제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관

요약

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

초록

중간 엽 줄기 / 간질 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 생명 공학 및 재생 의학에 큰 약속을 개최합니다. 중간 엽 줄기 세포는 조직 배양 플라스틱에 강한 접착을 통해 다수의 성인 조직으로부터 분리 한 후, 추가 가장 일반적으로 소 태아 혈청 (FBS)을 사용하여, 시험 관내에서 확장 될 수있다. FBS는 중간 엽 줄기 세포는 면역 원성가 발생할 수 있기 때문에, MSC 문화에서의 존재는 세포의 모두 임상 및 실험 응용 프로그램을 제한합니다. MSC 문화에 대한 따라서 연구는 화학적으로 채용하는 이종없는 (XF) 미디어는 매우 가치가있다. 중간 엽 줄기 세포의 많은 이로운 효과는 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6) 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)로 주로 면역 인자의 분비를 통해 염증 및 면역 조절 능력에 기인하고있다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포는 이러한 요소를 생성하도록 활성화를 요구하고 중간 엽 줄기 세포의 효과는 종종 일시적이므로, 큰 관심은 세포 프리 오 미리 활성화시키는 방법을 발견하는 등장자신의 사용에 대한 연구, 따라서 생체 내에서 활성화에 대한 지연 시간을 제거. 여기에서 우리는 3 차원 (3D) 문화에서 효율적으로 작동하는 프로토콜이나 주요 중간 엽 줄기 세포를 제시 화학적으로 XF 조건 및 생체 내에서 이러한 사전 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 관리하는. 특히, 우리는 먼저 XF 매체를 이용하여 구형 MSC 마이크로 조직이나 매달려 방울의 '타원체'를 생성하고 분야와 에어컨 매체 (CM)는 다양한 애플리케이션에 수확 할 수있는 방법을 보여주기 위해 방법을 설명합니다. 둘째, 유전자 발현 화면 설명 및 시험 관내 기능 분석을 신속하게 세포의 항 염증 및 항암 가능성을 강조 타원체 MSC의 활성화 수준을 평가. 셋째, 생체 내 효능을 시험하기위한 마우스 복강 내로 그대로 MSC의 구 상체를 분사하기위한 신규 한 방법을 설명한다. 전반적으로, 프로토콜은 여기에 화학적으로 XF 콘에서 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 얻는 주요 문제를 극복ditions 및 치료에 대한 MSC의 타원체를 관리 할 수있는 유연한 시스템을 제공합니다.

서문

중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 다양한 재생 의학 접근 방식에 대한 큰 잠재력을 보여 주었다. 중간 엽 줄기 세포는 초기 골수 간질 성분으로서 단리되었지만 사람의 지방 조직의 ^{1, 2, 3을} 포함하여 다수의 다른 성인 조직으로부터 수득 하였다. 흥미롭게도, 메인 분리 방법은 중간 엽 줄기 세포의 현저한 재산권 소 태아 혈청 (FBS)의 존재하에 조직 배양 플라스틱에 단단히 부착 품은. 전통적인 분리 기술은 2 차원 배양의 MSC 쉽고 신속한 팽창을 허용하는 동안, 그것은 ^오도 매우 인위적인 중요한 세포 특성이 ^(4)의 전위 손실로 이어지는 기본 3 차원 환경의 중요성을 무시 ^6. 따라서, 3D 문화에서 중간 엽 줄기 세포의 연구하는전통적인 2D 문화보다 더 생리있다 "손실 / 감소"MSC 특성에 대한 검색에 등장했다. 또한, 관심 임상 응용 프로그램에 대한 세포가 더 순종하게하여 MSC 문화 활성화를 위해 이종없는 (XF) 화학적으로 정의 된 조건을 식별하고 상승했다.

많은 연구는 생체 재료 및 구형 집합체 또는 회전 타원체로 모두 중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양을 보여주는 발표되었다. 중간 엽 줄기 세포의 타원체 배양 전임상 또는 임상 시험에서의 치료를위한 세포의 투여 후 생체 내에서 MSC 동작을 이해하는 방법으로 보였다 반면 생체 재료의 중간 엽 줄기 세포는 초기 셀 시드 지지체에 손상된 조직을 대체하는 조직 공학 방법을 위해 설계된 ^{4, 5, 7.} 흥미롭게도, 중간 엽 줄기 세포의 형태 타원체는 자발적으로 조직 배양 플라스틱에 부착이 허용되지 않는 경우^{8, 9, 10.} 전통적으로, 세포 응집은 스피너 플라스크 방법 또는 액체 오버레이 기술, 종양 미세 환경을 모방하려고 노력 암 생물학에서 처음 사용 된 방법에 의해 촉진되었다. 최근 추가 방법은 배양 접시에서 세포 응집 세포 간 접착 수지 ^{4, 5, 6을} 방지하기 위해 특정 화학 물질로 미리 코팅 된 표면이 보여왔다. MSC의 타원체를 생성하는 가장 간단하고 경제적 인 방법 중 하나는 종종 배아 줄기 세포로부터 배아 체를 생성하기 위해 사용 된 기법에 매달려 방울 배양 그들이다. 드롭 배양 기술을 걸려, 조직 배양 플라스틱에 대한 세포 부착은 세포 aggreg을 용이하게하기 위해 중력을 조직 배양 접시 뚜껑의 밑면에 중간 방울에 세포를 현탁하고시킴으로써 방지드롭의 정점에 ATION. 회전 타원체 크기 용이 세포 농도 또는 액적 부피 변화를 제어하는 ​​것이 특히 용이 매달려 드롭 배양함으로써 조작 될 수있다.

중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양에 대한 초기 연구는 2D 대응 ^{6, 8, 9에} 비해 3 차원 셀의 특성 라디칼 차이를 보였다. 동시에, 보고서는 생체 내에서 중간 엽 줄기 세포의 유익한 효과는, 응답, 마이크로 환경 단서에 의해 활성화 될 항염증제 및 면역 ^{11 요인을} 생성하는 능력에 의존하고 있음을 보여 주었다. 흥미롭게도, 예컨대 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 종양 괴사 인자 - 자극 된 유전자 6 (TSG6), 및 간세포 성장 인자 (HGF) 등이 요인의 많은위한 방법을 포장 전통적인 2D 엽 줄기 세포보다 MSC의 타원체에 의해 훨씬 더 많은 양으로 생산되었다 아이디어세포를 ^{8, 12, 13를} 활성화 차원 배양을 사용. 또한, 3D 배양에서 유전자 활성화는 마우스 ^(12)에 주입 한 후 세포 활성의 적어도 일부분 메커니즘 요점을 되풀이 나타났다. 생체 내에서 전통적인 MSC 효과는 종종 과도 지연 및 "뺑소니"로 설명 될 수있다 같은 실험들은 사용 전에 중간 엽 줄기 세포를 활성화시킴으로써, 세포의 장기간 효과는보다 두드러 수있다. 지난 몇 년 동안, MSC의 타원체를 사용하는 중요한 기능 연구는 염증 반응을 억제하며 타원체를 준비하는 중간 엽 줄기 세포 ^(2)의 매력적인 양식을 대 식세포, 수지상 세포, 호중구 및 T 세포와 같은 효과기 세포 영향에 의해 생체 내에서 면역성을 조절할 수 있음을 입증 ^3. 또한, int와 같은 항암 분자의 제조erleukin-24 (IL-24) 및 종양 괴사 인자 관련 세포 사멸 유도 리간드 (TRAIL)는, 중간 엽 줄기 세포를 단일 층에 중간 엽 줄기 세포의 상대 3D 문화에 표적 암 치료 ^{8, 10, 14} 악용 될 수있는 현상을 증가한다.

기존의 MSC 문화 조직 배양 플라스틱뿐만 아니라 FBS의 사용뿐만 아니라 필요에 따라 임상 극복 할 수 있었다위한 또 다른 장애물은 MSC의 회전 타원체보다 의무 확인합니다. 이 장애물을 해결하기 위해 최근에 특정 화학적 XF 조건 MSC의 구 상체의 형성을 보였다 얻어진 MSC의 구 상체는 FBS ^(14)의 조건에서 발생되는 회전 타원체와 같은 항염증제 및 항암 성 분자를 생성하기 위해 활성화되었는지 세웠다. 여기서, 이러한 결과는 XF를 이용하여 3 차원 배양에 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 생성을 보여주는 몇 가지 상세한 프로토콜에 제시미디어. 또한, 프로토콜은 함께 마우스에 그대로 타원체를 전달하는 실제적인 방법으로 그들의 항 염증, 면역 조절 및 항암 효과에 관해서는 상기 중간 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가하기위한 효과적인 방법을 설명이 제시된다.

프로토콜

1. MSC의 분리 및 확장

1. 초기 통로 준비를 위해 센터에서 중간 엽 줄기 세포와 성체 줄기 세포 (배포 구하는 http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) ¹⁵ 냉동 튜브를. 또한, 일상적인 프로토콜 ^14을 다음과 골수 흡인에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하고 냉동 튜브를 저장합니다.
2. 최소 필수 배지 (αMEM가) FBS, 2 mM L- 글루타민을 선택 15~20% 프리미엄 보충 알파 및 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신이다 완전한 배양 배지 (CCM)를 준비합니다. 여과에 의해 배지를 멸균.
3. 150mm 세포 배양 접시에 CCM 30 ㎖에 넣고, 5 % CO _2를 포함하는 가습 인큐베이터에서 37 ° C에서 30 분 동안 요리를 배양한다.
4. 37 ° C의 물을 욕조에 2 분 동안 약 10 ⁶ 엽 줄기 세포를 포함하는 냉동 병을 품어.
5. 5 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여 배양 접시에 바이알의 콘텐츠를 전송하고, 잔류 세포를 포착 접시에서 1-2 ML의 CCM과 함께 바이알 수회 세척 하였다. 적절한 인큐베이터에서 접시 하룻밤을 놓습니다.
6. 조심스럽게 실온 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 씻어 배양 및 미리 예열 0.25 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 3 mL로 중간 엽 줄기 세포를 분리. 분리는 일반적으로 인큐베이터에서 약 3 ~ 4 분 소요됩니다.
7. 6 ml의 CCM 사전 예열 37 ° C와 함께 접시에 트립신을 중화하고 50 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 세포 수율을 최대화하기 위해 PBS의 세척과 결합합니다.
8. 실온에서 10 분 동안 세포 (450 XG)을 원심 분리하여 상층 액을 흡인.
9. CCM의 소량의 셀을 다시 중지하고 혈구 및 트리 판 블루를 사용하여 생존 세포 수를 계산.
10. 100 세포 / cm ^2에서 150mm 요리의 적절한 수의 종자 따뜻한 CCM의 30 용액에 약 70-80% 합류 할 때까지 문화를 품어, 보통 칠일.
11. 트립신 / EDTA와 같은 상기 세포를 수확하고, 적절한 매질과 하나의 원뿔형 튜브에있는 모든 셀을 결합한다. 다시 원심 분리기 및 세포 수에 대한 동일한 매체의 작은 부피로 세포를 다시 일시. 표준 CCM (FBS 함유) 또는 다양한 시판 XF 매체 제형을 사용하여, 여기에 인간 혈청 알부민없이 모두 XF 매체 -1- (XFM-1) 및 XF 매체 -2- (XFM-2)라고 함 (HSA 13 ㎎ / ㎖) 보충.

XF 조건에 따라 드롭 문화 매달려 3-D의 활성화 MSC 타원체 2. 준비

1. 약 25,000 세포의 타원체를 생성하기 위해 CCM으로 수확 된 중간 엽 줄기 세포, XFM-1 XFM-1 + HSA (13 ㎎ / ㎖) XFM-2 또는 XFM -2- + HSA 714 세포에 (13 ㎎ / ㎖)에 희석 / μL.
2. 세포의 피펫 35 μL은 / 방울 상150mm 반전 배양 접시 뚜껑의 밑면. 여러 상품을 쉽게 멀티 채널 피펫을 사용하여 피펫 팅 할 수있다.
   주 : 크거나 작은 회전 타원체이 요구되는 경우, 세포 농도 또는 적절하게 방울 체적 (25-45 μL)을 변경.
3. 요리의 기본으로 실온 PBS 20 ㎖를 전송하고 하나의 연속 꾸준한 운동의 드롭의 정점이 아래에 직면 그래서, 방울을 포함, 뚜껑을 뒤집습니다. 배양 접시의 기초에 조심스럽게 뚜껑을 놓습니다.
4. 해당 분야의 조립을 허용하는 데 방해없이 3 일 동안 인큐베이터에 접시를 전송합니다.
5. 72 시간 후, 조심스럽게 뚜껑을 제거하고 방울, 다시 한 번 상승에 직면 있도록 반전하여 회전 타원체 수확을 시작합니다.
6. 각도를 대략 10 ~ 20 °까지 뚜껑이 셀 리프터를 사용하여 접시 가장자리는 타원체를 함유 방울을 누른다.
7. 1,000 μL 파이프와 15 ML 원뿔 튜브에 분야 및 매체로 이동TTE. 사용 방 온도 PBS와 접시를 씻어 회전 타원체의 최대 복구를 보장하기 위해 같은 팁 피펫.
8. 실시간 PCR 분석 (프로토콜 3)의 경우, 실온에서 5 분 동안 450 XG에서 구 현탁액을 원심 분리하여 상층 액을 흡인. PBS로 회전 타원체를 세척하고 모두 원심 분리 및 흡입 단계를 반복합니다. 동물로 전달 (프로토콜 8)의 경우, 구 원심 분리하지 않고 튜브 (~ 3-4 분)의 바닥에 정착 할 수 있습니다.

항 염증 및 항암 마커 3. 실시간 PCR

1. DNA 무료 총 단층 중간 엽 줄기 세포에서 RNA (프로토콜 1)과 PBS로 세척하고 원심 분리 MSC의 회전 타원체 (프로토콜 2)를 분리 균질 열 및의 RNase없는 DNase의 세트와 RNA 추출 키트를 사용합니다.
2. 를 Lyse 적어도 10 만 단층 중간 엽 줄기 세포 분리 15 ml의 각 조건에서 20 회전 타원체 RLT 버퍼가 β-머 캅토 에탄올 (1 : 100)를 포함와 원뿔 튜브.
3. 트랜스1.5 ml의의 RNase없는 튜브로 철저하게 혼합 해물을 FER 및 회전 타원체 용해에 도움이 냉동실 (-80 ° C) 적어도 3 시간에 배치합니다.
4. 간단히 얼음, 소용돌이의 세포 용 해물을 해동하고, 시중에서 판매하는 포유류 총 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA 분리에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
5. 정량화 분광 광도계를 사용하여 격리 된 RNA의 품질을 평가한다.
6. 실시간 PCR에의 cDNA를 생성하는 제조업체의 지침에 고용량 cDNA를 역전사 키트 또는 동등 따라 사용합니다.
7. 얼음의 cDNA 샘플, 상업적으로 설계된 실시간 PCR 프라이머 / 프로브 (유전자 발현 분석 실험) 및 PCR 마스터 믹스를 놓습니다. GAPDH (대조) PTGS2 (COX-2, 항 염증)에 대한 프라이머 / 프로브를 사용 TNFAIP6 (소염 TSG6), TRAIL (항암) 및 IL-24 (항암).
8. 유전자 발현 분석법 및 고속 Unive 대한 제조자의 지시에 따라 실시간 PCR 반응을 준비rsal 마스터 믹스.
9. 실험 문서를 생성하고 실행을 수행하기위한 실시간 PCR 장비에 대한 지침을 따르십시오.
10. 기준선 ^{8, 14와} 내인성 제어 및 중간 엽 줄기 세포 단층으로 GAPDH를 사용하여 유전자 발현에서의 상대적인 변경 (상대적인 양 RQ)를 계산하여 ΔΔC _{T 방식을} 사용하여 데이터를 분석한다.

면역의 분석 실험 및 안티 - 암 가능성에 대한 CM 4. 컬렉션

1. 그러나, 셀 리프터과 피펫을 사용하여, 15 ML 원뿔 관에 상술 한 바와 같이이이 형상을 희석되므로 PBS로 접시의 뚜껑을 세척하지 마십시오 회전 타원체와 CM을 수확.
2. 조심스럽게 피펫으로 무 세포 상층 액을 수집하고, 실온에서 5 분 동안 450 × g으로 원심 분리하고, 1.5 ㎖의 튜브에 상청을 전송.
3. 조심스럽게 카스티를 수집, 실온에서 5 ~ 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기arified 피펫과 CM, 그리고 냉동실에 저장을 위해 새로운 1.5 ml의 튜브에 CM을 전송 (-80 ° C). 여러 분석을 위해 그것을 사용하는 경우 이전에 동결에 CM의 분취 량을 준비합니다.
   주 : 앞서 하류 분석을 수행하는, PGE2 농도, CM의 항 염증 가능성을 보여주는 좋은 지표가 제조자의 지시에 따라 시판 ELISA 키트를 사용하여 결정될 수있다. TSG6 농도는 발표 프로토콜 ^(14)을 사용하여 결정될 수있다.

5. 대 식세포 분석은 MSC-CM의 항 염증 가능성을 평가하는

1. L- 알라 닐 -L- 글루타민을 함유 FBS 및 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신을 선택한 10 %의 프리미엄이 보충 된 둘 베코 개변 이글 배지 (DMEM)로 구성 식세포 매체를 준비한다. 필터 - 소독 매체를.
2. 약 10 ⁶ J774 마우스 대 식세포의 고정 된 유리 병을 얻어 37 ° C의 물을 욕조에 2 분 동안 병을 품어.
15 ml의 원추형 튜브에 바이알의 내용물을 이동 200-300 XG에 실온에서 5 분 동안 식세포 매체 및 원심 분리기 (9)를 가하여.
3. , 뜨는을 대기음 대식 세포 배지 1 ㎖에 대 식세포를 일시 중단하고, 대 식세포 매체의 30ml를 포함하는 150mm 배양 접시에 대 식세포를 전송합니다.
4. 매 2 일 매체를 변경하고 약 70-80% 합류 할 때까지 인큐베이터에서 세포를 배양한다.
   참고 : 대 식세포 따라서 매체 변화에 세포를 잃지 않도록주의해야한다 케어, 페트리 접시에 단단히 부착되지 않습니다.
5. 피펫으로 세포에 대 식세포 매체를 분사하여 대 식세포를 수확. 200-300 XG 실온에서 5 분 동안 50 ml의 원추형 원심 튜브에 세포를 옮긴다.
6. 뜨는을 기음과 혈구와 세포 수에 대한 대 식세포 매체의 소량의 세포를 일시 중지합니다. 식세포 나와 200,000 세포 / ml로 농도를 조정dium.
7. 의 대 식세포 분석에 대해 설정 시작 12 웰 플레이트의 우물에 대 식세포 매체의 480 μl를 추가합니다.
8. 비 자극 제어 우물에 대 식세포 매체의 20 μl를 추가하고 20 μl의 비 조절 또는 매체 MSC 에어컨, 실험 우물에서, 상기 제조. 판을 눌러 우물에서 매체를 섞는다.
9. 비 - 자극 된 대 식세포 대조군 웰에 대식 세포 현탁액 500 μl를 옮긴다.
10. 500-1 : 1 첨가 나머지 식세포를 자극 1000 0.1 / ㎖ 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 및 ㎎을 실온에서 50-10 분 동안 배양한다.
11. 에어컨 비 또는 MSC 에어컨 매체와 우물에 자극 식세포의 500 μl를 전송합니다. 지속적으로 접시를 여러 번 흔들어 우물을 섞는다.
12. 16 ~ 18 시간 동안 인큐베이터에 접시를 전송합니다.
13. 실온에서 5 분 동안 500 XG의 식세포 조정 배지 원심 수확.
14. 이전제조자의 지시에 따라 상용 ELISA 키트에 의해 종양 괴사 인자 - 알파 (TNF-α) 및 인터루킨 -10 (IL-10)의 컨텐츠에 대한 새로운 튜브 및 분석에 뜨는.

6. 비장 분석은 회전 타원체-CM의 면역 잠재력을 평가하는

1. Rosewell 파크 메모리얼 연구소 (RPMI), 10 % 열 - 불 활성화 FBS, 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신으로 보충 -1640 배지 및 2- 메르 캅토 에탄올로 구성되어 전체 비장 세포 배지를 준비한다. 필터 - 소독 매체를.
2. 비장을 통해 복부의 왼쪽에 제조 된 절개를 통해 안락사-남성 BALB / c 마우스에서 수확 비장, 약 전면 사이의 중간 방식과 다리 ⁽¹⁴⁾ 뒷다리. 비장 세포 ^(14)을 분리하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너에 비장을 전송합니다.
3. 멸균 페트리 접시 날기에 70 μm의 스트레이너를 통해 비장을 밀어 비장 세포 / 림프구를 분리g 2-3에서 플런저의 부드러운 고무 / 플라스틱 끝 ⁽¹⁴⁾ 주사기 ㎖로. 비장을 떼어 놓다하기 위해 연마 원형 모션을 사용합니다.
4. 차가운 PBS로 세포 스트레이너를 여러 번 세척하고 50 ML 원뿔 튜브에 페트리 접시에서 세포를 전송합니다. 10 분 동안 4 ° C에서 차가운 PBS와 원심 분리기 (500 XG)와 튜브를 입력합니다.
5. 뜨는을 기음과 5 ~ 10 분 (비장 당) 5 ~ 10 ml의 적혈구 세포 용해 용액으로 배양하여 적혈구에서 세포를 취소합니다.
6. 500 XG에 5 ~ 10 분 동안 4 ° C에서 튜브와 원심 분리기에 차가운 PBS를 추가하여 용해를 중지합니다.
7. 완전한 비장 세포 배지에서 분리 된 세포를 일시 40 ㎛의 여과기를 통하여 여과하고 혈구 세포를 사용하여 계산. ¹⁰⁶ 세포 / ml의 최종 세포 농도를 달성하기 위해 세포 현탁액에 비장 매체 추가
   참고 :이 기술은 일반적으로 마우스의 비장 당 약 3 × 10 ⁷ 비장 세포를 얻을 수 있습니다.
8. 5 분 동안 2 μg의가 / ㎖ 안티 CD3e 항체로 비장의 해당 번호를 자극한다.
   주 : 비장 세포의 양이 요구는 연구자에 의해 결정된 실험 조건의 수에 의존한다 (단계 6.9 참조). 모든 실험 샘플 / 웰, 10 ⁽⁶⁾ 비장 세포가 필요합니다.
9. 이전 10 ⁶ 비장 세포 (자극 또는 비 자극) (1)의 최종 희석 우물로 12 웰 플레이트의 우물에 비 조절 (컨트롤)을 추가하거나 MSC-CM : 10-1 : 20.
10. 실온에서 5 분 동안 500 × g으로 24 시간 원심 후 비장 CM 수확.
11. 제조업체의 지침에 따라 상업 ELISA 키트에 의해 인터페론 감마 (IFN-γ) 콘텐츠에 대한 새로운 튜브 및 분석에 뜨는을 전송합니다.

회전 타원체-CM의 안티 - 암 잠재력을 평가 7. 전립선 암 분석

1. RPMI-1640 배지 (10)로 보충된다 완전한 RPMI 성장 배지를 준비% FBS, 1X 페니실린 - 스트렙토 마이신.
2. 된 LNCaP 전립선 암세포의 냉동 바이알을 수득하고, 37 ℃의 수욕에서 2 분 동안 바이알을 배양한다.
3. 30 전동 피펫을 이용하여 완전 RPMI 성장 배지 ㎖의 5 ml의 피펫 혈청을 함유 한 배양 접시에 바이알의 내용물을 이동. 접시에서 매체 유리 병 여러 번 세척하고 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
4. 세포가 포화 상태에 도달하기 직전에 실온 PBS로 두 번 세척하고 배양을 미리 예열 0.25 % 트립신 / EDTA 용액 3 mL로 된 LNCaP 세포를 분리.
5. 완전한 RPMI 성장 배지 디쉬에 트립신을 중화하고, 50ml의 원뿔형 튜브에 세제와 함께 세포를 옮긴다.
6. 실온에서 10 분 동안 450 XG에서 세포를 원심 분리하고 상층 액을 흡인.
7. 완전한 RPMI 성장 배지의 작은 부피로 세포를 다시 중지하고 혈구를 사용하여 암세포를 계산.
비 조절 또는 타원체-CM의 25 %를 함유하는 완전 RPMI 성장 배지 120 μL에 / 웰 5,000 세포로 96- 웰 접시로 된 LNCaP 세포를 옮긴다. 72 시간 동안 인큐베이터에 품어.
8. 세포 증식 분석 키트를 사용하여 세포 성장 시험을 수행하기 위해, 웰로부터 배지를 흡인하고, 냉동 (-80 ℃)에 대한 적어도 3 시간에 플레이트를 옮긴다.
   1. 플레이트를 해동하고 잘 180 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.2 ㎎ / ㎖의 RNase A를 포함하는 세포 용해 시약 100 μL를 첨가하여 각 세포를 용균
   2. 표준 곡선 들어 된 LNCaP 세포를 Lyse 알려진 양 전술 한 바와 같이.
   3. 1 시간 후, 1X 함유 한 세포 용해 완충액 100 ㎕를 추가 세포 증식 측정 시약 100 희석하고 셀 크기를 결정하기 위해 각 웰에서의 형광을 측정한다.

본래 타원체의 8 복강 내 배달

1. (프로토콜 2)에 resuspend의 t 전술 한 바와 같이 회전 타원체 중간 엽 줄기 세포를 준비그는 XF 조건을 유지하기 위해 0.2 ~ 0.5 % HSA 보충 무균 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)에 분야. 솔루션에서 HSA 사출시 플라스틱에 구 부착을 방지하는 데 도움이됩니다.
2. 15 ML 원뿔 튜브에 40-120 회전 타원체를 전송하고 튜브에 6 ml의 HBSS / HSA를 추가하여 세포를 씻으십시오. 구가 하강하는 3-4 분을 허용합니다. 각 동물에 대한 타원체의 독립적 인 원뿔 튜브를 준비합니다. 또한, 회전 타원체 유지 (아래 8.18 참조) 원하는 경우 전송 후 치료 요인의 생산 (아래 8.19 참조) 결정 분석에 대한 타원체의 추가 튜브를 준비합니다.
3. , 뜨는을 대기음 0.2 ~ 0.5 % HSA 보충 무균 HBSS의 100 ~ 200 μL와 타원체를 오버레이하고, 얼음에 튜브를 배치합니다.
4. 간단히 유도 챔버에서 약 2 분 동안 핀치 발가락 반사의 소실 될 때까지 100 % 산소의 2 % 이소 플루 란과 동물을 마취.
5. BSL-2 장, 지느러미 ASPE 내부에 동물을 배치코 콘을 통해 1.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합물의 연속적인 흐름으로, (복부면이 위를 향하게) 아래 ct는.
6. 방부제와 같은 70 % 알코올로 낮은 마우스의 복부를 청소합니다.
7. 20 G의 정맥 주사 (IV) 카테터의 캡을 제거하고 카테터 스틸 어셈블리와 함께 복강 내 주사를 수행합니다. 마우스 피부를 잡고 한 손으로 사용하고 다른 하나는 주입을 수행 할 수 있습니다. 약 바늘 끝이 중간 선을 향해 가리키는와 근육이 수축 무릎 관절과 생식기 지역을 연결하는 인공 라인의 중간에 주입 지점을 찾습니다.
   참고 : 카테터 스틸 어셈블리는 일반 바늘보다 더 높은 저항을 가지고, 따라서 치료는 내부 장기에 부상을 입을 수있는 복부에 너무 깊이 바늘을 주입하지으로 간주되어야한다. 피부의 침투 후 근육 / 복막는 카테터를 배치하는 동안 느낄 수 있습니다.
8. 부드럽게 카테터 스틸 어셈블리에서 금속 스틸 / 바늘을 제거합니다. CHEC혈액, 소변 및 대변의 스틸을 K와 폐기. 바늘에 피가 내부 기관 (들)의 구멍을 나타냅니다.
9. 유체 흐름을 허용하기 위해 주사하는 동안 직립 위치에있는 플라스틱 카테터를 잡습니다.
10. 100-200 μL 팁과 피펫을 사용하여 카테터를 통해 무균 HBSS / HSA의 약 100 μl를 주입하여 플라스틱 카테터의 적절한 배치를 확인합니다. 단단한 시일을 형성하는 카테터를 주사기 어댑터 내부 피펫 팁의 끝을 놓는다. 천천히 복강 내부에 유체를 주입.
    참고 : 올바른 위치에 카테터의 유체가 자유롭게 카테터의 사소한 조정과 복강 내부에 흐를 것이다. 카테터의 위치가 부적절 (피하 또는 내 장, 또는 신장 등의 바늘 부상 복막 장기의 팁 경우) 저항을 증가 흐름을 줄일 수 있습니다. 피하 배치는 피부에서 명백한 "거품"의 형성에 발생합니다.
11. t를 수집그는 200 μL 피펫 팁을 사용하여, HBSS / HSA (단계 8.3)의 100-200 μL 제조 타원체를 MSC, 상기 한 바와 같이 카테터를 통하여 복강 내로 분야의 전체 부피 (40-120 분야)를 옮긴다.
12. 잔류 타원체를 수집 복강로 주입하는 상기와 동일한 팁을 사용 HBSS / HSA 100 ㎕와 분야를 포함하는 튜브를 세척한다.
13. (선택 사항) 카테터를 씻어 복강에 HBSS / HSA의 추가 100 μl를 주입한다.
14. 카테터를 통해 살균에 적신 거즈 패드를 놓고 천천히 복강에서 카테터를 제거하고 폐기합니다.
15. 부드럽게 회전 타원체의 고른 분포를 확인하기 위해 손가락으로 복강 마사지.
16. 동물이 가까이 감독하에 복구하고 주사 부위에서 출혈을 감시 할 수 있습니다.
17. 나머지 회전 타원체의 카테터 15 ML 튜브를 검사합니다. 몇 구를 관찰하기 위해 정상입니다카테터 / 튜브.
    주 : MSC 타원체 배달 기재된 기술은 정상 동물 또는 부상 다양한 모델에서 사용하기 위해 채택 될 수있다. 이 기술은 성공적 마우스 각막 손상 및 패혈증 모델에서 타원체 주입뿐만 아니라, 지 모산 - 유도 된 복막염 모델 ^(8)에 사용되어왔다.
18. (선택)이 유지 구 상체의 수를 정량화하기 위해, DNA 기반 세포 수 정량 키트 / 시약을 사용한다. 15 ML 튜브를 통해 사용 카테터를 잡고 격렬하게 다시 15 ML 튜브에 남아있는 구체를 강제로 카테터를 통해 HBSS / HSA를 분배.
    1. 실온에서 5 분 동안 500 XG에 15 ㎖의 튜브를 원심 상청을 흡인. 냉동기 (-80 ℃)에 대한 적어도 3 시간에 구형 펠렛을 함유하는 튜브를 옮긴다.
    2. 튜브를 해동 및 180 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.2 ㎎ / ㎖의 RNase A를 포함하는 세포 용해 시약 500 μL를 첨가하여 용균 스피어
    3. 제어 fre를겔과를 Lyse 전술 한 바와 같이, (하나의 주입을 위해 준비 타원체의 수에 바람직 상당) 타원체의 알려진 양.
    4. 상기 키트에서 세포 증식의 측정 시약의 1:50 희석액을 함유하는 1X 세포 용해 완충액 100 μl를 1 시간 후, 96 웰 마이크로 플레이트에, 복제에서 세포 용 해물 100 ㎕를 전달하고 각각의 웰에 추가한다. 10 분 후, 대조 시료와 실험 샘플 (들)과 비교하여 주사하지 않은 분야의 수를 결정하기 위해 각 웰에서의 형광을 측정한다.
19. 전송 분야에 의해 생성 된 PGE2의 농도와 TSG6를 측정하여 (선택 사항) 주입을 준비 타원체의 활성화 수준을 평가합니다. 전송 2 % FBS 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신으로 보충 한 2 ml의 αMEM 함유하는 12 웰 또는 6 웰 플레이트에, 상기 한 바와 같이 카테터를 통해 40-120 분야. 6 시간 동안 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
    1. 의 매체로 이동웰을 1.5 ml의 15 튜브에 6 시간 후, 실온에서 5 분 동안 450 XG에서 튜브를 원심 분리.
    2. 실온에서 5 ~ 10 분 동안 10,000 XG에 피펫과 원심 분리기를 사용하여 신선한 1.5 ml의 튜브에 세포가없는 상층 액을 전송합니다.
    3. 제조업체의 지침에 따라 상업 ELISA 키트를 사용하여 PGE2 농도 (CM의 항 염증 가능성의 좋은 지표)에 대한 새로운 1.5 ml의 튜브와 분석에 명확히 CM (뜨는)를 전송합니다. TSG6 농도는 발표 프로토콜 ^(14)을 사용하여 결정될 수있다.

결과

현재 작업에 매달려 드롭 문화는 소형 구형 마이크로 조직 또는 XF 조건에서 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 '타원체'을 생성하기 위해 사용되었다. 그림 1의 임상 로드맵은 중간 엽 줄기 세포는 자기 조립에 권장되는 타원체, 또는 CM은 구 유래의 치료 요인로드 한 후 72 시간에 대한 방울 매달려에 현탁 때 타원체로 수집 될 수 있으며, 잠재적으로 모두 사...

토론

일부 연구 및 임상 응용에 사용하기위한 최적의 MSC는 그들의 높은 이득을 최대화하기 위해 작동하고, 우선적으로 이러한 FBS 배지와 같은 이종 성분의 잠재적 인 항원의 전달을 최소화하기 위하여 화학적 XF 조건 하에서 제조한다. 여기에 설명 된 프로토콜에서, 우리는 1) 방법을 도시 한 타원체를 형성하여 3D 배양에서 중간 엽 줄기 세포를 활성화 2) XF 조건에서 중간 엽 줄기 세포의 3D 활성화를 달?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling