Herstellung und Verabreichung von therapeutischen mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen (MSC) Sphäroiden Primed in 3-D-Kulturen unter Xeno freien Bedingungen

Zusammenfassung

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen / Stromazellen (MSCs) vielversprechend in der Biotechnik und der regenerativen Medizin. MSCs können aus mehreren adulten Geweben durch ihre starke Adhärenz an Gewebekulturkunststoff und dann expandiert weiter in vitro isoliert werden, am häufigsten fötalem Rinderserum (FBS) verwendet wird . Da FBS können MSCs verursachen immunogen zu werden, begrenzt seine Präsenz in MSC-Kulturen sowohl klinische und experimentelle Anwendungen der Zellen. Daher unter Verwendung von Studien chemisch definierte Xeno-freie (XF) Medien für die MSC-Kulturen sind äußerst wertvoll. Viele vorteilhafte Wirkungen von MSCs wurden auf ihre Fähigkeit zurückzuführen Entzündung und Immunität zu regeln, vor allem durch die Sekretion von immunmodulatorische Faktoren wie Tumor-Nekrose-Faktor-stimulierte Gen 6 (TSG6) und Prostaglandin E2 (PGE2). Jedoch erfordern MSCs Aktivierung dieser Faktoren zu erzeugen, und da die Wirkung von MSCs oft vergänglich ist, hat großes Interesse hervor Wege der Pre-Aktivierung der Zellen Prio zu entdeckenr ihre Verwendung, wodurch die Beseitigung der Verzögerungszeit für die Aktivierung in vivo. Hier präsentieren wir Protokolle effizient aktivieren oder prime MSCs in dreidimensionalen (3D) Kulturen unter chemisch XF Bedingungen definiert und diese voraktivierten MSCs in vivo zu verabreichen. Insbesondere wir zuerst beschreiben Verfahren zur sphärischen MSC Mikrogeweben oder "Sphäroide" in hängenden Tropfen unter Verwendung XF Medium erzeugen und zu zeigen, wie die Kugeln und konditioniertes Medium (CM) können für verschiedene Anwendungen geerntet werden. Zweitens beschreiben wir die Genexpression Bildschirme und in vitro funktionelle Assays , um schnell das Niveau der MSC Aktivierung in Sphäroide bewerten, die entzündungshemmende und Anti-Krebs - Potential der Zellen zu betonen. Drittens beschreiben wir ein neues Verfahren intakte MSC Sphäroide in die Maus - Peritonealhöhle für in vivo Wirksamkeitstests zu injizieren. Insgesamt überwinden die Protokolle hier großen Herausforderungen unter chemisch definierten XF con voraktivierten MSCs zu erhaltenBedingungen und bieten ein flexibles System MSC Sphäroiden für Therapien zu verabreichen.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen / Stromazellen (MSCs) sind für verschiedene regenerative Medizin Ansätze großes Potenzial gezeigt. MSCs wurden zunächst als stromal Komponente von Knochenmark isoliert wurden , da aber von zahlreichen anderen adulten Geweben erhalten worden sind , einschließlich Fettgewebe ^{1, 2, 3.} Interessanterweise umfasst der Hauptisolationsverfahren die bemerkenswerte Eigenschaft von MSCs fest auf Gewebekulturkunststoff in Gegenwart von fötalem Rinderserum (FBS) zu haften. Während dieses traditionelle Isolationstechnik eine einfache und schnelle Expansion von MSCs ermöglicht in zweidimensionalen (2D) Kultur, ist es auch sehr künstlich und mißachtet Bedeutung der nativen dreidimensionalen (3D) Umgebung zu möglichen Verlust von wichtigen zellulären Eigenschaften führende ^{4, 5 , 6.} Daher ist die Untersuchung von MSCs in 3D-Kulturen, diesind physiologische als herkömmliche 2D-Kulturen, hat für "verloren / verminderte" MSC Merkmale auf der Suche entstanden. Xeno-frei (XF) chemisch definierte Bedingungen für die MSC Kultur und Aktivierung, zu identifizieren und somit machen die Zellen besser geeignet für klinische Anwendungen Zudem hat großes Interesse gestiegen.

Viele Studien sind veröffentlicht worden, die 3D-Kultur von MSCs zeigen sowohl in Biomaterialien und als sphärische Aggregate oder Sphäroide. MSCs in Biomaterialien wurden zunächst für das Tissue Engineering Ansätze entwickelt , beschädigte Gewebe mit Zell ausgesät Gerüste zu ersetzen, während Sphäroid - Kulturen von MSCs als eine Möglichkeit gesehen wurden MSC Verhalten in vivo nach der Verabreichung der Zellen für Therapien in präklinischen oder klinischen Studien zu verstehen , ^{4, 5, 7.} Interessanterweise spontan Sphäroiden MSCs bilden sich, wenn die Einhaltung der Gewebekultur-Plastik ist nicht zulässig^{8, 9, 10.} Traditionell wurde die Zellaggregation durch Rührflasche Methoden oder flüssigen Overlay-Techniken erleichtert, Methoden zunächst in der Krebsbiologie bei den Bemühungen um zu versuchen, den Tumor-Mikroumgebung zu imitieren. In jüngerer Zeit wurden weitere Methoden taucht , die Zellaggregation in Kulturschalen vorbeschichtet mit spezifischen Chemikalien zeigen zu verhindern Zelle zu Kunststoffhaft ^{4, 5, 6.} Eine der einfachsten und wirtschaftlichsten Verfahren MSC Sphäroide zu erzeugen, ist zur Kultur sie in hängenden Tropfen, eine Technik, die häufig verwendet wurde embryoid bodies aus embryonalen Stammzellen zu erzeugen. Mit hängenden Tropfen Kulturtechnik, die Zellhaftung an den Gewebekulturkunststoff wird durch Suspendieren der Zellen in einem Tropfen des Mediums auf der Unterseite einer Gewebekulturschale Deckel verhindert und damit die Schwerkraft zu erleichtern Zelle AGGREGation in der Spitze des Tropfens. Das Sphäroid Größe kann leicht durch Ändern der Zellkonzentration oder das Tropfenvolumen manipuliert werden, Tropfen Kulturen machen hanging besonders einfach zu steuern.

Frühe Untersuchungen über die 3D - Kultur von MSCs gezeigt radikalen Unterschiede in den Eigenschaften der Zellen in 3D im Vergleich zu ihren Pendants 2D ^{6, 8, 9.} Zur gleichen Zeit zeigten Berichte , dass die vorteilhaften Wirkungen von MSCs in vivo auf ihre Fähigkeit , durch Mikroumweltreize aktiviert zu werden , verlassen und in Reaktion darauf zu erzeugen , entzündungshemmende und immunmodulierende ¹¹ Faktoren. Interessanterweise viele dieser Faktoren wie Prostaglandin E2 (PGE2), Tumor-Nekrose-Faktor-stimulierte Gen 6 (TSG6) und Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) wurde in viel größeren Mengen von MSC Sphäroide als herkömmliche 2D MSCs ebnet den Weg für das produzierte Idee vonVerwendung von 3D - Kulturen , die Zellen ^{8, 12, 13} zu aktivieren. Außerdem Genaktivierung in 3D Kulturen erschienen Mechanismen zu rekapitulieren, zumindest teilweise der Zellaktivierung nach Injektion in ¹² Mäusen. Durch die in den Experimenten MSCs vor ihrer Verwendung zu aktivieren, Auswirkungen der Zellen verlängert werden könnte , und mehr im Vordergrund als die traditionelle MSC Wirkung in vivo oft verzögert und vorübergehend, und kann als "Hit and Run" beschrieben werden. In den letzten Jahren wichtige funktionelle Studien MSC Sphäroide verwenden , haben gezeigt , dass sie Entzündungsreaktionen zu unterdrücken und zu modulieren Immunität in vivo durch Effektorzellen , wie beispielsweise Makrophagen, dendritischen Zellen zu beeinflussen, Neutrophile und T - Zellen Sphäroide eine attraktive Form grundierte MSCs ² Herstellung ^{, 3.} Zusätzlich Herstellung von Anti-Krebs-Moleküle, wie interleukin-24 (IL-24) und Tumor - Nekrose - Faktor-verwandten Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL), werden in 3D - Kulturen von MSCs relativ erhöht MSCs zu Monoschicht ein Phänomen , das für die gezielte Krebstherapien ^{8, 10, 14} ausgenutzt werden könnte.

Da die traditionelle MSC Kultur nicht nur die Verwendung von Gewebekulturkunststoff erforderlich, sondern auch FBS, auf eine weitere Hürde zugänglich MSC Sphäroiden mehr machen für die klinische Anwendung zu überwinden hatte. Um diese Hürde bewältigen, wir die Bildung von Sphäroiden MSC unter bestimmten Bedingungen chemisch definierten XF kürzlich gezeigt und festgestellt , dass die resultierenden MSC Sphäroide wurden die gleichen entzündungshemmenden und anti-Krebs - Moleküle , wie die Sphäroide in Bedingungen mit ¹⁴ FBS erzeugt herzustellen aktiviert. Hier werden diese Erkenntnisse in mehreren ausführlichen Protokolle vorgestellt, die die Erzeugung von voraktivierten MSCs in 3D-Kulturen unter Verwendung von XF zeigenMedien. Außerdem werden Protokolle vorgestellt, die effektivsten Möglichkeiten, beschreiben die Aktivierungsstufen der MSCs in Bezug auf ihre entzündungshemmende, immunmodulierende und Anti-Krebs-Wirkung, zusammen mit einem praktischen Verfahren zur Beurteilung der intakten Sphäroiden in Mäuse zu liefern.

Protokoll

1. MSC Isolierung und Expansion

1. Erhalten frühen Passage MSCs von Zentrum für die Vorbereitung und Verteilung von adulten Stammzellen ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) ¹⁵ als gefrorene Fläschchen. Alternativ isolieren MSCs aus Aspiraten Knochenmark eine Routine - Protokoll nach dem ^14. und speichern , wie gefrorene Fläschchen.
2. Bereiten komplettem Kulturmedium (CCM), die minimal essential medium alpha (& agr; MEM), ergänzt mit 15-20% Aufschlag wählen FBS, 2 mM L-Glutamin und 1x Penicillin-Streptomycin. Sterilisieren des Mediums durch Filtration.
3. Platzieren 30 ml CCM in eine 150 mm Zellkulturschale und inkubiere die Schale für 30 min bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
4. Inkubiere die gefrorene Ampulle etwa 10 ⁶ MSCs für 2 min in einem 37 ° C Wasserbad enthält.
5. Übertragen Sie den Inhalt des Fläschchens in die Kulturschale eine 5 ml serologische Pipette und waschen Sie die Fläschchen mehrmals mit 1-2 ml CCM aus der Schale Restzellen zu erfassen. Die Schale über Nacht in einem geeigneten Inkubator.
6. werden gründlich Kultur zweimal mit Raumtemperatur phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und die MSCs mit 3 ml Trypsin / (EDTA) -Lösung vorgewärmten 0,25% abnehmen. Detachment dauert in der Regel ca. 3-4 min im Inkubator.
7. Neutralisieren Sie die Trypsin in der Schale mit 6 ml CCM vorgewärmt auf 37 ° C und übertragen Sie die Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen. Kombinieren Sie mit Waschungen mit PBS Zellausbeute zu maximieren.
8. Zentrifugation der Zellen (450 · g) für 10 min bei Raumtemperatur und den Überstand aspirieren.
9. Wieder die Zellen in einem kleinen Volumen von CCM und zählen Sie die lebenden Zellen ein Hämozytometer und unter Verwendung von Trypanblau.
10. Seed eine entsprechende Anzahl von 150 - mm - Schalen bei 100 Zellen / cm ² In 30 ml warmem CCM und die Kulturen bis zur Konfluenz etwa 70-80% inkubiert, normalerweise 7 Tage mit Medium alle 2-3 Tage und 24-48 h vor der Ernte ändert.
11. Ernten Sie die Zellen wie oben beschrieben mit Trypsin / EDTA und vereinen alle Zellen in einem einzigen konischen Röhrchen mit dem entsprechenden Medium. Zentrifuge wieder und die Zellen in einem kleinen Volumen des gleichen Mediums für Zellzählungen resuspendieren. Verwenden Sie Standard-CCM (mit FBS) oder verschiedenen im Handel erhältlichen XF Medienformulierungen, die hier als XF Medium-1 (XFM-1) und XF Medium-2 (XFM-2), sowohl mit als auch ohne menschliches Serumalbumin (HSA, 13 mg / ml) Supplementierung.

2. Herstellung von aktivierten MSC Sphäroide in 3-D Hängetropfen Cultures unter Bedingungen XF

1. Zu erzeugen Sphäroide von etwa 25.000 Zellen, verdünne die geernteten MSCs in CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2 oder XFM-2 + HSA (13 mg / ml) in 714-Zellen / & mgr; l.
2. Pipette 35 ul / Tropfen der Zellen aufdie Unterseite einer 150 mm Kulturschale invertiertes Deckel. Mehrere Tropfen unter Verwendung einer Mehrkanalpipette leicht pipettiert werden können.
   HINWEIS: Wenn größere oder kleinere Sphäroiden gewünscht werden, ändern Sie die Zellkonzentration oder das Tropfenvolumen (25-45 ul) entsprechend.
3. Übertragen Sie 20 ml Raumtemperatur PBS in den Boden der Schale und in einem kontinuierlichen und gleichmäßigen Bewegung des Deckels drehen, um die Tropfen enthält, so dass die Tropfen Scheiteln nach unten zeigen. Setzen Sie den Deckel vorsichtig auf den Boden der Kulturschale.
4. Übertragen Sie die Schale in den Inkubator für 3 Tage ohne sie zu stören entsprechende Kugel Montage zu ermöglichen.
5. Nach 72 h beginnen, die Sphäroid Ernte durch den Deckel vorsichtig zu entfernen und es so, dass die Tropfen wieder invertiert, nach oben zeigen.
6. Winkel der Deckel auf etwa 10-20 ° und die Tropfen schieben, die Sphäroiden enthält, an die Plattenkante eine Zelle Lifter.
7. Übertragen Sie die Kugeln und Medium in einem 15 ml konischen Röhrchen mit einem 1000 ul Rohrtte. Verwenden Raumtemperatur PBS und die Pipette mit der gleichen Spitze der Platte zu waschen und die maximale Rückgewinnung von Sphäroiden gewährleisten.
8. Zentrifuge für Echtzeit-PCR-Assays (Protokoll 3), die Kugel-Suspension bei 450 xg für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand aspirieren. Waschen Sie die Sphäroiden mit PBS und wiederholen Sie die beiden Zentrifugation und Aspirationsschritte. Für die Lieferung in Tiere (Protokoll 8), erlauben Kugeln in den Boden des Rohres (~ 3-4 min) ohne Zentrifugation zu begleichen.

3. Real-time PCR von entzündungshemmenden und Anti-Krebs-Marker

1. Verwenden, um die RNA-Extraktions-Kits mit Homogenisator Säulen und RNase-Free-DNase Set DNA-freie Gesamt-RNA aus einschichtigen MSCs (Protokoll 1) und MSC Sphäroide (Protokoll 2), die mit PBS gewaschen und zentrifugiert, zu isolieren.
2. Lyse mindestens 100.000 einschichtigen MSCs und 20 Sphäroide aus jedem Zustand in getrennte 15 ml konischen Röhrchen mit RLT-Puffer, enthaltend β-Mercaptoethanol (1: 100).
3. Transfer die gründlich gemischt Lysate in 1,5 ml RNase-freie Röhrchen und in einen Gefrierschrank (-80 ° C) für mindestens 3 Stunden in Sphäroid Lyse zu unterstützen.
4. Tauen die Zelllysate auf Eis, Wirbel kurz, und folgen Sie den Anweisungen des Herstellers für die RNA-Isolierung eines im Handel erhältlichen Säugetier-Gesamt-RNA Isolation Kit.
5. Quantifizieren und die Qualität der isolierten RNA beurteilen mit einem Spektralphotometer.
6. Verwenden Sie die High Capacity cDNA Reverse Transkription-Kit oder gleichwertig gemäß den Anweisungen des Herstellers cDNA für die PCR in Echtzeit zu erzeugen.
7. Legen Sie cDNA-Proben, die im Handel entwickelt Echtzeit-PCR-Primer / Sonden (Gene Expression Assays) und PCR Master Mix auf Eis. Verwenden Primer / Sonden für GAPDH (Kontrolle), PTGS2 (COX-2, anti-inflammatorische), TNFAIP6 (TSG6, entzündungshemmend), TRAIL (anti-Krebs) und IL-24 (anti-Krebs).
8. Bereiten Sie die Echtzeit-PCR-Reaktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers für Gene Expression Assays und Fast Universal Master Mix.
9. Folgen Sie den Richtlinien für die Echtzeit-PCR-Instrument für das Experiment Dokumente zu erzeugen und den Lauf durchführen.
10. Analysieren Sie die Daten , die die ΔΔC _T - Methode durch Berechnung der relativen Veränderungen (relative Menge, RQ) in der Genexpression unter Verwendung von GAPDH als endogene Kontrolle und einschichtige MSCs als Basislinie mit ^{8, 14.}

4. Sammlung von CM für Assays von immunmodulatorischen und Anti-Krebs-Potenzial

1. Ernten Sie die Sphäroiden und CM, wie oben in einem 15 ml konischen Röhrchen beschrieben, eine Zelle Heber und mit einer Pipette, jedoch nicht die Schale Deckel mit PBS waschen, da dies die CM verdünnen.
2. Zentrifuge bei 450 xg für 5 min bei Raumtemperatur, sorgfältig sammeln, um die zellfreie Überstand mit einer Pipette, und den Überstand in 1,5-ml-Röhrchen.
3. Zentrifuge bei 10.000 g für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur, sorgfältig sammeln clarified CM mit einer Pipette, und übertragen Sie die CM in neue 1,5-ml-Röhrchen für die Lagerung in einem Gefrierschrank (-80 ° C). Bereiten Aliquote des CM vor dem Gefrieren, wenn sie für mehrere Assays verwendet.
   Hinweis: Vor dem Downstream-Assays durchgeführt wird, PGE2 Konzentration, ein guter Indikator für entzündungshemmende Potential von CM, kann entsprechend den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung eines kommerziellen ELISA-Kits bestimmt werden. TSG6 Konzentration kann ¹⁴ mit einem veröffentlichten Protokoll bestimmt werden.

5. Makrophagen-Assay zur Beurteilung des Entzündungshemmende Potential von MSC-CM

1. Bereiten Sie Makrophagen-Medium, das die von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das L-Alanyl-L-Glutamin und ergänzt mit 10% Prämie auswählen FBS und 1x Penicillin-Streptomycin besteht. Filter-sterilisieren das Medium.
2. Besorgen Sie sich eine gefrorene Fläschchen von etwa 10 ⁶ J774 Makrophagen der Maus und Inkubation der Flasche für 2 Minuten in einem 37 ° C Wasserbad.
3. Den Inhalt des Fläschchens in einem 15 ml konischen Röhrchen, fügen 9 ml Makrophagen-Medium und Zentrifuge für 5 Minuten bei 200 bis 300 × g und bei Raumtemperatur.
4. Den Überstand aspirieren, zu suspendieren, die Makrophagen in 1 ml-Makrophagen-Medium, und übertragen Sie die Makrophagen in eine 150 mm Petrischale 30 ml Makrophagen-Medium enthält.
5. Ändern Sie das Medium alle 2 Tage und Inkubation der Zellen in den Inkubator, bis etwa 70-80% konfluent.
   HINWEIS: Die Makrophagen nicht haften fest an der Petrischale, so dass nicht genommen werden sollten Pflege Zellen mit Mediumwechsel zu verlieren.
6. Ernte der Makrophagen durch die Makrophagen-Medium auf die Zellen mit einer Pipette Aufsprühen. Übertragen Sie die Zellen in einer 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 200-300 xg und Raumtemperatur.
7. die Zellen in einem kleinen Volumen von Makrophagen Medium für Zellzählungen mit einem Hämozytometer den Überstand aspirieren und suspendieren. Stellen Sie die Konzentration auf 200.000 Zellen / ml mit Makrophagen mirdium.
8. die Einrichtung für den Makrophagen-Assay, fügen 480 ul Makrophagen Medium in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte zu starten.
9. Geben Sie 20 & mgr; l Makrophagen Medium in nicht-stimulierten Kontrollvertiefungen und 20 & mgr; l nicht-konditionierten oder MSC-konditioniertem Medium, wie oben hergestellt, in experimentellen Vertiefungen. Mischen Sie das Medium in den Vertiefungen durch Klopfen der Schale.
10. Transfer 500 ul der Makrophagenzellsuspension auf die nicht-stimulierten Makrophagen Kontrollvertiefungen.
11. Stimulieren Sie die restlichen Makrophagen unter Zusatz von 1: 500 bis 1: 1000 von 0,1 mg / ml Lipopolysaccharid (LPS) und 5-10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
12. Übertragen Sie 500 ul der stimulierten Makrophagen in die Vertiefungen mit nicht-konditionierten oder MSC-konditioniertes Medium. Mischen Sie die Vertiefungen durch stetig die Platte mehrmals zu schaukeln.
13. Übertragen Sie die Platte in einen Inkubator für 16-18 Std.
14. Ernten Sie die Makrophagen-konditionierten Medium und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
15. Übertragungder Überstand in neue Röhrchen und Assay für Tumor-Nekrose-Faktor-alpha (TNF-α) und Interleukin-10 (IL-10) -Gehalt von kommerziellen ELISA-Kits den Anweisungen des Herstellers folgenden.

6. Splenozyten- Assay die immunmodulatorische Potential von Sphäroid-CM zu beurteilen

1. Bereiten vollständige Splenozyten Medium, das von Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) -1640-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 1x Penicillin-Streptomycin und 2-Mercaptoethanol besteht. Filter-sterilisieren das Medium.
2. Ernte Milzen von euthanasiert-männlich BALB / c - Mäuse durch einen Einschnitt auf der linken Seite des Abdomens über der Milz hergestellt, etwa auf halbem Weg zwischen den Vorder- und Hinterbeine ^14. Übertragen Sie die Milz zu einer 70 & mgr; m Zellsieb die Splenozyten ¹⁴ zu isolieren.
3. Isolieren der Splenozyten / Lymphozyten durch die Milzen durch das 70 um Sieb in eine sterile Petrischale usin drängeng der weiche Gummi / Kunststoff Ende eines Kolbens von einer 2-3 ml ¹⁴ Spritze. Verwenden Sie eine Schleifkreisbewegung die Milzen zu distanzieren.
4. Waschen Sie die Zellsieb mehrmals mit kaltem PBS und Transfer-Zellen aus der Petrischale in einem 50 ml konischen Röhrchen. Füllen Sie den Schlauch mit kaltem PBS und Zentrifuge (500 × g) bei 4 ° C für 10 min.
5. Den Überstand aspirieren und deaktivieren Sie die Zellen aus Erythrozyten durch Inkubation mit 5-10 ml roter Blutkörperchen Lyse-Lösung (pro Milz) für 5-10 min.
6. Beenden Sie die Lyse durch Zugabe von kaltem PBS in das Röhrchen und zentrifugieren für 5-10 min bei 500 xg und bei 4 ° C.
7. Suspend die isolierten Zellen in komplettem Splenozyten- Medium, filtriert durch ein 40 & mgr; m Sieb, und die Zellen zählen eine Zählkammer. Hinzufügen Splenozyten Medium zu der Zellsuspension eine endgültige Zellkonzentration von 10 ⁶ Zellen / ml zu erreichen ,
   HINWEIS: Diese Technik wird typischerweise etwa 3 x 10 ⁷ Splenozyten pro Maus Milz ergibt.
die entsprechende Anzahl von Splenozyten mit 2 ug / ml anti-CD3e Antikörper für 5 min.
HINWEIS: Die Menge von Splenozyten erforderlich ist, hängt von der Anzahl der Versuchsbedingungen, wie vom Prüfer bestimmt (siehe Schritt 6.9). Für jede experimentelle Probe / Vertiefung, 10 ⁶ Splenozyten sind erforderlich.
8. Transfer 10 ⁶ Splenozyten (stimuliert oder nicht stimuliert) in die Vertiefungen einer 12-Well - Platte und fügen nicht-konditionierten (Kontrollen) oder MSC-CM in Vertiefungen an Endverdünnung von 1: 10-1: 20.
9. Ernten Sie die Splenozyten-CM nach 24 Stunden und Zentrifuge bei 500 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
10. Den Überstand in neue Röhrchen und Assay auf Interferon-gamma (IFN-γ) -Gehalt durch kommerzielle ELISA-Kit nach den Anweisungen des Herstellers.

7. Prostatakrebs-Assay die Anti-Krebs-Potenzial der Sphäroid-CM zu beurteilen

1. Bereiten vollständigen RPMI-Wachstumsmedium, das RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% FBS, 1x Penicillin-Streptomycin.
2. Besorgen Sie sich eine gefrorene Fläschchen von Prostatakrebszellen LNCaP und Inkubation der Flasche für 2 Minuten in einem 37 ° C Wasserbad.
3. Transferieren des Inhalts des Fläschchens in eine Kulturschale mit 30 ml vollständigem RPMI-Wachstumsmedium ein motorisiertes Pipettiergerät und ein 5 ml serologische Pipette. Waschen Sie die Fläschchen mehrmals mit dem Medium aus der Schale und die Schale in den Inkubator.
4. Kurz bevor die Zellen Konfluenz erreichen, waschen Sie die Kultur zweimal mit Raumtemperatur PBS und die LNCaP-Zellen mit 3 ml Trypsin / EDTA-Lösung vorgewärmten 0,25% abnehmen.
5. Neutralisieren des Trypsins in der Schale mit dem vollständigen RPMI-Wachstumsmedium übertragen und die Zellen zusammen mit Waschungen in einen 50 ml konischen Röhrchen.
6. Zentrifugieren der Zellen bei 450 xg für 10 min bei Raumtemperatur und den Überstand aspirieren.
7. Resuspendieren der Zellen in ein kleines Volumen des kompletten RPMI Wachstumsmedium und zählen die Krebszellen eine Zählkammer.
8. LNCaP-Zellen in einer 96-Well Schale Übertragung bei 5.000 Zellen / Well in 120 & mgr; l Vollmedium RPMI Wachstum 25% der nicht-konditionierten oder Sphäroid-CM enthält. Inkubieren in den Inkubator für 72 Stunden.
9. eine Zellwachstumstest ein Zellproliferations-Assay-Kit, anzusaugen, das Medium aus den Vertiefungen und übertragen die Platte in einen Gefrierschrank (-80 ° C) für mindestens 3 Stunden durchzuführen, verwendet wird.
   1. Aufzutauen, die Platte und lysieren in jeder Vertiefung, die Zellen durch Zugabe von 100 & mgr; l Reagens Zelllyse enthält 180 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,2 mg / ml RNase A.
   2. Für eine Standardkurve, lysieren die bekannte Mengen von LNCaP-Zellen, wie oben beschrieben.
   3. Nach 1 Stunde werden 100 ul Zelllyse-Puffer 1x 1, enthaltend: 100-Verdünnung von Zellproliferationsassay-Reagens und die Fluoreszenz in jeder Vertiefung messen die Zellmenge zu bestimmen.

8. intraperitoneale Lieferung von Intact Sphäroiden

1. Bereiten Sie Sphäroid MSCs wie oben (Protokoll 2) und resuspendieren t beschriebener Kugeln in steriler Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 0,2-0,5% HSA ergänzt XF Bedingungen aufrechtzuerhalten. HSA in der Lösung hilft beim Spritz sphere Adhäsion an Kunststoff zu verhindern.
2. Übertragen 40-120 Sphäroiden in 15 ml konische Röhrchen und die Zellen werden durch Zugabe von 6 ml HBSS / HSA zu den Rohren. Lassen Sie 3-4 min für Kugeln abzusteigen. Bereiten Sie eine unabhängige konische Röhre von Sphäroiden für jedes Tier. Auch bereiten zusätzliche Rohre von Sphäroiden für Assays Bestimmung Sphäroid Retention (siehe 8.18 unten) und Herstellung von therapeutischen Faktoren nach der Übertragung (siehe 8.19 unten), falls gewünscht.
3. Den Überstand aspirieren, überlagern die Sphäroiden mit 100-200 ul sterilem HBSS mit 0,2 bis 0,5% HSA ergänzt, und legen Sie die Röhrchen auf Eis.
4. Kurz betäuben für ca. 2 min in der Induktionskammer, die Tiere mit 2% Isofluran in 100% Sauerstoff bis zum Verschwinden von Pinch-Zehenreflex.
5. Legen Sie das Tier innerhalb des BSL-2 Schrank, dorsalen Aspect unten (Bauchseite nach oben), mit dem kontinuierlichen Fluss von 1,5% Isofluran / Sauerstoff-Gemisch über einen Nasenkegel.
6. Reinigen Sie die untere Maus Bauch mit einem Antiseptikum wie 70% Alkohol.
7. Entfernen Sie die Kappe des 20 G intravenös (iv) Katheter und führen Sie die intraperitoneale Injektion mit dem Katheter-Stilett Montage. Mit einer Hand die Maus Haut zu halten und eine andere die Injektion durchzuführen. Suchen Sie den Injektionspunkt etwa in der Mitte eines künstlichen Linie ein gebeugtem Kniegelenk und im Genitalbereich mit der Nadelspitze in Richtung des Mittellinie zu verbinden.
   HINWEIS: Die Katheter-Stilett Anordnung weist einen höheren Widerstand als eine normale Nadel, muss daher darauf geachtet werden, wie die Nadel nicht zu tief in den Bauch zu injizieren, die zu Verletzungen der inneren Organe führen kann. Penetration der Haut und dann Muskeln / Peritonealmembranfunktion kann während der Platzierung des Katheters zu spüren sein.
8. Die Baugruppe vorsichtig Metall-Stiletto / Nadel aus dem Katheter-Stilett zu entfernen. Check die Stilett für Blut, Urin und Kot und entsorgen. Blut auf der Nadel zeigt Einstich von inneren Organen (n).
9. Halten der Kunststoffkatheter in einer aufrechten Position während des Injektionsfluidströmung zu ermöglichen.
10. Bestätigen Sie die richtige Platzierung des Kunststoff-Katheter von etwa 100 ul sterilem HBSS / HSA durch den Katheter Injizieren einer Pipette mit einer 100-200 ul Spitze verwenden. Das Ende der Pipettenspitze im Inneren des Katheters Spritzenadapter eine dichte Abdichtung bildet. injizieren Sie langsam die Flüssigkeit in der Bauchhöhle.
    ANMERKUNG: Die Flüssigkeit in einem richtig positionierten Katheter mit nur geringfügigen Anpassung des Katheters im Inneren der Bauchhöhle frei fließen. Eine falsche Platzierung des Katheters (subkutan oder intra Darm-, oder wenn die Spitze der Nadel Peritonealdialyse Organe verletzt wie Nieren) wird Widerstand zu erhöhen und den Fluss zu reduzieren. Subkutan Platzierung wird in einer Formation von einer offensichtlichen "Blase" unter der Haut führen.
11. Collect ter MSC Sphäroiden, hergestellt in 100-200 ul HBSS / HSA (Schritt 8.3), eine 200 & mgr; l-Pipettenspitze verwendet, und übertragen das gesamte Volumen der Kugeln (40-120 Kugeln) in die Bauchhöhle durch den Katheter, wie oben beschrieben.
12. Waschen Sie die Röhrchen Kugeln mit 100 ul HBSS / HSA unter Verwendung der gleichen Spitze wie oben zu sammeln alle restlichen Sphäroiden und injizieren sie in die Bauchhöhle enthält.
13. (Optional) Injizieren weitere 100 & mgr; l HBSS / HSA in die Bauchhöhle des Katheters zu waschen.
14. Legen Sie die Gazeauflage getränkt in antiseptisch über den Katheter und langsam den Katheter aus der Bauchhöhle zu entfernen und entsorgen.
15. Massieren Sie die Bauchhöhle mit den Fingern eine gleichmäßige Verteilung der Sphäroide zu gewährleisten.
16. Lassen Sie das Tier unter Aufsicht erholen und achten Sie auf von der Injektionsstelle Blutungen.
17. Untersuchen Sie den Katheter und 15-ml-Röhrchen für die restlichen Sphäroiden. Es ist normal, ein paar Kugeln in die zu beobachtenKatheter / Schlauch.
    HINWEIS: Die Technik zur MSC Sphäroid Lieferung beschrieben können für die Verwendung in normalen Tieren oder in einer Vielzahl von Verletzungen Modelle übernommen werden. Diese Technik wurde erfolgreich einzuspritzen Sphäroide in Maushornhautverletzung und Endotoxämie Modelle sowie in einer Zymosan-induzierte Peritonitis - Modell ⁸ verwendet.
18. Um die Anzahl der zurückbehaltenen Sphäroiden (optional) zu quantifizieren, verwenden, um eine DNA-basierte Zellzahl Quantifizierung kit / Reagenz. Halten Sie die verwendeten Katheter über den 15-ml-Röhrchen und kräftig HBSS / HSA durch den Katheter verzichtet werden zurück in die 15-ml-Röhrchen alle verbleibenden Kugeln zu erzwingen.
    1. Zentrifugieren Sie die 15-ml-Röhrchen bei 500 g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand aspirieren. Übertragen, um das Rohr das Sphäroid Pellet in einen Gefrierschrank (-80 ° C) für mindestens 3 Stunden enthält.
    2. Auftauen das Rohr und lysieren die Kugeln durch Zugabe von 500 & mgr; l Reagens Zelllyse enthält 180 mM NaCl, 1 mM EDTA und 0,2 mg / ml RNase A.
    3. Für eine Steuer, freeze und lysieren eine bekannte Menge von Sphäroiden (vorzugsweise gleich der Anzahl von Sphäroiden für eine einzelne Injektion hergestellt) wie oben beschrieben.
    4. Nach 1 Stunde, dann 100 & mgr; l des Zelllysats in zweifacher Ausfertigung in einer 96-Well-Mikroplatte und fügen Sie eine Verdünnung von 1:50 der Zellproliferation Testreagens aus dem Satz zu jeder Vertiefung 100 ul 1x Zelllysepuffer enthält. Nach 10 min Messung der Fluoreszenz in jeder Vertiefung, die Anzahl der Kugeln zu bestimmen, die durch einen Vergleich der experimentellen Probe (n) mit der Kontrollprobe nicht injiziert.
19. Bewerten Sie die Aktivierungsniveau von Sphäroiden zur Injektion (optional) durch die Konzentration von PGE2 Messen und TSG6 durch übertragen Kugeln hergestellt. Transfer 40-120 Kugeln durch den Katheter, wie oben beschrieben, in eine 12-Well-oder 6-Well-Platte mit 1 oder 2 ml & agr; MEM, supplementiert mit 2% FBS und 1 x Penicillin / Streptomycin. Legen Sie die Platten in den Inkubator für 6 Stunden.
    1. Übertragen Sie das Medium ausdie Vertiefungen nach 6 h in 1,5 oder 15 ml-Röhrchen und die Röhrchen für 5 min bei Raumtemperatur bei 450 xg zentrifugiert.
    2. Übertragen Sie die zellfreie Überstand in frische 1,5-ml-Röhrchen mit einer Pipette und Zentrifuge bei 10.000 × g für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur verwenden.
    3. Übertragen Sie die geklärte CM (Überstand) in neue 1,5-ml-Röhrchen und Assay für PGE2-Konzentration (guter Indikator für entzündungshemmende Potential von CM) mit einem im Handel erhältlichen ELISA-Kits nach den Anweisungen des Herstellers. TSG6 Konzentration kann ¹⁴ mit einem veröffentlichten Protokoll bestimmt werden.

Ergebnisse

In der aktuellen Arbeit wurden hängenden Tropfen Kulturen unter XF Bedingungen kompakten sphärischen Mikrogeweben oder "Sphäroiden" von aktivierten MSCs zu erzeugen. Die Prüfpräparate Roadmap in 1 veranschaulicht , dass MSCs zur Selbstorganisation gefördert werden in Sphäroide wenn in hängenden Tropfen für 72 Stunden ausgesetzt, wonach die Sphäroide oder das CM mit Kugel abgeleiteten therapeutischen Faktoren geladen wird , kann sowohl gesammelt und m?...

Diskussion

Die optimale MSC für die Verwendung in einigen Forschung und klinische Anwendungen sollten hoch aktivierten ihren Nutzen zu maximieren, und vorzugsweise unter chemisch definierten XF Bedingungen hergestellt, die Lieferung von potentiellen Antigenen aus xenogenen Mediumkomponenten wie FBS zu minimieren. In den Protokollen hier beschrieben, haben wir Methoden 1 gezeigt) aktivieren MSCs in 3D Kultur durch Bildung von Sphäroiden, 2) erreichen, um die 3D-Aktivierung von MSCs unter Bedingungen XF, 3) Auswertung der Aktivier...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling