Xeno-ücretsiz Koşullarda 3-D Kültürler Üretim ve Tedavi Mezenkimal Kök Yönetim / Stromal Cell (MSC) küremsi Astarlı

Özet

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Özet

Mezenkimal kök / stromal hücreler (MKH) Biyomühendislik ve rejeneratif tıpta büyük umutlar tutun. MSC'ler doku kültür plastik güçlü yapışması ile birden fazla yetişkin dokulardan izole edildi ve daha sonra en sık fetal sığır serumu (FBS) ile, in vitro olarak genişletilebilir. FBS MKH'ler immünojenik hale gelmesine neden olabilir beri, MSC kültürlerde varlığını hücrelerin hem klinik hem de deneysel uygulamalar sınırlar. MSC kültürleri Bu nedenle, çalışmalar kimyasal olarak tanımlanmış istihdamı xeno-free (XF) medya son derece değerlidir. MSC yararlı etkilerinin büyük bir tümör nekroz faktörü ile uyarılan gen 6 (TSG6) ve prostaglandin E2 (PGE2) gibi başlıca bağışıklık faktörlerin salgılanması sayesinde, inflamasyon ve bağışıklık düzenleme kabiliyetleri bağlanmıştır. Ancak, MKH bu faktörlerin üretmek için aktivasyon gerektirir ve MKH etkisi genellikle geçicidir, çünkü büyük ilgi hücreleri Prio öncesi aktive yollarını keşfetmek için ortaya çıkmıştırkullanımlarına R, ve böylece in vivo olarak aktivasyon için gecikme süresini ortadan kaldırır. Burada üç boyutlu (3D) kültürlerde etkili bir şekilde harekete geçirmek için protokoller ya da asal MKH'lerin sunuyoruz kimyasal olarak tanımlanmış XF koşullar altında ve in vivo bu ön-aktifleştirilmiş MKH'lerin uygulanması. Özellikle, ilk XF orta kullanarak küresel MSC mikro dokuları veya asılı damla 'parçacıklarının' oluşturmak ve küreler ve klimalı ortam (CM) çeşitli uygulamalar için hasat edilebilir göstermek için yöntemler açıklanmaktadır. İkinci olarak, gen ekspresyon ekranlarını tarif ve in vitro fonksiyonel deneyleri, hızlı hücre anti-enflamatuar ve anti-kanser potansiyeli vurgulayan parçacıklarının MSC aktivasyon seviyesini değerlendirmek. Üçüncü olarak, in vivo etkinliği test etmek için, fare periton boşluğuna sağlam MSC sferoidler enjekte etmek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Genel olarak, protokoller burada kimyasal olarak tanımlanmış XF con altında önceden etkinleştirilmiş MKH'lerin elde büyük zorlukların üstesindenkoşullarına ve tedaviler için MSC parçacıklarının yönetmek için esnek bir sistem sağlamak.

Giriş

Mezenkimal kök / stromal hücreler (MKH), çeşitli rejeneratif tıp yaklaşımları için büyük bir potansiyel göstermiştir. MSC'ler, başlangıçta, kemik iliği stromal bileşeni olarak izole edildi, ancak bu yana adipoz doku ^{1, 2, 3} dahil olmak üzere, pek çok diğer yetişkin dokulardan elde edilmiştir. İlginç bir şekilde, temel izolasyon yöntemi MSC gibi önemli bir özelliğe fetal sığır serumu (FBS) varlığında doku kültürü plastik üzerine sıkı bir şekilde yapışmasına içine alır. Bu geleneksel izolasyon tekniği iki boyutlu (2D) kültüründe MKH kolay ve hızlı genişlemesine izin veren iken, ^5, aynı zamanda çok yapay ve önemli hücresel özellikleri ⁴ potansiyel kaybına yol açan doğal üç boyutlu (3D) çevrenin önemini göz ardı ^6. Bu nedenle, 3D kültürlerde MSC çalışma, buradageleneksel 2B kültürlerin daha fizyolojik olan "kayıp / azalmış" MSC özellikleri arayışında ortaya çıkmıştır. Ayrıca, büyük ilgi klinik uygulamalar için hücreler daha müsait hale böylece MSC kültür ve aktivasyonu için xeno-free (XF) kimyasal olarak tanımlanmış koşulları tanımlamak ve yükseldi.

Birçok çalışma biyomalzeme ve küresel agrega ya da küresel cisimler hem MKH 3D kültürünü gösteren yayınlanmıştır. MKH sfero kültürleri klinik öncesi veya klinik çalışmalarda tedaviler için hücrelerin uygulanmasından sonra in vivo MSC davranışlarını anlamak için bir yol olarak görüldü oysa biyomalzeme MKH başlangıçta, hücre numaralı seribaşı iskeleleri ile hasarlı dokuların yerine doku mühendisliği yaklaşımları için tasarlanmış ^{4, 5, 7.} İlginçtir, MKH formu sferoidler kendiliğinden doku kültürü plastik bağlılık izin verilmez zaman^{8, 9, 10.} Geleneksel olarak, hücre birikme Spinner şişesi yöntemleri ya da sıvı kaplama teknikleri, tümör mikro taklit deneyin çabalarında Kanser biyolojisinde başlangıç ​​olarak kullanılan yöntemler ile kolaylaştırıldı. Daha yakın zamanda, ilave yöntemler kültür tabaklarına hücre toplanması hücre-plastik yapışma ^{4, 5, 6} önlemek için özel kimyasallar ile önceden kaplanmış göstermektedir ki ortaya çıktı. MSC sferoidler oluşturmak için en basit ve en ucuz yöntemlerden biri, genellikle, embriyonik kök hücreleri embriyoid organları üretmek için kullanılan bir teknik, asılı damla kültür bunların etmektir. damla kültürü tekniği asılı olan, doku kültürü plastik hücre yapışması, hücre aggreg kolaylaştırmak için yerçekimi, bir doku kültürü kabı kapağının altında ortamının bir drop içinde süspansiyona ettirilip engellenirdamla tepesinde yer tirme. sfero boyutu kolayca, hücre konsantrasyonunu veya açılan hacmini değiştirerek kontrol etmek son derece kolay asılı damla kültürleri yaparak manipüle edilebilir.

MKH 3D kültürü üzerindeki ilk çalışmalar onların 2B meslektaşları ^{6, 8, 9} ile karşılaştırıldığında 3D hücrelerin özelliklerinde radikal farklılıklar göstermiştir. Aynı zamanda, in vivo koşullarında raporlar MSC yararlı etkileri, yanıt olarak, mikro çevre hareketlerine göre aktive olma, anti-enflamatuar ve bağışıklık düzenleyici ^{olarak 11} üretme yetenekleri dayanıyordu olduğunu göstermiştir. İlginç bir şekilde, prostaglandin E2 (PGE2), tümör nekroz faktörü ile uyarılan gen 6 (TSG6), hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve bu faktörlerin bir çok yol açan geleneksel 2D MSC daha MSC sferoidler göre çok daha büyük miktarlarda üretilmiştir fikrihücreler ^{8, 12, 13} aktif hale getirmek için 3D kültürleri kullanılmıştır. Ayrıca, 3D kültürlerinde gen aktivasyon fareler ¹² içine enjeksiyondan sonra hücre aktivasyonunun, en azından kısmen, mekanizmaları özetlemek ortaya çıktı. In vivo geleneksel MSC etkisi genellikle gecikmeli ve geçici ve "vurmak ve koşmak" olarak tarif edilebilir gibi deneylerde bunların kullanımdan önce MKH'lerin aktive ederek, hücrelerin etkileri uzun süreli ve daha belirgin olabilir. Geçtiğimiz birkaç yıl boyunca, MSC küremsilerin kullanılması önemli fonksiyonel çalışmalar, bunların enflamatuar cevapları bastırma ve sferoidler hazırlanmış MSC ² çekici formu hale makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller ve T hücreleri gibi efektör hücrelerin etkileyerek, in vivo olarak bağışıklık modüle olduğunu göstermiştir ^3. Buna ek olarak, int anti-kanser moleküllerinin üretimierleukin-24 (IL-24) ve tümör nekroz faktörü ile ilgili apoptoz-indükleyici ligand (TRAIL), erişkin mono tabakasına MSC'ler nisbetle 3D kültürlerinde hedeflenen kanser tedavileri ^{8, 10, 14} için yararlanılabilir bir olgu artar.

Geleneksel MSC kültür doku kültürü plastik değil, aynı zamanda FBS kullanımı sadece gerektiği gibi klinik kullanımı aşılması gereken vardı, başka bir engel MSC sferoidler daha müsait hale getirmek için. Bu engel üstesinden gelmek için, son zamanlarda, belirli kimyasal olarak tanımlanmış XF koşulları altında MSC parçacıklarının oluşumunu göstermiştir ve elde edilen MSC sferoidler FBS ¹⁴ koşullarda üretilen parçacıklarının aynı anti-enflamatuar ve anti-kanser molekülleri üretmek üzere aktive edilmiştir saptamıştır. Burada, bu bulgular XF kullanarak 3D kültürlerde önceden aktive MKH nesil gösteren birçok ayrıntılı protokoller sunulmuşturOrtam. Buna ek olarak, protokoller birlikte farelere sağlam sferoidler sunmak için pratik bir yöntem ile, anti-enflamatuar, bağışıklık düzenleyici ve anti-kanser etkilerine açısından MSC aktivasyon seviyelerini değerlendirmek için etkili yollar tarif eden sunulmaktadır.

Protokol

1. MSC İzolasyon ve Genişleme

1. Erken geçiş Hazırlama Merkezi'nden MKH'lerin ve Erişkin Kök Hücre (Dağılımı elde http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) ¹⁵ olarak dondurulmuş flakon. Alternatif olarak, rutin bir protokol ¹⁴ aşağıdaki kemik iliği gelen MKH'lerin izole ve dondurulmuş şişeleri saklamak.
2. minimum temel ortam (αMEM) FBS, 2 mM L-glutamin seçin% 15-20 prim ile takviye edilmiş a ve 1 x penisilin-streptomisin tam kültür ortamında (CCM) hazırlayın. süzme ile orta sterilize edin.
3. 150 mm hücre kültür çanağı içine CCM 30 ml yerleştirilir ve% 5 _CO2 içeren nemli bir inkübatör içinde 37 ° C'de 30 dakika süreyle etiketlenir inkübe edin.
4. 37 ° C su banyosu içinde 2 dakika süreyle yaklaşık 10 ⁶ MKH'lerin ihtiva eden dondurulmuş şişesinden inkübe edin.
5. 5 ml'lik serolojik pipet kullanarak kültür çanak şişenin içeriğini aktarmak ve artık hücreleri yakalamak için çanak 1-2 ml CCM ile flakon birkaç kez yıkayın. Uygun bir inkübatör çanak gecede yerleştirin.
6. Dikkatlice oda sıcaklığında fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) ile iki kez kültür yıkama ve önceden ısıtılmış,% 0.25 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi 3 ml MKH'lerin ayırın. Müfreze genellikle inkübatör yaklaşık 3-4 dakika sürer.
7. 6 mi CCM önceden ısıtılmış 37 ° C çanak tripsin nötralize ve 50 ml konik bir tüp içinde bir hücre süspansiyonu aktarın. Hücre verimi en üst düzeye çıkarmak için PBS yıkar ile birleştirin.
8. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hücreler (450 xg) santrifüj ve süpernatan aspire.
9. CCM küçük bir hacim içinde hücrelerin yeniden askıya ve bir hemasitometre ve tripan mavisi kullanarak canlı hücreleri sayın.
10. 100 hücre / cm ² 150 mm yemekleri uygun sayıda tohum sıcak CCM 30 ml, yaklaşık% 70-80 konfluent kadar kültürleri inkübe genellikle 7 gün.
11. tripsin / EDTA ile yukarıdaki gibi hücreler hasat ve uygun ortam ile tek bir konik tüp içine tüm hücreleri birleştirir. Tekrar santrifüj ve hücre sayımları için aynı ortamın küçük bir hacme içine hücreleri yeniden askıya. Standart CCM (FBS ihtiva eden) veya çeşitli ticari olarak temin edilebilir XF ortam formülasyonları kullanarak, burada ve insan serum albumini içermeyen iki, XF orta 1 (XFM-1) ve XF orta 2 (XFM-2) olarak adlandırılır (HSA, 13 mg / ml) takviyesi.

XF Koşullarında Damla Kültürler Asma 3-D Aktif MSC küremsi 2. Hazırlık

1. Yaklaşık 25,000 hücre küremsiler oluşturmak için, CCM olarak hasat mezenkimal, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2 veya XFM-2 + HSA 714 hücre (13 mg / ml) seyreltin / ul.
2. hücrelerin pipetle 35 ul / damla üzerine150 mm ters kültür çanak kapağın alt. Çoklu damla kolayca çok kanallı pipet kullanarak pipetle edilebilir.
   NOT: Daha büyük veya daha küçük sferoidler istenirse, hücre konsantrasyonunu veya uygun damla hacmi (25-45 ul) değiştirin.
3. çanak tabanına oda sıcaklığında 20 ml PBS aktarın ve bir sürekli ve düzgün bir hareketle damla uçlarının aşağı doğru gelecek şekilde bu, damlası içeren, kapağı çevirmek. kültür çanak baz dikkatlice kapağını yerleştirin.
4. Uygun küre tertibatını izin için bozmadan 3 gün boyunca kuvöz içine çanak aktarın.
5. 72 saat sonra, dikkatlice kapağı kaldırma ve damla, bir kez daha, yukarı bakacak şekilde onu ters çevrilerek sfero hasat başlar.
6. Açı yaklaşık 10-20 ° kapak ve bir hücre kaldırıcı kullanılarak plaka kenarına, parçacıklarının içeren damla itin.
7. 1.000 ul borusu ile 15 ml konik tüp içine küreler ve orta aktarıntte. Kullanım oda sıcaklığı PBS ve plaka yıkayın ve parçacıklarının maksimum iyileşme sağlamak için aynı ucu ile pipet.
8. Gerçek zamanlı PCR testi (protokol 3) için, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 xg'de küre süspansiyonu santrifüj ve süpernatant aspire. PBS ile parçacıklarının yıkayın ve her iki santrifüj ve aspirasyon adımları tekrarlayın. hayvanlara teslim (protokol 8) için, küre santrifüj olmadan tüp (~ 3-4 dk) alt yerleşmek için izin verir.

Anti-enflamatuar ve anti-kanser markerleri 3. Real-time PCR

1. DNA içermeyen, toplam tek tabaka MSC RNA (Protokol 1), PBS ile yıkandı ve santrifüj edildi MSC sferoidler (Protokol 2) izole etmek için bir homojenleştirici kolon ve RNase-barındırmayan DNase Set RNA özütleme kiti kullanarak.
2. Lyse en az 100.000 tek katmanlı MSC'ler ve ayrı 15 ml her bir durum 20 sferoidler RLT tamponu β-merkaptoetanol (1: 100) ihtiva eden konik borular.
3. Trans1.5 ml RNase içermeyen tüpleri içine iyice karıştırılır lizatları fer ve küremsi liziz yardım etmek için bir derin dondurucu (-80 ° C), en az 3 saat içine koyun.
4. kısaca buz, vorteks hücre lizatları çözülme ve piyasada bulunan bir memeli toplam RNA izolasyon kiti kullanılarak RNA izolasyonu için üreticinin talimatlarına uyun.
5. Sayısal olarak ve bir spektrofotometre kullanılarak izole edilmiş RNA kalitesini değerlendirmek.
6. Gerçek zamanlı PCR için cDNA oluşturmak için, üreticinin talimatlarına Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti veya eşdeğer göre kullanım.
7. Buz üzerinde cDNA örnekleri, ticari olarak tasarlanmış gerçek zamanlı PCR primerleri / probu (gen sentezleme) ve PCR Master Mix yerleştirin. GAPDH (kontrol), PTGS2 (COX-2, anti-enflamatuar) için primerler / sondaları kullanarak, TNFAIP6 (anti-inflamatuar TSG6), Yol (anti-kanser) ve IL-24 (anti-kanser).
8. Gen sentezleme ve de Hızlı Unive için imalatçının talimatlarına uygun olarak, gerçek zamanlı PCR reaksiyonları hazırlanmasırsal Master Mix.
9. Deney belgeleri üreten ve çalıştırmak gerçekleştirmek için real-time PCR araç için yönergeleri izleyin.
10. Bazal ^{8, 14} olarak endojen kontrolü ve tek tabakalı MKH olarak GAPDH kullanılarak gen ifadesinde göreceli değişiklikler (göreceli miktarı, RQ) hesaplayarak ΔΔC _T yöntemini kullanarak verileri analiz edin.

Immünomodülatör ve Tahliller ve Anti-kanser Potansiyel CM 4. Koleksiyonu

1. Ancak, bir hücre hırsızı ve bir pipet kullanarak, 15 ml konik tüp içine yukarıda açıklandığı gibi bu CM sulandırmak gibi PBS ile çanak kapakları yıkama yok parçacıklarının ve CM hasat.
2. dikkatli bir şekilde bir pipet ile hücresiz süpernatan toplamak, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ve 1.5 ml tüpler içine süpernatant aktarın.
3. dikkatle cl toplamak oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjarified bir pipet CM ve bir dondurucu içinde depolama için yeni 1,5 ml tüpler içinde CM transferi (-80 ° C). Birden deneyleri için kullanırken önce donma CM hacimde hazırlayın.
   Not: Ön alt tahliller yapmak için PGE2 konsantrasyonu, CM anti-inflamatuar potansiyelinin iyi bir göstergesidir, üreticinin talimatlarına göre bir ticari bir ELISA kiti kullanılarak tespit edilebilir. TSG6 konsantrasyonu yayınlanmış bir protokol ¹⁴ kullanılarak belirlenebilir.

5. Makrofaj Deneyi MSC-CM Anti-inflamatuar Potansiyeli değerlendirin

1. L-alanil-L-glutamin içeren ve FBS ve 1 x penisilin-streptomisin seçin% 10'luk ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) oluşan makrofaj orta, hazırlayın. Filtre sterilize orta.
2. Yaklaşık 10 ⁶ J774 fare makrofaj dondurulmuş şişesinden elde edilir ve 37 ° C su banyosu içinde 2 dakika süreyle flakon inkübe edin.
3. 15 ml konik bir tüp içine şişenin aktarın 200-300 xg ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca makrofaj orta ve santrifüj 9 ilave edin.
4. Süpernatantı aspire makrofaj ortamın 1 ml makrofajlar askıya ve makrofaj ortam, 30 ml ihtiva eden bir 150 mm petri kabı içine makrofajlar aktarın.
5. 2 günde orta değiştirmek ve yaklaşık% 70-80 konfluent kadar inkübatör hücreleri kuluçkaya yatmaktadır.
   Not: makrofajlar ve böylece bir değiştirilen ortam içinde hücreler kaybetmemek için alınması gereken bakım, petri sıkıca bağlı değildir.
6. Bir pipet yardımıyla hücreleri üzerine makrofaj orta püskürtülerek makrofajlar hasat. 200-300 xg ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 50 ml konik bir tüp ve santrifüj içine hücreleri aktarın.
7. süpernatan aspire ve bir hemositometrede hücre sayımları için makrofaj orta küçük bir hacim içinde hücrelerin süspansiyonu. makrofaj Me ile 200,000 hücre / ml'ye konsantrasyonu ayarlamakdium.
8. Makrofaj deneyi için ayarlanmış başlangıç ​​12-kuyulu plakanın kuyularına makrofaj ortamın 480 ul ekleyin.
9. Uyarılmamış kontrol kuyularına makrofaj ortamı 20 ul ekleyin ve 20 ul olmayan şartlandırılmış ortam MSC durumunu, deney kuyu içinde yukarıda hazırlanan. plaka dokunarak kuyularda orta karıştırın.
10. uyarılmamış makrofaj kontrol oyuklarına makrofaj hücre süspansiyonu 500 ul aktarın.
11. 500-1: 1 ilave edilerek kalan makrofajlan uyardığı 1,000 0.1 / ml lipopolisakarit (LPS) mg, oda sıcaklığında 5-10 dakika kuluçkalayın.
12. klimalı olmayan veya MSC klimalı ortam ile kuyuların içine uyarılan makrofajlar 500 ul aktarın. sürekli plaka birkaç kez sallayarak kuyu karıştırın.
13. 16-18 saat boyunca bir kuluçka plaka aktarın.
14. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 xg'de makrofaj koşullandırılmış bir ortam ve santrifüj hasat edilir.
15. transferÜreticinin talimatlarını takip ticari ELISA kitleri ile tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) ve interlökin-10 (IL-10) içeriği için yeni boru ve tahlil yüzer.

6. Splenocyte Deneyi Sfero-CM İmmünomodülatuar Potansiyeli değerlendirin

1. Rosewell Park Memorial Institute (RPMI),% 10 ısı ile inaktive edilmiş FBS, 1 x penisilin-Streptomisin ile desteklenmiş -1640 orta ve 2-merkaptoetanol içermektedir tam splenosit ortamı hazırlar. Filtre sterilize orta.
2. Dalak üzerinde karnın sol tarafında hazırlanan bir kesiden ötenazi-erkek BALB / c farelerinden Hasat dalak, yaklaşık ön arasında orta yollu ve bacaklar ¹⁴ hind. Splenositlerin ¹⁴ izole etmek bir 70 mikron hücre süzgecinden için dalak aktarın.
3. steril bir petri usin içine 70 mikron süzgeç vasıtasıyla dalak iterek splenositler / lenfositler izole etmekg 2-3 bir pistonun yumuşak kauçuk / plastik uç ¹⁴ şırınga ml. dalak ayırmak için bir taşlama dairesel hareketler kullanın.
4. soğuk PBS ile hücre süzgeç birkaç kez yıkayın ve bir 50 ml konik tüp içine petri hücreleri aktarın. 10 dakika süre ile 4 ° C de soğuk PBS ve santrifüj (500 x g) ile tüp doldurun.
5. Süpernatant aspire ve 5-10 dakika boyunca (dalak başına) 5-10 mi alyuvar lisiz çözeltisi ile kuluçkaya yatırılması ile eritrositlerden hücreleri temizlemek.
6. 500 x g'de 5-10 dakika boyunca, 4 ° C'de tüp ve santrifüj soğuk PBS eklenerek lizis durdurun.
7. Tam splenosit ortamda izole hücreler Askıya 40 mikron süzgecinden filtre ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 10 ⁶ hücre / ml'lik bir nihai hücre yoğunluğu elde etmek için, hücre süspansiyonuna splenosit orta ekleyin
   NOT: Bu teknik, tipik olarak, fare dalak başına yaklaşık 3 x 10 ⁷ splenositlerin verir.
8. 5 dakika boyunca 2 ug / ml anti-CD3e antikoru ile splenositlerin uygun uyarır.
   Not: splenositlerin miktarı gerekli araştırmacı tarafından belirlenen deney koşulları sayısına bağlıdır (adım 6.9 bakınız). Her deneysel örnek için / de 10 ⁶ splenositler gereklidir.
9. Aktarım 10 ⁶ splenositler (uyarılmış veya uyarılmamış) 1 nihai seyreltme oranında kuyulara 12 oyuklu bir plaka gözlerine olmayan durumunu (kontrol) ekleyin veya MSC-CM: 10-1: 20.
10. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'de 24 saat ve santrifüj sonrasında splenosit CM hasat edilir.
11. imalatçının talimatlarına uygun olarak, ticari bir ELISA kiti ile interferon gamma (IFN-γ), içeriği için yeni boru ve tahlil süpernatant aktarın.

Sfero-CM Anti-kanser Potansiyeli değerlendirin 7. Prostat Kanseri Testi

1. RPMI-1640 ortamı, 10 ile takviye edilmiş olan tam RPMI büyüme ortamı hazırlamak% FBS, 1x penisilin-streptomisin.
2. LNCaP prostat kanseri hücrelerinin bir dondurulmuş şişesinden elde edilir ve 37 ° C su banyosu içinde 2 dakika süreyle flakon inkübe edin.
3. 30, motorlu bir pipet kullanarak tam RPMI büyüme ortamı ilave edildi ve 5 ml serolojik pipeti içeren bir kültür kabı içine şişenin içeriğini aktarın. çanak orta flakon birkaç kez yıkayın ve inkübatör içine çanak yerleştirin.
4. Hücreler birleşik duruma ulaştılar hemen önce, oda sıcaklığında PBS ile iki kez kültür yıkama ve önceden ısıtılmış,% 0.25 tripsin / EDTA solüsyonu, 3 ml LNCaP hücreleri ayırmak.
5. tam RPMI büyüme ortamı ile çanak tripsin nötralize ve 50 ml'lik konik tüp içine yıkar birlikte hücreleri aktarın.
6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj hücreleri ve süpernatan aspire.
7. tam RPMI büyüme ortamı küçük bir hacim içine hücrelerin yeniden askıya ve hemasitometre kullanarak kanser hücrelerini saymak.
8. durumunu olmayan ya da küremsi-CM% 25 içeren tam RPMI büyüme ortamı 120 ul / oyuk 5000 hücrede 96-yuvalı tabak içine LNCaP hücreleri aktarın. 72 saat inkübatörde inkübe edin.
9. Hücre proliferasyon deneyi kiti kullanılarak hücre büyüme deneyi yapmak için, havuzdan alınan ortam aspire bir dondurucu (-80 ° C), en az 3 saat içinde plaka aktarın.
   1. plaka çözülme ve iyi 180 mM NaCl, 1 mM EDTA ve 0.2 mg / ml RNase A ihtiva eden hücre liziz reaktifi 100 ul ekleyerek her hücreleri lize
   2. Standart bir eğri için, LNCaP hücrelerinin lize bilinen miktarları, yukarıda tarif edildiği gibi.
   3. 1 saat sonra, 1 içeren 1x hücre parçalama tampon 100 ul: Hücre çoğalma tahlili tepkin maddesi 100 seyreltme ve hücre miktarını belirlemek için, her bir gözündeki floresans ölçümü.

Bozulmamış küremsi 8. intraperitoneal teslim

1. (Protokolü 2) ve tekrar süspansiyon t yukarıda tarif edildiği gibi küremsi MKH'lerin hazırlayınO XF koşulları sağlamak için 0.2-0.5% HSA ile takviye edilmiş steril Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde küreler. çözeltide HSA enjeksiyon sırasında plastik küre yapışmasını önlemek için yardımcı olur.
2. 15 ml konik tüpler içine 40-120 parçacıklarının aktarın ve tüpler 6 ml HBSS / HSA ekleyerek hücreleri yıkayın. küreler inmeleri için 3-4 dakika bekleyin. Her bir hayvan için sferoidlerin bağımsız konik tüp hazırlanır. Ayrıca, küremsi tutma (aşağıda 8.18) ve istenirse devri sonrası tedavi faktörlerin üretimini (aşağıda 8.19) belirlemek tahliller için parçacıklarının ilave tüpler hazırlamak.
3. Süpernatantı aspire 0.2-0.5% HSA ile desteklenmiş steril HBSS 100-200 ul parçacıklarının kaplamak ve buz üzerinde tüpler yerleştirin.
4. Kısaca indüksiyon odasında yaklaşık 2 dakika süreyle tutam parmak refleksinin kaybolması kadar% 100 oksijen içinde% 2 izofluran ile hayvan uyutmak.
5. BSL-2 dolap, dorsal Aspe içinde hayvan yerleştirinBir burun konisi yoluyla% 1.5 izofluran / oksijen karışımı sürekli akış ile, (ventral yüzü yukarı bakacak şekilde) aşağı ct.
6. antiseptik gibi% 70 alkol ile alt fare karın temizleyin.
7. 20 G intravenöz (iv) kateter kapağını çıkarın ve kateter-stiletto montaj ile intraperitoneal gerçekleştirin. fare cilt tutmak için bir elinizi kullanın ve başka bir enjeksiyon yapmak. Yaklaşık iğne ucu orta hatta doğru bakacak şekilde bir bükülü diz eklemi ve genital bölgeyi bağlayan yapay satırın ortasında enjeksiyon noktasını bulun.
   NOT: kateter-stiletto düzeneği normal iğne daha yüksek bir dirence sahiptir, bu nedenle bakım iç organlara yaralanmaya yol açabilecek karın içine çok derin iğne enjekte etmek için değil alınmalıdır. Cildin Penetrasyon ve sonra kaslar / periton zarı kateter yerleştirilmesi sırasında hissedilebilir.
8. Yavaşça kateter stiletto montaj metal kama / iğne çıkarılır. checkan, idrar ve dışkı için kama k ve atın. iğne Kan iç organ (lar) ın patlağı gösterir.
9. sıvı akışını sağlamak için enjeksiyonlar sırasında dik konumda, plastik kateter tutun.
10. 100-200 ul ucu ile bir pipet kullanılarak kateter ile steril HBSS / HSA yaklaşık 100 ul enjekte edilerek, plastik kateter doğru yerleştirilmesi kontrol edin. sıkı bir mühür oluşturan kateter şırınga adaptörünün içinde pipet ucunu yerleştirin. Yavaş yavaş periton boşluğunun içine sıvı enjekte.
    NOT: Doğru yerleştirilmiş kateter sıvı serbestçe kateterin sadece küçük ayar ile periton boşluğuna içinde akacaktır. kateterin yanlış yerleştirilmesi (deri altı veya intra-intestinal ya da böbrek gibi iğne yaralı periton organların ucu ise) direncini artırmak ve akışını azaltacaktır. Deri altına yerleştirilmesi deri altına açık bir "kabarcık" bir oluşumu ile sonuçlanacaktır.
11. t toplayınO 200 ul pipet kullanarak, HBSS / HSA (adım 8.3) 100-200 ul hazırlanan sferoidler, MSC ve yukarıda açıklandığı gibi kateter yoluyla periton boşluğuna kürelerin tüm hacmi (40-120 küre) aktarın.
12. herhangi bir kalıntı parçacıklarının toplanması ve periton boşluğu içine enjekte etmek için, yukarıdaki ile aynı ucunu kullanarak HBSS / HSA 100 ul küreleri içeren tüp yıkayın.
13. (İsteğe bağlı) kateteri yıkamak için periton boşluğuna HBSS / HSA ilave 100 ul enjekte edilir.
14. kateter üzerinde antiseptik batırılmış gazlı bez yerleştirin ve yavaş yavaş periton boşluğuna kateter kaldırmak ve atın.
15. Yavaşça küremsi eşit dağılımını sağlamak için parmakları ile periton boşluğuna masaj yapın.
16. Hayvan yakın gözetim altında kurtarmak ve enjeksiyon yerinde kanama izleyelim.
17. Kalan sferoidler için kateter ve 15 ml tüp kontrol edin. Birkaç küreler gözlemlemek normaldirKateter / tüp.
    Not: MSC sfero teslimat için tarif edilen teknik, normal hayvanlarda ya da yaralanma modellerinin çeşitli kullanım için kabul edilebilir. Bu teknik, başarılı bir şekilde fare korneal hasarı ve endotoksemi modellerinde parçacıklarının enjekte yanı sıra zimosan ile indüklenen peritonit modelinde ^8'de kullanılmıştır.
18. (Isteğe bağlı) tutulan sferoidler sayısını ölçmek için, bir DNA tabanlı hücre sayısı ölçümü kiti / reaktifi kullanın. 15 ml tüp üzerinde kullanılan kateter tutun ve şiddetle geri 15 ml tüp içine kalan küreler zorlamak için kateter yoluyla HBSS / HSA dağıtmak.
    1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 xg'de 15 ml tüp santrifüj ve süpernatan aspire. bir dondurucu (-80 ° C) en az 3 saat içine sfero pelet içeren tüp aktarın.
    2. tüp çözülme ve 180 mM NaCI, 1 mM EDTA ve 0.2 mg / ml RNase A ihtiva eden hücre liziz reaktifi 500 ul ekleyerek küreler lize
    3. Bir kontrol, freeze ve lize yukarıda tarif edildiği gibi (tek bir enjeksiyon için hazırlanan parçacıklarının sayısı tercihen eşdeğeri) parçacıklarının bilinen bir miktarı.
    4. kit hücre proliferasyon deneyi reaktif 1:50 seyreltme ihtiva 1x hücre parçalama tampon 100 ul 1 saat sonra, 96-çukurlu, iki kopya halinde, hücre lizatı, 100 ul transfer ve her oyuğuna ilave edin. 10 dakika sonra, kontrol numunesi ile deney örnek (ler) karşılaştırılması ile enjekte değil küre sayısını belirlemek için, her bir gözündeki floresans ölçümü.
19. transfer küreler tarafından üretilen PGE2 konsantrasyonu ve TSG6 ölçerek (isteğe bağlı) enjeksiyon için hazırlanan sferoidler aktivasyon düzeyini değerlendirir. Aktarım% 2 FBS ve 1 x penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş 1 ya da 2 ml αMEM ihtiva eden bir 12-gözlü ya da 6-çukurlu plaka, yukarıda tarif edildiği gibi kateter yoluyla 40-120 küreler. 6 saat süreyle inkübatör tabak yerleştirin.
    1. dan orta aktarınKuyular 1.5 ya da 15 ml tüpler içinde 6 saat sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj tüpleri.
    2. Oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca 10,000 x g'de bir pipet ve santrifüj kullanılarak yeni bir 1.5 ml tüpler içinde hücresiz süpernatant aktarın.
    3. üreticinin talimatlarına göre bir ticari ELISA kiti kullanılarak PGE2 konsantrasyonu (CM anti-inflamatuar potansiyelinin iyi bir göstergesi) için yeni 1.5 ml tüpler ve tahlil açıklık CM (süpernatant) aktarın. TSG6 konsantrasyonu yayınlanmış bir protokol ¹⁴ kullanılarak belirlenebilir.

Sonuçlar

Geçerli çalışmada, asılı damla kültürleri kompakt küresel mikro-doku veya XF koşullarında aktive MKH 'sferoidler' üretmek için kullanılmıştır. Şekil 1'de araştırma yol haritası MKH kendini monte etmek için teşvik edilir sferoidler veya CM küre kaynaklı tedavi edici faktörler ile yüklenen sonra 72 saat için damla asılı asılı zaman sferoidlerde içine alınabilir ve potansiyel hem de kullanılan bu tasvir araştırma ve klinik uy...

Tartışmalar

Bazı araştırmalar ve klinik uygulamalarda kullanım için uygun MSC çok onların yarar en üst düzeye çıkarmak için aktif, ve tercihen FBS olarak ksenogeneik ortam bileşenlerinden potansiyel antigenlerin gönderimini en aza indirmek için, kimyasal olarak tanımlanmış XF koşullar altında hazırlanmalıdır. Burada anlatılan protokollerin olarak,: 1) için yöntemler göstermiştir parçacıklarının oluşumuyla 3D kültür MKH'lerin aktive 2) XF koşullar altında MSC 3D aktivasyonuna ulaşırlar, 3) ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling