائمة التمسك بإحكام على البلاستيك زراعة الأنسجة في وجود مصل بقري جنيني (FBS). بينما تسمح هذه التقنية العزلة التقليدية التوسع السهل والسريع من اللجان الدائمة في ثنائية الأبعاد (2D) ثقافة، بل هو أيضا الاصطناعي للغاية ويتجاهل أهمية البيئة المحلية ثلاثي الأبعاد (3D) مما أدى إلى خسارة محتملة من الخصائص الخلوية مهمة ^{4، 5 (6).} ولذلك، فإن دراسة اللجان الدائمة في الثقافات 3D، التيأكثر الفسيولوجية من الثقافات 2D التقليدية، ظهرت في البحث عن خصائص MSC "فقدت / تقلص". وعلاوة على ذلك، ارتفع اهتماما كبيرا لتحديد الشروط (XF) خالية من XENO محددة كيميائيا للثقافة MSC والتنشيط، وبالتالي تجعل الخلايا أكثر تقبلا للتطبيقات السريرية.

وقد نشرت العديد من الدراسات يدل على ثقافة 3D من اللجان الدائمة في كل من المواد الحيوية وكما الركام كروية أو الكروية. وقد صممت اللجان الدائمة في المواد الحيوية في البداية لنهج هندسة الأنسجة لاستبدال الأنسجة التالفة مع السقالات خلية المصنفة، في حين شوهدت الثقافات كروي من اللجان الدائمة وسيلة لفهم السلوك MSC في الجسم الحي بعد تناوله من الخلايا للعلاج في التجارب ما قبل السريرية أو الإكلينيكية ^{4 و 5 و 7.} ومن المثير للاهتمام، اللجان الدائمة شكل الكروية بشكل عفوي عندما التمسك البلاستيك زراعة الأنسجة غير مسموح^{8، 9، 10.} تقليديا، تم تسهيل تجميع الخلية عن طريق أساليب قارورة الدوار أو تقنيات تراكب السائلة وطرق استخدامها في البداية في بيولوجيا السرطان في جهود محاولة لتقليد المكروية الورم. وفي الآونة الأخيرة، ظهرت طرق إضافية التي تثبت تجميع الخلايا في أطباق ثقافة ما قبل المغلفة بمواد كيميائية محددة لمنع الخلية الى البلاستيك التصاق ^{4، 5، 6.} واحد من أبسط وأكثر اقتصادا وسائل لتوليد الأجسام الشبه الكروية MSC هو ثقافة لهم في شنقا قطرات، وهي تقنية تستخدم غالبا للإنتاج الهيئات مضغي من الخلايا الجذعية الجنينية. مع شنقا تقنية ثقافة الإفلات، يتم منع التقيد الخلية إلى البلاستيك زراعة الأنسجة من خلال تعليق الخلايا في قطرة من المتوسط ​​على الجانب السفلي من غطاء الأنسجة صحن الثقافة والسماح خطورة لتسهيل aggreg خليةأوجه في قمة الهبوط. حجم كروي يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير تركيز الخلية أو حجم الانخفاض، مما يجعل انخفاض الثقافات شنقا سهلة جدا السيطرة.

أظهرت الدراسات المبكرة على الثقافة 3D من اللجان الدائمة اختلافات جذرية في خصائص الخلايا في 3D مقارنة مع نظرائهم 2D ^{6، 8، 9.} وفي الوقت نفسه، أظهرت التقارير أن التأثيرات المفيدة للاللجان الدائمة في الجسم الحي تعتمد على قدرتها على أن تصبح تفعيلها من خلال الاشارات الصغيرة البيئية، وردا على ذلك، لإنتاج المضادة للالتهابات والمناعية عوامل ^11. ومن المثير للاهتمام، تم إنتاج العديد من هذه العوامل مثل البروستاغلاندين E2 (PGE2)، نخر الورم حفز عامل الجينات 6 (TSG6)، وعامل النمو الكبدية (HGF) بكميات أكبر بكثير من الكروية MSC من اللجان الدائمة 2D التقليدية مما يمهد الطريق ل فكرة عناستخدام الثقافات 3D لتنشيط الخلايا ^{8 و 12 و 13.} وعلاوة على ذلك، يبدو تفعيل الجين في الثقافات 3D لألخص الآليات، على الأقل جزئيا، من تنشيط الخلايا بعد حقن الفئران إلى ^12. من خلال تفعيل اللجان الدائمة السابقة لاستخدامها في التجارب، والآثار المترتبة على خلايا يمكن أن تكون طويلة وأكثر بروزا في كثير من الأحيان يتم تأخير تأثير MSC التقليدي في الجسم الحي وعابرة، ويمكن وصفها بأنها "الكر والفر". خلال السنوات العديدة الماضية، وقد أثبتت الدراسات وظيفية هامة باستخدام الكروية MSC يتمكنوا من قمع الاستجابات الالتهابية وتعدل مناعة في الجسم الحي من خلال التأثير على الخلايا المستجيب مثل الضامة، والخلايا الجذعية، العدلات، والخلايا T جعل الكروية وشكل جذاب من اللجان الدائمة تستعد ^{2 3.} وبالإضافة إلى ذلك، إنتاج جزيئات مضادة للسرطان، مثل كثافة العملياتerleukin 24 (IL-24)، ونخر الورم المتعلقة عامل يحفز الخلايا يجند (تريل)، وزاد في الثقافات 3D من اللجان الدائمة بالنسبة للأحادي الطبقة اللجان الدائمة، وهي الظاهرة التي يمكن استغلالها لعلاجات السرطان تستهدف ^{8 و 10 و 14.}

وبما أن الثقافة لجنة السلامة البحرية التقليدية تتطلب ليس فقط استخدام البلاستيك زراعة الأنسجة ولكن أيضا FBS، عقبة أخرى لجعل الكروية MSC أكثر قابلية للاستخدام السريري كان لا بد من التغلب عليها. لمعالجة هذه العقبة، وأظهرت مؤخرا تشكيل الكروية MSC في ظل ظروف محددة XF محددة كيميائيا وأثبت أن الكروية MSC مما أدى تم تفعيلها لإنتاج نفس الجزيئات المضادة للالتهابات ومضادة للسرطان حيث الكروية ولدت في ظروف مع FBS ^14. هنا، يتم عرض هذه النتائج في عدة بروتوكولات وإجراءات تفصيلية التي تبرهن على جيل من اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا في الثقافات 3D باستخدام XFوسائل الإعلام. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض البروتوكولات التي تصف طرق فعالة لتقييم مستويات تفعيل اللجان الدائمة في ما يخص المضادة للالتهابات، المناعية والمضادة للسرطان آثارها، جنبا إلى جنب مع وسيلة عملية لتقديم الكروية سليمة في الفئران.

Protocol

1. عزل MSC والتوسع

1. الحصول على اللجان الدائمة مرور وقت مبكر من مركز إعداد وتوزيع الخلايا الجذعية البالغة ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) ¹⁵ قارورة كما المجمدة. بدلا من ذلك، عزل اللجان الدائمة من aspirates نخاع العظم بعد بروتوكول روتيني ¹⁴ وتخزين قوارير كما المجمدة.
2. إعداد مستنبت الكامل (CCM)، وهو الحد الأدنى ألفا المتوسط ​​الأساسية (αMEM) تستكمل مع 15-20٪ قسط تحديد FBS، 2 مم L-الجلوتامين، و1X البنسلين ستربتومايسين. تعقيم المتوسطة عن طريق الترشيح.
3. ضع 30 مل من CCM في طبق خلية ثقافة 150 ملم واحتضان الطبق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO _2.
4. احتضان القارورة المجمدة تحتوي على ما يقرب من 10 ⁶ اللجان الدائمة لمدة 2 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
5. نقل محتويات القارورة إلى الطبق الثقافة باستخدام الماصة 5 مل المصلية ويغسل عدة مرات قنينة مع 1-2 مل CCM من طبق لالتقاط الخلايا المتبقية. ضع بين عشية وضحاها الطبق في حاضنة مناسبة.
6. تغسل بعناية الثقافة مرتين مع درجة حرارة الغرفة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وفصل اللجان الدائمة مع 3 مل من / ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) حل 0.25٪ التربسين قبل تحسنت. مفرزة عادة ما يستغرق حوالي 3-4 دقيقة في الحاضنة.
7. تحييد التربسين في صحن مع 6 مل CCM قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، ونقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 50 مل. تتحد مع يغسل من برنامج تلفزيوني لتعظيم العائد الخلية.
8. الطرد المركزي الخلايا (450 x ج) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف.
9. إعادة تعليق الخلايا في كمية صغيرة من CCM وعد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات والأزرق التريبان.
10. البذور عدد مناسب من الأطباق 150 ملم في 100 خلية / سم ² في 30 مل من CCM الدافئ واحتضان الثقافات حتى ما يقرب من 70-80٪ متموجة، عادة 7 أيام مع متوسط ​​يتغير كل 2-3 أيام وقبل 24-48 ساعة لحصاد.
11. حصاد الخلايا على النحو الوارد أعلاه مع التربسين / EDTA والجمع بين جميع خلايا في أنبوب مخروطي الشكل واحد مع وسيلة مناسبة. الطرد المركزي مرة أخرى وإعادة تعليق الخلايا في كمية صغيرة من نفس المتوسطة لعدد الخلايا. استخدام CCM القياسية (التي تحتوي على FBS) أو المختلفة المتاحة تجاريا XF التركيبات وسائل الإعلام، ويشار هنا إلى أنه XF المتوسطة 1 (XFM-1) وXF المتوسطة 2 (XFM-2)، مع وبدون ألبومين المصل البشري (HSA، 13 ملغ / مل) مكملات.

2. إعداد المنشط MSC الأجسام الشبه الكروية في 3-D شنقا الثقافات قطرة تحت ظروف XF

1. لتوليد الأجسام الشبه الكروية من حوالي 25،000 الخلايا، يخفف من اللجان الدائمة التي تحصد في CCM، XFM-1، XFM-1 + HSA (13 ملغ / مل)، XFM-2، أو XFM-2 + HSA (13 ملغ / مل) في 714 الخلايا / ميكرولتر.
2. ماصة 35 ميكرولتر / قطرات من الخلايا علىالجانب السفلي من 150 ملم ثقافة المقلوب طبق غطاء. قطرات متعددة يمكن pipetted بسهولة باستخدام ماصة الأقنية.
   ملاحظة: إذا رغبت الكروية أكبر أو أصغر، تغيير تركيز الخلية أو حجم الانخفاض (25-45 ميكرولتر) بشكل مناسب.
3. نقل 20 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني في قاعدة الطبق وفي حركة مستمرة وثابتة واحدة الوجه الغطاء، الذي يحتوي على قطرات، حتى أن قمم انخفاض تواجه الهبوط. وضع غطاء بعناية على قاعدة الطبق الثقافة.
4. نقل الطبق في الحاضنة لمدة 3 أيام من دون إزعاج ذلك للسماح التجمع المجال المناسب.
5. بعد 72 ساعة، يبدأ الحصاد كروي عن طريق إزالة الغطاء بعناية وعكس ذلك بحيث قطرات، مرة أخرى، تواجه التصاعدي.
6. زاوية الغطاء لحوالي 10-20 درجة، ودفع قطرات، التي تحتوي على الكروية، إلى حافة صفيحة باستخدام رافع الخلية.
7. نقل المجالات والمتوسطة في أنبوب مخروطي 15 مل مع أنبوب 1000 ميكرولترتتي. استخدام درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني وماصة مع نفس الطرف لغسل لوحة وضمان استرداد الحد الأقصى من الكروية.
8. في الوقت الحقيقي المقايسات PCR (بروتوكول 3)، الطرد المركزي تعليق المجال في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف. غسل الكروية مع برنامج تلفزيوني وكرر كل من الطرد المركزي والطموح الخطوات. للتسليم في الحيوانات (بروتوكول 8)، والسماح المجالات ليستقر في قاع الأنبوب (~ 3-4 دقيقة) دون الطرد المركزي.

3. في الوقت الحقيقي PCR من علامات المضادة للالتهابات ومضاد للسرطان

1. استخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي مع الأعمدة الخالط ومجموعة الدناز ريبونوكلياز خالية لعزل الحمض النووي الريبي خالية من الحمض النووي الكلي من اللجان الدائمة أحادي الطبقة (بروتوكول 1) والكروية MSC (بروتوكول 2) التي تم غسلها مع برنامج تلفزيوني وطرد.
2. ليز لا يقل عن 100،000 اللجان الدائمة أحادي الطبقة و 20 الكروية من كل شرط في منفصلة أنابيب مخروطية 15 مل مع العازلة RLT تحتوي على β-المركابتويثانول (1: 100).
3. عبرفر ولست] مختلطة تماما في أنابيب 1.5 مل ريبونوكلياز حرة ووضع في الثلاجة (-80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 3 ساعة للمساعدة في تحلل كروي.
4. ذوبان الجليد في الخلية لست] على الجليد، دوامة لفترة وجيزة، واتبع تعليمات الشركة المصنعة لعزل الحمض النووي الريبي باستخدام المتاحة تجاريا الثدييات مجموع عدة RNA العزلة.
5. قياس وتقييم جودة من الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
6. استخدام عالية السعة كدنا] النسخ العكسي كيت أو ما يعادلها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لتوليد كدنا] في الوقت الحقيقي PCR.
7. وضع عينات كدنا]، تصميم تجاريا في الوقت الحقيقي الاشعال PCR / المسابير (فحوصات الجينات)، وPCR ميكس ماستر على الجليد. استخدام بادئات / تحقيقات لGAPDH (السيطرة)، PTGS2 (COX-2، المضادة للالتهابات)، TNFAIP6 (TSG6، المضادة للالتهابات)، TRAIL (المضادة للسرطان)، و IL-24 (المضادة للسرطان).
8. إعداد الوقت الحقيقي تفاعلات PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة للفحوصات الجينات وUnive السريعrsal ميكس ماستر.
9. اتبع الإرشادات لفي الوقت الحقيقي PCR أداة لتوليد الوثائق تجربة وأداء التشغيل.
10. تحليل البيانات باستخدام طريقة ΔΔC _T عن طريق حساب التغيرات النسبية (كمية النسبية، RQ) في التعبير الجيني باستخدام GAPDH، والتحكم وأحادي الطبقة من اللجان الدائمة المحلية كأساس ^{8 و 14.}

4. جمع CM لفحوصات من المناعية ومكافحة السرطان المحتملة

1. حصاد الكروية وسم كما هو موضح أعلاه في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، وذلك باستخدام رافع الخلية وماصة، ومع ذلك، لا يغسل الأغطية الطبق مع برنامج تلفزيوني حيث سيؤدي ذلك إلى إضعاف سم.
2. أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع بعناية طاف خالية من الخلايا مع ماصة، ونقل طاف في أنابيب 1.5 مل.
3. أجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع بعناية البنودCM arified مع ماصة، ونقل سم في الجديدة 1.5 مل أنابيب لتخزين في الثلاجة (-80 درجة مئوية). إعداد aliquots من مجلس الوزراء قبل التجميد عند استخدامه لفحوصات متعددة.
   ملاحظة: قبل إجراء المقايسات المصب، PGE2 تركيز، وهو مؤشر جيد للإمكانات المضادة للالتهابات من سم، ويمكن تحديد باستخدام طقم ELISA التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تركيز TSG6 يمكن تحديد باستخدام بروتوكول نشر ^14.

5. بلعم الفحص لتقييم إمكانات المضادة للالتهابات من MSC-CM

1. إعداد المتوسطة بلعم، والذي يتألف من المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر (DMEM) التي تحتوي على L-ألانيل-L-الجلوتامين وتستكمل مع 10٪ قسط تحديد FBS و1X البنسلين ستربتومايسين. تصفية تعقيم المتوسطة.
2. الحصول على قارورة المجمدة الضامة الماوس ما يقرب من 10 ⁶ J774 واحتضان القارورة لمدة 2 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
نقل محتويات القارورة في 15 مل أنبوب مخروطي الشكل، إضافة 9 مل من المتوسط ​​بلعم، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 200-300 x ج وفي درجة حرارة الغرفة.
3. نضح طاف، تعليق الضامة في 1 مل من المتوسط ​​بلعم، ونقل الضامة إلى 150 مم طبق بتري تحتوي على 30 مل من المتوسط ​​بلعم.
4. تغيير المتوسطة كل أيام 2 و احتضان الخلايا في الحاضنة حتى ما يقرب من 70-80٪ متموجة.
   ملاحظة: الضامة لا تلتزم بإحكام على طبق بتري، وبالتالي ينبغي الحرص على عدم فقدان الخلايا مع تغيير المتوسطة.
5. حصاد الضامة عن طريق الرش المتوسط ​​بلعم على الخلايا مع ماصة. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 200-300 x ج ودرجة حرارة الغرفة.
6. نضح طاف وتعليق الخلايا في كمية صغيرة من متوسطة بلعم لعدد الخلايا مع عدادة الكريات. ضبط تركيز إلى 200000 خلية / مل مع البلاعم ليdium.
7. لبدء انشاء لفحص بلعم، إضافة 480 ميكرولتر من المتوسطة بلعم في آبار من لوحة ال 12 أيضا.
8. إضافة 20 ميكرولتر من المتوسطة بلعم في الآبار غير حفز تحكم و 20 ميكرولتر من غير مكيفة أو مكيفة MSC-المتوسطة، أعدت أعلاه، في الآبار التجريبية. خلط المتوسطة في الآبار عن طريق النقر على لوحة.
9. نقل 500 ميكرولتر من تعليق خلية بلعم إلى الآبار غير حفز السيطرة البلاعم.
10. تحفيز الضامة المتبقية مع إضافة 1: 500-1: 1000 من 0.1 ملغ / مل lipopolysaccharide في (LPS) واحتضان 5-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
11. نقل 500 ميكرولتر من الضامة حفز في الآبار مع المتوسطة غير مكيفة أو مكيفة لجنة السلامة البحرية. مزيج من الآبار التي تعصف بشكل مطرد لوحة عدة مرات.
12. نقل لوحة لحاضنة لل16-18 ساعة.
13. حصاد المتوسطة مكيفة البلاعم وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
14. تحويلطاف في أنابيب جديدة وفحص لعامل نخر الورم ألفا (TNF-α) و (IL-10) محتوى انترلوكين 10 من قبل مجموعات ELISA التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

6. خلية طحالية الفحص لتقييم إمكانات المناعية من الجسم الشبه الكروي-CM

1. إعداد المتوسطة خلية طحالية كامل، والذي يتكون من معهد Rosewell من الحديقة التذكارية (RPMI) -1640 المتوسطة تستكمل مع المعطل للحرارة بنسبة 10٪ FBS، 1X البنسلين ستربتومايسين، و 2 المركابتويثانول. تصفية تعقيم المتوسطة.
2. الطحال الحصاد من الموت الرحيم للذكور الفئران BALB / ج من خلال شق أعد على الجانب الأيسر من البطن فوق الطحال، حوالي منتصف الطريق بين الجبهة وهند الساقين ^14. نقل الطحال لمصفاة الخلية 70 ميكرون لعزل splenocytes ^14.
3. عزل splenocytes / الخلايا الليمفاوية عن طريق دفع الطحال من خلال مصفاة 70 ميكرومتر إلى العقيمة النقيب طبق بتريز المطاط لينة / نهاية بلاستيكية من المكبس من 2-3 مل حقنة ^14. استخدام حركة دائرية طحن لفصل الطحال.
4. غسل مصفاة الخلية عدة مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة ونقل الخلايا من طبق بتري إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. ملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني الباردة وأجهزة الطرد المركزي (500 x ج) في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
5. نضح طاف ومسح الخلايا من كريات الدم الحمراء من قبل الحضانة مع 5-10 مل من محلول أحمر خلايا الدم تحلل (في الطحال) لمدة 5-10 دقائق.
6. وقف تحلل بإضافة برنامج تلفزيوني الباردة إلى الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5-10 دقيقة في 500 x ج وفي 4 درجات مئوية.
7. تعليق الخلايا المعزولة في وسط خلية طحالية الكامل، تصفية من خلال مصفاة 40 ميكرون، وعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. إضافة المتوسطة خلية طحالية إلى تعليق الخلية لتحقيق تركيز الخلية النهائي من 10 ⁶ خلية / مل
   ملاحظة: هذه التقنية عادة ينتج حوالي 3 × 10 ⁷ splenocytes في الطحال الماوس.
8. تحفيز العدد المناسب من splenocytes مع 2 ميكروغرام / مل المضادة للأجسام المضادة CD3e لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: كمية من splenocytes المطلوبة يعتمد على عدد من الشروط التجريبية كما هو محدد من قبل المحقق (راجع الخطوة 6.9). لكل عينة تجريبية / جيد، يطلب 10 ⁶ splenocytes.
9. نقل 10 ⁶ splenocytes (حفز أو غير حفز) في الآبار من 12 لوحة جيدا وإضافة غير مكيفة (الضوابط) أو MSC-CM في الآبار في التخفيف النهائي من 1: 10-1: 20.
10. حصاد CM خلية طحالية بعد 24 ساعة وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
11. نقل طاف في أنابيب جديدة وفحص للانترفيرون غاما (IFN-γ) المحتوى من قبل عدة ELISA التجارية باتباع إرشادات الشركة المصنعة.

7. سرطان البروستاتا الفحص لتقييم إمكانات المضادة للسرطان من الجسم الشبه الكروي-CM

1. إعداد الكامل المتوسطة النمو RPMI التي متوسطة RPMI-1640 تستكمل مع 10FBS٪، 1X البنسلين ستربتومايسين.
2. الحصول على قارورة المجمدة من خلايا سرطان البروستاتا LNCaP واحتضان القارورة لمدة 2 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
3. نقل محتويات القارورة في طبق ثقافة تحتوي على 30 مل من متوسط ​​النمو RPMI كاملة باستخدام pipettor الآلية و 5 مل الماصة المصلية. يغسل عدة مرات قنينة مع المتوسط ​​من الطبق ووضع الطبق في الحاضنة.
4. قبل الخلايا تصل confluency، وغسل الثقافة مرتين مع درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني وفصل الخلايا LNCaP مع 3 مل من قبل تحسنت 0.25٪ حل التربسين / EDTA.
5. تحييد التربسين في صحن مع متوسط ​​نمو RPMI كاملة ونقل الخلايا جنبا إلى جنب مع يغسل في أنبوب مخروطي 50 مل.
6. الطرد المركزي الخلايا في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف.
7. إعادة تعليق الخلايا في حجم صغير من متوسط ​​النمو RPMI الكامل والاعتماد على الخلايا السرطانية باستخدام عدادة الكريات.
نقل خلايا LNCaP في صحن 96-جيدا في 5000 خلية / جيدا في 120 ميكرولتر من اكتمال النمو المتوسطة RPMI تحتوي على 25٪ من غير مكيفة أو كروي سم. احتضان في الحاضنة لمدة 72 ساعة.
8. لإجراء فحص نمو الخلايا باستخدام طقم فحص تكاثر الخلايا، ونضح المتوسط ​​من الآبار ونقل لوحة في الثلاجة (-80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 3 ساعة.
   1. ذوبان الجليد لوحة وليز الخلايا في كل بئر بإضافة 100 ميكرولتر من كاشف خلية تحلل تحتوي على 180 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، و 0.2 ملغ / مل ريبونوكلياز أ.
   2. لمنحنى القياسية، مبالغ ليز الخلايا LNCaP كما هو موضح أعلاه.
   3. بعد 1 ساعة، إضافة 100 ميكرولتر من 1X العازلة خلية تحلل تحتوي على 1: 100 التخفيف من انتشار الخلايا الفحص الكاشف وقياس مضان في كل بئر لتحديد كمية الخلايا.

8. التسليم داخل الصفاق من الأجسام الشبه الكروية سليمة

1. إعداد اللجان الدائمة كروي على النحو المبين أعلاه (بروتوكول 2) و resuspend رانه الكرات في محلول الملح المعقم هانك المتوازن (HBSS) تستكمل مع 0.2-0.5٪ هائل سعيد أنعم للحفاظ على ظروف XF. HSA في حل يساعد على منع التصاق المجال إلى البلاستيك خلال الحقن.
2. نقل 40-120 الكروية في أنابيب مخروطية 15 مل وغسل الخلايا عن طريق إضافة 6 مل HBSS / هائل سعيد أنعم للأنابيب. السماح 3-4 دقيقة على مناطق النزول. إعداد أنبوب مخروطي مستقلة عن الكروية لكل حيوان. أيضا، إعداد أنابيب إضافية من الكروية لفحوصات تحديد الاحتفاظ كروي (انظر 8.18 أدناه)، وإنتاج العوامل العلاجية بعد نقل (انظر 8.19 أدناه) إذا رغبت في ذلك.
3. نضح طاف، تراكب الكروية مع 100-200 ميكرولتر من العقيمة HBSS تستكمل مع 0.2-0.5٪ هائل سعيد أنعم، ووضع أنابيب على الجليد.
4. تخدير لفترة وجيزة الحيوانات مع 2٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ حتى اختفاء منعكس قرصة أخمص القدمين لحوالي 2 دقيقة في غرفة الاستقراء.
5. وضع الحيوان داخل BSL-2 لمجلس الوزراء، اسبي الظهريةCT أسفل (الجانب البطني تواجه متابعة)، مع استمرار تدفق 1.5٪ خليط الأيزوفلورين / الأكسجين عبر مخروط الأنف.
6. تنظيف أسفل البطن الماوس مع مطهر مثل الكحول 70٪.
7. إزالة الغطاء من 20 G عن طريق الوريد (IV) القسطرة وإجراء حقن داخل الصفاق مع الجمعية القسطرة خنجر. استخدم يدا واحدة لعقد الجلد الماوس وآخر لأداء الحقن. تحديد نقطة الحقن تقريبا في منتصف خط الاصطناعي الذي يربط منطقة الركبة استعرضوا المشتركة والتناسلية مع طرف الإبرة تشير نحو خط الوسط.
   ملاحظة: التجمع القسطرة خنجر لديه مقاومة أعلى من الإبرة العادية، لذلك يهمني يجب أن يؤخذ لا لحقن إبرة عميق جدا في البطن، مما قد يؤدي إلى وقوع إصابات في الأعضاء الداخلية. يمكن أن يرى اختراق الجلد والعضلات ثم / الغشاء البريتوني خلال وضع القسطرة.
8. إزالة بلطف خنجر المعادن / إبرة من الجمعية القسطرة خنجر. إيكولوجياك على خنجر للدم والبول والبراز وتخلص منه. الدم على الإبرة يشير ثقب عضو داخلي (ق).
9. عقد القسطرة البلاستيكية في وضع مستقيم أثناء الحقن للسماح تدفق السوائل.
10. تأكيد التنسيب المناسب للقسطرة بلاستيكية عن طريق حقن ما يقرب من 100 ميكرولتر من العقيمة HBSS / هائل سعيد أنعم عن طريق القسطرة باستخدام ماصة مع طرف 100-200 ميكرولتر. وضع نهاية للطرف ماصة داخل محول القسطرة حقنة تشكيل ختم مشددة. ببطء حقن السوائل داخل التجويف البريتوني.
    ملاحظة: سيتم السوائل في القسطرة وضعه بشكل صحيح تتدفق بحرية داخل التجويف البريتوني مع تعديل طفيف فقط من القسطرة. وضع غير لائق من القسطرة (تحت الجلد أو داخل الأمعاء، أو إذا كان رأس الإبرة بجروح أجهزة البريتوني مثل الكلى) ستزيد المقاومة والحد من التدفق. ووضع تحت الجلد يؤدي إلى تشكيل "فقاعة" واضحة تحت الجلد.
11. جمع رانه ماجستير الكروية، الذي أعد 100-200 ميكرولتر من HBSS / هائل سعيد أنعم (الخطوة 8.3)، وذلك باستخدام 200 ميكرولتر ماصة، ونقل وحدة التخزين بالكامل من المجالات (40-120 المجالات) في التجويف البريتوني عن طريق القسطرة كما هو موضح أعلاه.
12. غسل الأنبوب الذي يحتوي المجالات مع 100 ميكرولتر من HBSS / هائل سعيد أنعم باستخدام نفس معلومات سرية على النحو الوارد أعلاه لجمع أي الكروية المتبقية وضخها في التجويف البريتوني.
13. (اختياري) حقن في 100 ميكرولتر إضافية من HBSS / هائل سعيد أنعم في التجويف البريتوني لغسل القسطرة.
14. وضع الشاش غارقة في مطهر خلال القسطرة وإزالة ببطء القسطرة من التجويف البريتوني وتخلص منه.
15. تدليك بلطف التجويف البريتوني مع الأصابع لضمان التوزيع العادل للالكروية.
16. السماح للحيوان استرداد تحت إشراف دقيق ومشاهدة لنزيف من موقع الحقن.
17. تفقد القسطرة وأنبوب 15 مل لأي الكروية المتبقية. فمن الطبيعي أن مراعاة بعض المجالات فيقسطرة / أنبوب.
    ملاحظة: هذه التقنية وصفها لجنة السلامة البحرية تسليم كروي يمكن اعتمادها للاستخدام في الحيوانات العادية أو في مجموعة متنوعة من النماذج الاصابة. وقد استخدمت هذه التقنية بنجاح لحقن الكروية في الماوس إصابة القرنية ونماذج endotoxemia، وكذلك في يسببها زيموزان نموذج التهاب الصفاق ^8.
18. لتحديد عدد الكروية المدورة (اختياري)، واستخدام المعتمدة على الحمض النووي عدد الخلايا الكمي طقم / كاشف. عقد القسطرة المستخدمة عبر أنبوب 15 مل والاستغناء بقوة HBSS / هائل سعيد أنعم عن طريق القسطرة لإجبار أي المجالات المتبقية مرة أخرى في أنبوب 15 مل.
    1. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ونضح طاف. نقل الأنبوب الذي يحتوي على بيليه كروي في الثلاجة (-80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 3 ساعة.
    2. ذوبان الجليد أنبوب وليز المجالات وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من كاشف خلية تحلل تحتوي على 180 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، و 0.2 ملغ / مل ريبونوكلياز أ.
    3. لعنصر تحكم، الصحائفإز وليز كمية معروفة من الكروية (أي ما يعادل يفضل أن عدد الكروية على استعداد لحقنة واحدة) كما هو موضح أعلاه.
    4. بعد 1 ساعة، ونقل 100 ميكرولتر من المحللة الخلية، في نسختين، في صفيحة 96-جيدا، ويضاف إلى كل بئر 100 ميكرولتر من 1X العازلة خلية تحلل تحتوي على 01:50 التخفيف من انتشار الخلايا الفحص الكاشف من هذه المجموعة. بعد 10 دقيقة، وقياس مضان في كل بئر لتحديد عدد من المجالات التي لم تحقن عن طريق مقارنة العينة التجريبية (s) مع عينة السيطرة.
19. تقييم مستوى تفعيل الكروية التي أعدت لحقن (اختياري) عن طريق قياس تركيز PGE2 وTSG6 التي تنتجها المجالات المنقولة. نقل 40-120 المجالات عن طريق القسطرة، كما هو موضح أعلاه، إلى 12 جيدا أو 6 جيدا لوحة تحتوي على 1 أو 2 مل αMEM تستكمل مع 2٪ FBS و1X البنسلين / الستربتومايسين. وضع لوحات في الحاضنة لمدة 6 ساعات.
    1. نقل متوسطة منالآبار بعد 6 ساعات إلى 1.5 أو 15 مل من أنابيب وأنابيب الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    2. نقل طاف خالية من الخلايا إلى الطازجة 1.5 مل أنابيب باستخدام ماصة وأجهزة الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. نقل أوضح سم (طاف) في الجديدة 1.5 مل الأنابيب وفحص للتركيز PGE2 (مؤشر جيد على إمكانات المضادة للالتهابات من سم) باستخدام مجموعة ELISA التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تركيز TSG6 يمكن تحديد باستخدام بروتوكول نشر ^14.

النتائج

في العمل الحالي، كانوا يعملون شنقا الثقافات قطرة لتوليد المدمجة كروية الأنسجة الصغيرة أو "الكروية" من اللجان الدائمة تفعيلها في ظل ظروف XF. خارطة الطريق الفحص في الشكل 1 يصور أن يتم تشجيع اللجان الدائمة في تقرير المصير، تجميع في الكروي?...

Discussion

لجنة السلامة البحرية المثلى لاستخدامها في بعض التطبيقات البحثية والسريرية يجب تفعيلها للغاية لتحقيق أقصى قدر من مصلحتهم، وعلى استعداد تفضيلي في ظل ظروف XF محددة كيميائيا للحد من وصول المستضدات المحتملة من مكونات المتوسطة xenogeneic مثل FBS. في البروتوكولات المذكورة هنا، ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling