ייצור ומנהלה של גזע הטיפולי mesenchymal / תא סטרומה (MSC) Spheroids הדרוך בתרבויות 3-D בתנאים קסנו ללא

Summary

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Abstract

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSCs) מחזיקים הבטחה גדולה Bioengineering ורפואה רגנרטיבית. MSCs יכול להיות מבודד רקמות בוגרות מרובות באמצעות הדבקות החזקה שלהם פלסטיק בתרבית רקמה ולאחר מכן להרחיב עוד יותר במבחנה, לרוב תוך שימוש בסרום שור עובר (FBS). מאז FBS יכול לגרום MSCs להפוך immunogenic, נוכחותה תרבויות MSC המגבילה הוא יישומים קליניים וניסויים של התאים. לכן, מחקרים והעסיקו עובדים ללא קסנו הגדרה כימית (XF) מדיה עבור תרבויות MSC היא יקרה ערך. השפעות מועילות רבות של MSCs יוחסו יכולתי לווסת דלקת חסינות, בעיקר באמצעות הפרשת גורמי מערכת חיסוניים כגון גן גורם מגורה נימק גידול 6 (TSG6) ו פרוסטגלנדין E2 (PGE2). עם זאת, MSCs מחייב הפעלה לייצר גורמים אלה שכן ההשפעה של MSCs היא לעתים קרובות חלף, עניין רב התפתח לגלות דרכים של טרום הפעלת PRIO התאיםr כדי השימוש בהם, ובכך לחסל את זמן השהיה עבור ההפעלה in vivo. כאן אנו מציגים פרוטוקולים כדי להפעיל ביעילות או MSCs הממשלה תלת ממדי (3D) תרבויות בתנאי XF הגדרה כימית ולנהל MSCs מראש מופעל אלה in vivo. באופן ספציפי, אנו מתארים שיטות ראשונות שיצרו MSC הכדורי-רקמות מייקרו או 'spheroids' בטיפות תלויות באמצעות מדיום XF ולהדגים כיצד הספירות והתנו הבינוני (CM) ניתן לקצור עבור יישומים שונים. שנית, אנו מתארים מסכי ביטוי גנים במבחנת מבחנים תפקודיים כדי להעריך את הרמה במהירות של הפעלת MSC ב spheroids, תוך שימת דגש על הפוטנציאל אנטי-דלקתי ואנטי-סרטני של התאים. שלישית, אנו מתארים שיטה חדשה להזריק spheroids MSC השלם לתוך חלל הצפק העכבר לבדיקות יעילות vivo. בסך הכל, את הפרוטוקולים בזאת להתגבר על האתגרים העיקריים של קבלת MSCs מראש מופעל תחת con XF הגדרה כימיתditions ולספק מערכת גמישה לניהול spheroids MSC עבור טיפולים.

Introduction

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSCs) הראה פוטנציאל גדול עבור גישות רפואת רגנרטיבית שונות. MSCs בתחילה בודדו כמרכיב סטרומה של מח העצם אבל מאז התקבלו מחברת רקמות בוגרות רבות אחרות, כולל רקמת שומן ^{1, 2, 3.} מעניין לציין, כי שיטת הבידוד העיקרית מחבק תכונה יוצאת דופן של MSCs להיצמד בחוזקה על פלסטיק בתרבית רקמה בנוכחות בסרום שור העובר (FBS). בעוד טכניקת בידוד המסורתית הזה מאפשרת רחבה קלה ומהירה של MSCs ב דו ממדים (2D) תרבות, זה גם מאוד מלאכותי ומתעלם משמעות של תלת ממדי (3D) בסביבה המקורית שמובילה לאובדן פוטנציאל של מאפיינים תאיים חשובים ^{4, 5 , 6.} לכן, המחקר של MSCs בתרבויות 3D, אשרהם יותר פיסיולוגיים מאשר תרבויות 2D מסורתיות, התפתח בחיפוש עבור "אבדו / פחתה" מאפייני MSC. יתר על כן, עניין רב עלה לזהות תנאים מוגדרים קסנו-חינם (XF) כימי לתרבות הפעלת MSC, ובכך להפוך את התאים יותר נוחים עבור יישומים קליניים.

מחקרים רבים פורסמו הוכחת תרבות 3D של MSCs היא biomaterials וכפי אגרגטים או spheroids כדוריים. MSCs ב biomaterials בתחילה תוכנן עבור גישות הנדסת רקמות להחליף רקמות פגועות עם פיגומי תא זרע, ואילו תרבויות אליפטית של MSCs נראו כדרך להבין את התנהגות MSC in vivo לאחר מתן של התאים עבור טיפולים בניסויים פרה-קליניים או קליניים ^{4, 5, 7.} מעניין, spheroids טופס MSCs ספונטני כאשר דבקות פלסטיק בתרבית רקמה אינה מותרת^{8, 9, 10.} באופן מסורתי, צבירה התא התאפשרה על ידי שיטות בקבוק טווה או טכניקות כיסוי נוזלי, שיטות השתמשו בתחילה בביולוגיה סרטן במאמצים לנסות לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול. לאחרונה, שיטות נוספות צצו ממחישי צבירת תא כלי תרבות מראש מצופית עם כימיקלים מסוימים כדי למנוע תא אל הפלסטיק דבק ^{4, 5, 6.} אחת השיטות הפשוטות ביותר וחסכוני ליצור spheroids MSC היא תרבות אותם בטיפות תלויים, טכניקה ששימשה לעתים קרובות לייצר גופים embryoid מתאי גזע עובריים. עם תלוי טכניקת תרבות ירידה, דבקות תא הפלסטיק בתרבית רקמת נמנע בשל השעיית תאי ירידה של מדיום על החלק התחתון של מכסת צלחת בתרבית רקמה ומאפשר הכביד כדי להקל תא aggregation ב הקודקוד של ירידה. גודל אליפטית ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי ריכוז התא או נפח ירידה, מה שהופך תרבויות Drop Hanging במיוחד קל לשלוט.

מחקרים מוקדמים על תרבות 3D של MSCs הפגינו שוני קיצוני קיים בין המאפיינים של תאי 3D לעומת עמיתיהם 2D שלהם ^{6, 8, 9.} במקביל, דיווחים הראו כי ההשפעות המיטיבות של MSCs in vivo הסתמכה על יכולתם להיות מופעל על ידי רמזים מיקרו-סביבתיים, בתגובה, כדי לייצר אנטי דלקתי אימונו גורמי ^11. מעניין לציין, כי רבים של גורמים אלה כגון פרוסטגלנדין E2 (PGE2), מגורה גורם נמק גידול גן 6 (TSG6), ואת גורם הגדילה hepatocyte (HGF) יוצרו בכמויות הרבה יותר גדול על ידי spheroids MSC מ MSCs 2D המסורתית לסלול את הדרך עבור רעיון שלבתרביות 3D כדי להפעיל את תאי ^{8, 12, 13.} יתר על כן, הפעלת גנים בתרבויות 3D הופיע לשחזר מנגנונים, לפחות חלקית, של הפעלת תא לאחר ההזרקה לעכברים ^12. על ידי הפעלת MSCs לפני השימוש בם בניסויים, אפקטים של התאים עשויים להתמשך ובולטים יותר כהשפעת MSC המסורתית in vivo היא לעתים קרובות מתעכבת וחולפת, והוא יכול להיות מתואר כמו "פגע וברח". במהלך השנים האחרונות, מחקרים תפקודיים חשובים באמצעות spheroids MSC הוכיחו כי הם יכולים לדכא תגובות דלקתיות ולווסת חסינויות in vivo באמצעות השפעה על תאי מפעיל כגון מקרופאגים, תאים דנדריטים, נויטרופילים, ותאי T ביצוע spheroids צורה אטרקטיבית של MSCs הדרוך ^{2 , 3.} בנוסף, ייצור של מולקולות אנטי-סרטניות, כגון interleukin-24 (IL-24) ו נימקים גידול קשור גורם ליגנד וישכנע אפופטוזיס (TRAIL), גוברים בתרבויות 3D של יחסי MSCs כדי חד שכבתי MSCs, תופעה שעלולה להיות מנוצלת על בטיפולי הסרטן ממוקד ^{8, 10, 14.}

כמו התרבות MSC המסורתית נדרשה לא רק את שימוש פלסטיק בתרבית רקמה אלא גם FBS, משוכה נוספת וגדילה ל spheroids MSC יותר נוחה לשימוש קליני היה הצורך להתגבר. כדי להתמודד עם המשוכה הזאת, הראינו היווצרות לאחרונה של spheroids MSC בתנאי XF ספציפי הגדרה כימית והקמתי כי spheroids MSC וכתוצאה מכך הופעל לייצר המולקולות אנטי-דלקתית ואנטי-הסרטניות הזהות spheroids שנוצר בתנאים עם FBS ^14. הנה, ממצאים אלה מוצגים בכמה פרוטוקולים מפורטים המדגימים את הדור של MSCs מראש המופעל בתרבויות 3D באמצעות XFכְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת. בנוסף, פרוטוקולים מוצגים המתארים דרכים יעילות כדי להעריך את רמות ההפעלה של MSCs לגבי ההשפעות אנטי דלקתית, המערכת החיסונית ואנטי סרטן שלהם, יחד עם שיטה מעשית כדי לספק את spheroids השלם לעכברים.

Protocol

בידוד MSC 1. והרחבה

1. השג MSCs מעבר מוקדם מן המרכז הכנה והפצה של תאי גזע בוגרים ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) ¹⁵ בקבוקונים קפוא כמו. לחלופין, לבודד MSCs מ aspirates מח עצם בעקבות פרוטוקול שגרתי ¹⁴ ולאחסן כמו צלוחיות קפוא.
2. הכן בינוני תרבות שלמה (CCM), המהווה אלפא מדיום חיוני מינימלי (αMEM) בתוספת פרמיה 15-20% בחרו FBS, 2 מ"מ L- גלוטמין, ו 1x-סטרפטומיצין פניצילין. לעקר את המדיום על ידי סינון.
3. מניחים 30 מ"ל של CCM לתוך צלחת תרבית תאים 150 מ"מ ו דגירה את המנה למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכיל 5% CO _2.
4. דגירה בקבוקון קפוא המכיל כ 10 ⁶ MSCs למשך 2 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
5. מעבירים את תכולת הבקבוקון כדי בצלחת תרבות באמצעות pipet 5 מ"ל סרולוגיות ולשטוף מספר פעמים בקבוקון עם 1-2 CCM מ"ל מצלחת ללכוד תאים שיורית. מניחים את לילה המנה באינקובטור המתאים.
6. בזהירות לשטוף את תרבות פעמיים עם בופר פוספט בטמפרטורת החדר (PBS) ולנתק את MSCs עם 3 מ"ל של תמיסת מראש חימם 0.25% טריפסין / ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA). ניתוק בדרך כלל לוקח כ 3-4 דקות בחממה.
7. לנטרל את טריפסין בצלחת עם 6 מ"ל CCM מחומם מראש ל -37 ° C ולהעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. מערבבים עם שטיפות של PBS על מנת למקסם את התשואה התא.
8. בצנטריפוגה תאים (450 XG) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant.
9. Re- להשעות את התאים בנפח קטן של CCM לספור את התאים קיימא באמצעות hemocytometer trypan כחול.
10. זרעים של מספר הולם של מנות 150 מ"מ ב -100 תאים / ² ס"מ ב 30 מ"ל של CCM חם ו דגירה התרבויות עד כ 70-80% ומחוברות, בדרך כלל 7 ימים עם המדיום משתנה כל 2-3 ימים 24-48 שעות לפני הקציר.
11. קציר התאים כנ"ל עם טריפסין / EDTA ולשלב כל התאים לתוך צינור חרוטי יחיד עם המדיום המתאים. צנטריפוגה שוב מחדש להשעות את התאים לתוך נפח קטן של אותו המדיום עבור ספירת תאים. השתמש CCM סטנדרטי (המכיל FBS) או שונים זמינים מסחרית ניסוחים מדיה XF, כאן המכונה XF בינוני 1 (XFM-1) ו XF בינוני 2 (XFM-2), עם או בלי אלבומין בסרום אדם (HSA, 13 תוספת מ"ג / מ"ל).

2. הכנה הופעל MSC Spheroids ב 3-D תליית תרבויות זרוקות תחת תנאי XF

1. כדי ליצור spheroids של 25,000 תאים כ, לדלל את MSCs שנקטפו לתוך CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 מ"ג / מ"ל), XFM-2, או XFM-2 + HSA (13 מ"ג / מ"ל) ב 714 תאים / μl.
2. טיפות פיפטה 35 μl / של תאים על גביהחלק התחתון של מכסה צלחת תרבות הפוכה 150 מ"מ. טיפות מרובות ניתן pipetted בקלות באמצעות פיפטה רבה.
   הערה: אם spheroids גדול יותר או קטן הם רצויים, לשנות את ריכוז תאים או נפח הירידה (25-45 μl) כראוי.
3. העבר 20 מ"ל של בטמפרטורת החדר PBS לתוך הבסיס של המנה ובאחד תנועה רציפה ויציבה להעיף את המכסה, המכיל את טיפות, כך apices ירידה כלפי מטה. מניח את המכסה בזהירות על הבסיס של מנת התרבות.
4. מעביר את הצלחת לתוך החממה במשך 3 ימים מבלי להפריע זה להתיר הרכבה בתחום מתאימה.
5. לאחר 72 שעות, להתחיל את הקציר אליפטית ידי הסרת המכסה בזהירות היפוך זה כך טיפות, שוב, כלפי מעלה.
6. זווית את המכסה כ 10-20 ° ולדחוף את טיפות, המכיל את spheroids, עד לקצה הצלחת באמצעות מרים תא.
7. מעבירים את התחומים ובינוניים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל עם צינור μl 1,000טטי. השתמש בטמפרטורת החדר PBS ו פיפטה עם אותו קצה לשטוף את הצלחת להבטיח התאוששות מקסימלית של spheroids.
8. עבור מבחני PCR בזמן אמת (פרוטוקול 3), בצנטריפוגה ההשעיה בתחום ב -450 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant. שטפו את spheroids עם PBS וחזור הן הצעדים צנטריפוגה והשאיפה. למסירה לתוך חיים (פרוטוקול 8), לאפשר התחומים להתיישב התחתון של הצינור (~ 3-4 דקות) ללא צנטריפוגה.

3. PCR בזמן אמת של סמנים ואנטי דלקתי אנטי-סרטניות

1. השתמש בערכת RNA החילוץ עם עמודות homogenizer ו RNase ללא DNase סט לבודד RNA סך DNA ללא מ MSCs בשכבה (פרוטוקול 1) ו spheroids MSC (פרוטוקול 2) כי נשטפו עם PBS ו centrifuged.
2. Lyse לפחות 100,000 MSCs בשכבה ו -20 spheroids מכל מצב צינורות חרוטי 15 מ"ל נפרד עם חיץ RLT המכיל β-mercaptoethanol (1: 100).
3. עָבָרFER את lysates מעורבת ביסודיות לתוך צינורות 1.5 מ"ל RNase ללא מקום לתוך המקפיא (-80 מעלות צלזיוס) במשך לפחות 3 שעות כדי לסייע תמוגה אליפטית.
4. ההפשרה lysates התא על קרח, מערבולת בקצרה, ופעל בהתאם להוראות היצרן עבור בידוד RNA באמצעות ערכת בידוד RNA הכולל יונקים זמינים מסחרית.
5. לכמת ולהעריך את איכות RNA הבודד באמצעות ספקטרופוטומטר.
6. השתמש בקיבולת גבוהה ערכת שעתוק לאחור cDNA או שווה ערך על פי הוראות היצרן כדי ליצור cDNA עבור PCR בזמן אמת.
7. מניחים דגימות cDNA, נועד מסחרית פריימרים PCR בזמן אמת / בדיקות (מבחני ביטוי גנים), ו- PCR מיקס מאסטר על הקרח. השתמש פריימרים / בדיקות עבור GAPDH (שליטה), PTGS2 (COX-2, אנטי דלקתי), TNFAIP6 (TSG6, אנטי דלקתי), TRAIL (נגד סרטן), ו- IL-24 (אנטי סרטניים).
8. הכן את התגובות בזמן אמת PCR פי הוראות היצרן עבור מבחני ג'ין הביטוי Unive מהירמיקס מאסטר rsal.
9. פעל בהתאם להנחיות עבור מכשיר PCR בזמן האמת להפקת מסמכי הניסוי וביצוע הריצה.
10. לנתח את הנתונים בשיטת _T ΔΔC ידי חישוב השינויים היחסיים (כמות יחסית, RQ) ב ביטוי גנים באמצעות GAPDH כמו MSCs המלא בשכבת אנדוגני כבסיס ^{8, 14.}

אוסף 4. של CM עבור מבחנים של מערכת חיסונית ואת הפוטנציאל אנטי-סרטני

1. קציר spheroids ו CM כמתואר לעיל לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, באמצעות מרים תא ו פיפטה, לעומת זאת, לא לשטוף את מכסים בצלחת עם PBS כמו זה יהיה לדלל את CM.
2. צנטריפוגה ב 450 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות לאסוף את supernatant תא ללא עם טפטפת, ולהעביר את supernatant לתוך צינורות 1.5 מ"ל.
3. צנטריפוגה ב XG 10,000 למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר, בזהירות לאסוף את CLCM arified עם טפטפת, ולהעביר את CM לתוך צינורות 1.5 מ"ל חדש לאחסון במקפיא (-80 ° C). כן aliquots של CM לפני ההקפאה כאשר משתמשים בו עבור מבחנים מרובים.
   הערה: לפני ביצוע מבחנים במורד זרם, ריכוז PGE2, אינדיקטור טוב של פוטנציאל אנטי-דלקתי של CM, ניתן לקבוע באמצעות ערכת ELISA מסחרית לפי הוראות היצרן. ריכוז TSG6 ניתן לקבוע באמצעות פרוטוקול פרסם ^14.

5. Assay Macrophage כדי להעריך את הפוטנציאל האנטי-דלקתיות של MSC-CM

1. הכן בינוני מקרופאג, אשר מורכב של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל L-alanyl-L- גלוטמין ו בתוספת 10% פרמיה לבחור FBS ו 1x פניצילין, סטרפטומיצין. מסנן לעקר את המדיום.
2. השג בקבוקון קפוא של כ 10 ⁶ מקרופאגים העכבר J774 דגירה בקבוקון למשך 2 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
3. מעבירים את תכולת הבקבוקון לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל, להוסיף 9 מ"ל של מדיום מקרופאג, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200-300 XG ו בטמפרטורת החדר.
4. לשאוב supernatant, להשעות את מקרופאגים לתוך 1 מ"ל של מדיום מקרופאג, ולהעביר את מקרופאגים לתוך צלחת פטרי 150 מ"מ המכיל 30 מ"ל של מדיום מקרופאג.
5. שנה את בינונית כל 2 ימים דגירה התאים בחממה עד ומחוברות 70-80% כ.
   הערה: המקרופאגים לא להיצמד בחוזקה כדי בצלחת פטרי, ובכך יש להיזהר לא לאבד את התאים עם שינוי בינוני.
6. קציר מקרופאגים ידי ריסוס המדיום מקרופאג על גבי תאים עם טפטפת. העברת התאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 200-300 XG ו בטמפרטורת החדר.
7. לשאוב supernatant ו להשעות את תאי נפח קטן של מדיום מקרופאג עבור ספירת תאים עם hemocytometer. התאם את הריכוז 200,000 תאים / מ"ל ​​עם מקרופאג ליdium.
8. כדי להפעיל את להגדיר עבור assay מקרופאג, להוסיף 480 μl של מדיום מקרופאג לתוך הבארות של צלחת 12-היטב.
9. הוסף 20 μl של מדיום מקרופאג לתוך בארות שליטה הלא מגורה 20 μl של בתווך בלתי מותנה או MSC ממוזג, מוכן לעיל, בבארות ניסיון. מערבבים את בינוניים הבארות על ידי הקשה על צלחת.
10. העבר 500 μl של השעית תא מקרופאג אל בארות שליטה מקרופאג הלא מגורה.
11. לעורר את מקרופאגים הנותרים עם תוספת של 1: 500-1: 1,000 של 0.1 מ"ג / מ"ל ​​lipopolysaccharide (LPS) דגירה 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
12. העבר 500 μl של מקרופאגים מגורה לתוך הבארות עם בתווך בלתי מותנה או MSC ממוזג. מערבבים את בארות ידי בהתמדה נדנדה את הצלחת כמה פעמים.
13. מעביר את הצלחת באינקובטור במשך 16-18 שעות.
14. קציר המדיום ממוזגים מקרופאג ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
15. לְהַעֲבִירsupernatant לתוך צינורות assay חדשים עבור אלפא tumor necrosis factor (TNF-α) ו- interleukin-10 (IL-10) תוכן לפי ערכות מסחריות ELISA בעקבות הוראות היצרן.

6. Assay Splenocyte כדי להעריך את הפוטנציאל המערכת החיסונית של אליפטית-CM

1. הכן בינוני splenocyte מלאה, אשר מורכב של מכון הזיכרון Rosewell פארק (RPMI) בינוני -1640 בתוספת 10% חום מומת FBS, סטרפטומיצין פניצילין 1x, ו -2-mercaptoethanol. מסנן לעקר את המדיום.
2. טחול קציר מעכברים BALB מורדמים-זכר / ג דרך חתך מוכן בצד השמאלי של הבטן מעל הטחול, כ באמצע הדרך בין החלק הקדמי ורגליו האחוריות ^14. מעבירים את הטחול כדי מסננת תא 70 מיקרומטר לבודד את splenocytes ^14.
3. לבודד את splenocytes / לימפוציטים על ידי לחיצה על טחול דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך usin צלחת פטרי סטריליתז סוף רך גומי / פלסטיק של הבוכנה של 2-3 מ"ל מזרק ^14. השתמש תנועה מעגלית שחיקה לנתק את הטחול.
4. שטפו את מסננת תא מספר פעמים עם PBS קר להעביר תאים מצלחת פטרי לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. מלאו את הצינור עם PBS קר צנטריפוגות (500 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
5. לשאוב supernatant ולנקות את התאים מן אריתרוציטים ידי הדגירה עם 5-10 פתרון תמוגה תאי הדם האדומים מ"ל (מחיר הטחול) למשך 5-10 דקות.
6. עצור את תמוגה על ידי הוספת PBS קר אל הצינור צנטריפוגות במשך 5-10 דקות ב XG 500 ו ב 4 מעלות צלזיוס.
7. להשעות את התאים המבודדים במדיום splenocyte מלא, לסנן דרך מסננת 40 מיקרומטר, לספור את התאים באמצעות hemocytometer. הוסף בינוני splenocyte על השעיית התא כדי להשיג ריכוז התא הסופי של 10 ⁶ תאים / מ"ל
   הערה: טכניקה זו בדרך כלל מניבה כ 3 x 10 ⁷ splenocytes לכל טחול עכבר.
8. לעורר את המספר המתאים של splenocytes עם 2 מיקרוגרם / אנטי CD3e נוגדן מ"ל במשך 5 דקות.
   הערה: כמות splenocytes נדרשת תלויה במספר תנאי ניסוי כפי שנקבע על ידי החוקר (ראה שלב 6.9). עבור כל מדגם ניסיוני / טוב, 10 ⁶ splenocytes נדרשים.
9. העברת 10 ⁶ splenocytes (מגורה או הלא מגורה) לתוך הבארות של צלחת 12-היטב ולהוסיף ממוזג הלא (שולטת) או MSC-CM לתוך בארות בדילול סופי של 1: 10-1: 20.
10. קציר את CM splenocyte לאחר 24 שעות ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
11. מעביר את supernatant לתוך צינורות assay חדשים עבור גמא אינטרפרון (IFN-γ) תוכן ידי ערכת מסחרי ELISA בעקבות הוראות היצרן.

7. Assay סרטן הערמונית כדי להעריך את הפוטנציאל האנטי-סרטניות של אליפטית-CM

1. כן בינוני צמיחת RPMI שלם כי הוא בינוני RPMI-1640 בתוספת 10FBS%, 1x-סטרפטומיצין פניצילין.
2. השג בקבוקון קפוא של תאי סרטן ערמונית LNCaP דגירת הבקבוקון עבור 2 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
3. מעבירים את תכולת הבקבוקון לתוך צלחת תרבות המכיל 30 מ"ל של מדיום הגידול RPMI להשלים באמצעות pipettor ממונע ו pipet סרולוגיות 5 מ"ל. שטוף את פעמי בקבוקון כמה עם מדיום מצלחת ומניח בצלחת לתוך החממה.
4. רק לפני התאים להגיע confluency, לשטוף את תרבות פעמיים עם בטמפרטורת החדר PBS ולנתק את תאי LNCaP עם 3 מ"ל של תמיסת טריפסין מחומם מראש 0.25% / EDTA.
5. לנטרל את טריפסין בצלחת עם מדיום הגידול RPMI להשלים ולהעביר את התאים יחד עם שטיפות לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
6. צנטריפוגה התאים ב 450 XG במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant.
7. מחדש להשעות את התאים לתוך נפח קטן של מדיום הגידול RPMI המלא ולספור את התאים הסרטניים באמצעות hemocytometer.
8. העבר תאים LNCaP לתוך צלחת 96-גם ב 5000 תאים / היטב 120 μl של מדיום הגידול להשלים RPMI המכיל 25% של הלא ממוזג או אליפטית-CM. דגירה בחממה במשך 72 שעות.
9. כדי לבצע assay צמיחת תאים באמצעות ערכת assay תא התפשטות, לשאוב את המדיום מבאר ולהעביר את הצלחת לתוך במקפיא (-80 ° C) לפחות 3 שעות.
   1. להפשיר את הצלחת lyse התאים בכל טוב על ידי הוספת 100 μl של מגיב תמוגה התא המכיל 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, ו -0.2 מ"ג / מ"ל ​​RNase א
   2. עבור עקומת סטנדרט, לסכומים ידועים lyse של תאי LNCaP כמתואר לעיל.
   3. אחרי השעה 1, להוסיף 100 μl של חיץ תמוגה תא 1x המכיל 1: 100 דילול של מגיב assay התפשטות תאים למדוד את הקרינה בכל טוב כדי לקבוע את הכמות התאית.

8. משלוח Intraperitoneal של Spheroids Intact

1. הכן MSCs אליפטית כמתואר לעיל (פרוטוקול 2) ו resuspend tהוא בתחומי המלח המאוזן של סטרילית האנק הפתרון (HBSS) השלים עם 0.2-0.5% HSA כדי לשמור על תנאי XF. HSA בפתרון מסייע במניעת הידבקות לכדור הפלסטיק במהלך הזרקה.
2. העבר 40-120 spheroids לתוך 15 מ"ל צינורות חרוטי ולשטוף את התאים על ידי הוספת 6 מ"ל HBSS / HSA של חצוצרות. אפשר 3-4 דקות עבור תחומים לרדת. הכין צינור חרוטים עצמאי של spheroids עבור כל חיה. כמו כן, להכין צינורות נוספים של spheroids עבור מבחני קביעת שימור אליפטית (ראה 8.18 להלן) וייצור של גורמים טיפוליים לאחר ההעברה (ראה 8.19 להלן) אם תרצה בכך.
3. לשאוב supernatant, כיסוי הספרואידים עם 100-200 μl של HBSS סטרילי השלימו עם 0.2-0.5% HSA, ולמקם את הצינורות על הקרח.
4. בקצרה להרדים את החיות עם isoflurane 2% ב 100% חמצן עד היעלמות רפלקס קמצוץ הבוהן כ 2 דקות בחדר אינדוקציה.
5. מניח את החיה בתוך ארון BSL-2, הגבה aspeCT למטה (בצד הגחון כלפי מעלה), עם זרימה רציפה של תערובת 1.5% isoflurane / חמצן באמצעות חרטומו.
6. נקה את בטן העכבר הנמוכה עם כזה חיטוי כמו אלכוהול 70%.
7. הסר את המכסה של 20 תוך ורידי G (iv) קטטר ולבצע את זריקת intraperitoneal עם הרכבת קטטר-סטילטו. השתמש ביד אחת להחזיק את עור העכבר אחר לבצע את הזריקה. אתר את נקודת ההזרקה בערך באמצע של קו מלאכותי חיבור אזור משותף מין ברך מכווצת עם קצה המחט מצביע לכיוון קו האמצע.
   הערה: הרכבת קטטר-הפגיון בעל עמידות גבוהה יותר מאשר מחט רגיל, ולכן אכפת צריכה להילקח כמו לא להזריק את המחט עמוקה מדי לתוך הבטן, אשר יכול לגרום לפגיעה באיברים פנימיים. חדירה של העור ולאחר מכן שרירים / קרום הצפק יכולים להיות מורגש במהלך השמת צנתר.
8. הוצא בעדינות את המתכת סטילטו / מחט ממכלול קטטר-סטילטו. check את פגיון דם, שתן וצואה וזורק אותו. דם על המחט מצביע ניקוב האיבר הפנימי (ים).
9. החזק את הקטטר הפלסטיק בתנוחה זקופה במהלך הזריקות להתיר זרימת נוזל.
10. אשר את המיקום הנכון של הקטטר פלסטיק ידי הזרקת כ 100 μl של סטרילית HBSS / HSA באמצעות קטטר בעזרת פיפטה עם קצה 100-200 μl. מניחים את הקצה של קצה פיפטה בתוך מתאם מזרק קטטר להרכיב חותם חזק. לאט לאט להזריק את הנוזל בתוך חלל הצפק.
    הערה: נוזל קטטר וממוקמים כראוי יזרום בחופשיות בתוך חלל הצפק עם התאמה קלה בלבד של הקטטר. מיקום לא תקין של הקטטר (תת עורית או תוך-מעיים, או אם קצה האיברים הצפק נפצע המחט כגון כליות) יגדיל התנגדות ולהפחית זרימה. מיקום תת עורי יגרום במערך של "בועה" ברורה מתחת לעור.
11. אסוף tהוא MSC spheroids, ערוכים 100-200 μl של HBSS / HSA (שלב 8.3), באמצעות קצה פיפטה 200 μl, ולהעביר את כל נפח של כדורים (40-120 תחומים) לתוך חלל הצפק באמצעות קטטר כפי שתואר לעיל.
12. שטפו את שפופרת המכילה תחומי עם 100 μl של HBSS / HSA באמצעות אותו קצה כנ"ל לאסוף כל spheroids שיורית ולהזריק אותם לתוך חלל הצפק.
13. (אופציונלי) להזריק 100 μl נוסף של HBSS / HSA לתוך חלל הצפק כדי לשטוף את הקטטר.
14. מניחים את פד גזה טבול חומר מחטא על קטטר ולאט לאט להסיר את הקטטר מחלל הצפק וזורקים אותו.
15. בעדינות לעסות את חלל הצפק עם האצבעות על מנת להבטיח חלוקה שווה של spheroids.
16. בואו החיה להתאושש תחת השגחה צמודה ולצפות לדימומים מאתר ההזרקה.
17. בדוק את הקטטר ואת צינור 15 מ"ל לכל spheroids הנותרים. זה נורמלי לצפות כמה כדורים בקטטר / צינור.
    הערה: הטכניקה המתוארת למסירת אליפטית MSC יכולה להיות מאומצת לשימוש בחיות נורמליות או במגוון מודלי פציעה. טכניקה זו שימשה בהצלחה להזריק spheroids לפגיעה בקרנית העכבר ומודלים endotoxemia, כמו גם מודל הצפק הנגרמת zymosan ^8.
18. כדי לכמת את מספר spheroids שמר (לא חובה), השתמש מגיב / ערכת כימות מספר הסלולרי מבוסס-DNA. החזק את הקטטר בשימוש מעל הצינור 15 מ"ל נמרצות לוותר HBSS / HSA באמצעות קטטר לכפות על כל התחומים הנותרים בחזרה לתוך הצינור 15 מ"ל.
    1. צנטריפוגה שפופרת 15 מ"ל ב XG 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר לשאוב supernatant. מעביר את הצינור המכיל את הגלולה אליפטית לתוך מקפיא (-80 מעלות צלזיוס) במשך לפחות 3 שעות.
    2. להפשיר את הצינור lyse הספירות על ידי הוספת 500 μl של מגיב תמוגה התא המכיל 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, ו -0.2 מ"ג / מ"ל ​​RNase א
    3. עבור פקד, freEze ו lyse כמות של spheroids ידוע (רצוי שווה למספר של spheroids מוכן זריקה אחת) כמתואר לעיל.
    4. אחרי שעה 1, להעביר 100 μl של lysate התא, בשני עותקים, לתוך microplate 96-היטב ולהוסיף היטב כל 100 μl של חיץ תמוגה התא 1x המכיל 01:50 דילול של מגיב assay התפשטות תאים מתוך הערכה. לאחר 10 דקות, למדוד את הקרינה בכל טוב כדי לקבוע את מספר תחומים שלא הוזרקו ידי השוואת המדגם הניסיון (ים) עם מדגם השליטה.
19. להעריך את רמת ההפעלה של spheroids המוכן להזרקה (אופציונלית) על ידי מדידת ריכוז של PGE2 ו TSG6 המיוצר על ידי תחומי עבירה. העברת 40-120 התחומים באמצעות קטטר, כמתואר לעיל, לתוך צלחת 12-היטב או 6-היטב המכיל 1 או 2 מ"ל αMEM בתוספת 2% FBS ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין. מניחים את הצלחות בחממה במשך 6 שעות.
    1. מעבירים את המדיוםהבארות לאחר 6 שעות לתוך 1.5 או 15 מ"ל צינורות צנטריפוגות צינורות ב 450 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. מעבירים את supernatant תא ללא לתוך צינורות 1.5 מ"ל טרי בעזרת פיפטה ו צנטריפוגות ב XG 10,000 למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. מעביר את הבהיר CM (supernatant) לתוך צינורות 1.5 מיליליטר ו assay חדשים עבור ריכוז PGE2 (אינדיקטור טוב של פוטנציאל אנטי-דלקתי של CM) באמצעות ערכת ELISA מסחרית לפי הוראות היצרן. ריכוז TSG6 ניתן לקבוע באמצעות פרוטוקול פרסם ^14.

תוצאות

בעבודה הנוכחית, תרבויות ירידה תלויות הועסקו כדי ליצור רקמות מייקרו כדורי קומפקטיות או 'spheroids' של MSCs מופעל בתנאי XF. מפת דרכי המחקר באיור 1 מתארת כי MSCs מעודד עצמי להרכיב לתוך spheroids מרחף תלוי טיפות במשך 72 שעות, שלאחריו spheroids, או CM עמוסה גורמים...

Discussion

MSC האופטימלי לשימוש בכמה יישומי מחקר קליניים צריך להיות מופעל ביותר על מנת למקסם את התועלת שלהם, והכין מועדף בתנאי XF הגדרה כימית כדי למזער את המסירה של אנטיגנים פוטנציאל מרכיבים בינוניים xenogeneic כגון FBS. בפרוטוקולים המתוארים כאן, הראינו שיטות 1) להפעיל MSCs בתרבות 3D ידי הי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling