Production et administration de la thérapeutique mésenchymateuses souches / cellules stromales (MSC) Spheroids apprêté dans les cultures 3-D dans des conditions d'Xeno-libres

Résumé

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Résumé

cellules stromales souches / mésenchymateuses (CSM) sont très prometteurs en bioingénierie et la médecine régénérative. MSCs peuvent être isolés à partir de tissus adultes multiples par leur forte adhérence à la culture tissulaire en plastique, puis encore développés in vitro, le plus souvent à l' aide de sérum bovin fœtal (FBS). Depuis FBS peut provoquer des MSCs pour devenir immunogène, sa présence dans les cultures MSC limite les applications cliniques et expérimentales des cellules. (XF) médias libres xéno-Par conséquent, les études employant chimiquement définis pour les cultures MSC sont extrêmement précieux. De nombreux effets bénéfiques des cellules souches mésenchymateuses ont été attribuées à leur capacité à réguler l'inflammation et l'immunité, principalement par la sécrétion de facteurs immunomodulateurs tels que le facteur stimulée par le gène de nécrose tumorale 6 (TSG6) et de la prostaglandine E2 (PGE2). Cependant, MSCs nécessitent une activation pour produire ces facteurs et puisque l'effet des cellules souches mésenchymateuses est souvent transitoire, un grand intérêt a émergé pour découvrir des moyens de pré-activation des cellules prior pour leur utilisation, ce qui élimine le temps de retard pour l' activation in vivo. Nous présentons ici des protocoles pour activer efficacement ou MSCs premiers en trois dimensions (3D) cultures dans des conditions XF définies chimiquement et d'administrer ces MSCs pré-activé in vivo. Plus précisément, nous décrivons d'abord les méthodes pour générer MSC sphérique micro-tissus ou «sphéroïdes» en gouttes suspendues à l'aide de moyen XF et démontrer comment les sphères et milieu conditionné (CM) peuvent être récoltées pour diverses applications. Deuxièmement, nous décrivons les écrans d'expression des gènes et in vitro des tests fonctionnels pour évaluer rapidement le niveau d'activation MSC en sphéroïdes, mettant l' accent sur le potentiel anti-inflammatoire et anti-cancer des cellules. En troisième lieu , on décrit une nouvelle méthode pour injecter des sphéroïdes intacts MSC dans le péritoine de souris pour tester in vivo l' efficacité. Dans l'ensemble, les protocoles ici à surmonter des défis majeurs de l'obtention de cellules souches mésenchymateuses pré-activé sous XF con défini chimiquementconditions et fournir un système flexible pour administrer sphéroïdes MSC pour les thérapies.

Introduction

Mésenchymateuses souches / cellules stromales (CSM) ont montré un grand potentiel pour diverses approches de la médecine régénératrice. MSC ont été initialement isolé en tant que composant de stroma de moelle osseuse , mais elles ont été obtenues à partir de nombreux autres tissus adultes, y compris le tissu adipeux ^{1, 2, 3.} Fait intéressant, la méthode d'isolement principale englobe la propriété remarquable de cellules souches mésenchymateuses à adhérer étroitement sur une culture de tissu en plastique en présence de sérum de fœtus bovin (FBS). Bien que cette technique d'isolement classique permet une extension aisée et rapide des cellules souches mésenchymateuses en deux dimensions (2D) la culture, il est également très artificielle et ne tient pas compte l' importance de l'environnement naturel en trois dimensions (3D) conduisant à une perte potentielle d'importantes caractéristiques cellulaires ^{4, 5 , 6.} Par conséquent, l'étude des cellules souches mésenchymateuses dans des cultures 3D, quisont plus physiologique que les cultures 2D traditionnels, a vu le jour à la recherche des caractéristiques de MSC "perdus / diminués». En outre, un grand intérêt a augmenté pour identifier les conditions (XF) gratuit xéno-chimiquement défini pour la culture et l'activation MSC, et donc rendre les cellules plus favorable pour les applications cliniques.

De nombreuses études ont été publiées démontrant la culture 3D de MSCs tant en biomatériaux et que des agrégats ou sphéroïdes sphériques. MSCs en biomatériaux ont été initialement conçus pour les approches d'ingénierie tissulaire pour remplacer des tissus endommagés par des échafaudages de cellules ensemencées, alors que les cultures sphéroïde de MSCs ont été considérés comme un moyen de comprendre le comportement de MSC in vivo après l' administration des cellules pour des thérapies dans les essais pré-cliniques ou cliniques ^{4, 5, 7.} Fait intéressant, la forme MSCs sphéroïdes spontanément lorsque l'adhésion à la culture de tissus en plastique ne sont pas autorisés^{8, 9, 10.} Traditionnellement, l'agrégation cellulaire a été facilitée par des procédés de ballon spinner ou des techniques d'incrustation liquides, les méthodes utilisées initialement dans la biologie du cancer dans les efforts visant à essayer d'imiter le microenvironnement tumoral. Plus récemment, d' autres méthodes sont apparues qui démontrent l' agrégation des cellules dans des boîtes de culture pré-enduit avec des produits chimiques spécifiques pour empêcher la cellule-plastique adhérence ^{4, 5, 6.} L'un des plus simples et les plus économiques méthodes pour générer des sphéroïdes MSC est à la culture les en gouttes suspendues, une technique qui a été souvent utilisé pour produire des corps embryoïdes à partir de cellules souches embryonnaires. La pendaison technique de culture de goutte, l'adhérence des cellules à la matière plastique de culture de tissu est empêchée en mettant en suspension les cellules dans une goutte de milieu sur le côté inférieur d'un couvercle de boîte de culture tissulaire et en laissant la gravité pour faciliter AGGREG cellulairetion dans le sommet de la goutte. La taille des sphéroïdes peut être facilement manipulée en changeant la concentration des cellules ou du volume de la goutte, ce qui rend les cultures suspendues goutte particulièrement facile à contrôler.

Les premières études sur la culture 3D de MSCs ont démontré des différences radicales dans les caractéristiques des cellules en 3D par rapport à leurs homologues 2D ^{6, 8, 9.} Dans le même temps, des rapports ont démontré que les effets bénéfiques des cellules souches mésenchymateuses in vivo comptaient sur leur capacité à devenir activés par des signaux micro-environnementales et, en réponse, pour produire des anti-inflammatoires et immunomodulateurs ¹¹ facteurs. Fait intéressant, la plupart de ces facteurs, tels que la Prostaglandine E2 (PGE2), d'une tumeur gène du facteur stimulée nécrose 6 (TSG6) et le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) ont été produits en quantités beaucoup plus importantes de sphéroïdes MSC que MSCs 2D traditionnels ouvrant la voie à la idée deen utilisant des cultures 3D pour activer les cellules ^{8, 12, 13.} De plus, l' activation de gènes dans des cultures 3D est apparu récapituler les mécanismes, au moins en partie, de l' activation des cellules après injection à des souris ^12. En activant MSCs avant leur utilisation dans des expériences, les effets des cellules peuvent être longs et plus important que l'effet de MSC traditionnelle in vivo est souvent retardé et transitoire, et peut être décrit comme "hit and run". Au cours des dernières années, des études fonctionnelles importantes en utilisant sphéroïdes MSC ont démontré qu'ils peuvent supprimer les réponses inflammatoires et de moduler l' immunité in vivo en influençant les cellules effectrices telles que les macrophages, les cellules dendritiques, les neutrophiles et les cellules T faisant sphéroïdes une forme attrayante de MSCs apprêtées ^{2 , 3.} En outre, la production de molécules anticancéreuses, telles que interleukin-24 (IL-24) et la nécrose de la tumeur lié au facteur de ligand induisant l' apoptose (TRAIL) sont augmentés dans des cultures 3D de cellules souches mésenchymateuses par rapport à la monocouche MSCs, un phénomène qui pourrait être exploité pour la thérapie ciblée des cancers ^{8, 10, 14.}

Comme la culture de MSC traditionnelle exigeait non seulement l'utilisation de la culture de tissus en plastique, mais aussi FBS, un autre obstacle pour rendre sphéroïdes MSC plus favorable pour une utilisation clinique avait à surmonter. Pour faire face à cet obstacle, nous avons récemment montré la formation de sphéroïdes MSC dans des conditions de XF spécifiques définis chimiquement et établi que les sphéroïdes MSC résultants ont été activés pour produire les mêmes molécules anti-inflammatoires et anti-cancéreuses que les sphéroïdes générés dans des conditions avec du FBS ^14. Ici, ces résultats sont présentés dans plusieurs protocoles détaillés qui démontrent la génération de cellules souches mésenchymateuses pré-activé dans les cultures 3D en utilisant XFmédias. En outre, les protocoles sont présentés qui décrivent des moyens efficaces pour évaluer les niveaux des MSCs d'activation en ce qui concerne leurs effets anti-inflammatoires, immunomodulatrices et anti-cancéreuses, ainsi qu'un procédé pratique pour livrer les sphéroïdes intacts dans des souris.

Protocole

1. MSC Isolement et expansion

1. Obtenir MSCs de passage au début du Centre pour la préparation et la distribution des cellules souches adultes ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) ¹⁵ flacons comme congelés. Alternativement, isoler MSCs de aspirats de moelle osseuse en suivant un protocole de routine ¹⁴ et stocker des flacons comme congelés.
2. Préparer un milieu de culture complet (CCM), ce qui est un minimum de milieu essentiel alpha (aMEM) additionné de 15 à 20% de prime sélectionner de FBS, 2 mM de L-glutamine et 1 x pénicilline-streptomycine. Stériliser le milieu par filtration.
3. Placer 30 ml de CCM dans une boîte de culture cellulaire de 150 mm et incuber le plat pendant 30 min à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5% de CO _2.
4. Incuber le flacon congelé contenant environ 10 ⁶ cellules souches mésenchymateuses pendant 2 minutes dans un bain - marie à 37 °.
5. Transférer le contenu du flacon à la boîte de culture en utilisant un 5 ml pipettes sérologiques et laver le flacon plusieurs fois avec 1-2 ml CCM de l'antenne pour capturer les cellules résiduelles. Placer le plat du jour au lendemain dans un incubateur approprié.
6. Laver soigneusement la culture deux fois avec du phosphate de la température ambiante une solution saline tamponnée (PBS) et détacher les MSCs avec 3 ml d'acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) solution préchauffée 0,25% de trypsine. Détachement prend habituellement environ 3-4 min dans l'incubateur.
7. Neutraliser la trypsine dans le plat avec 6 ml CCM pré-chauffé à 37 ° C et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml. Combiner avec des lavages de PBS pour maximiser le rendement des cellules.
8. Centrifuger les cellules (450 xg) pendant 10 minutes à la température ambiante et aspirer le surnageant.
9. Re-suspendre les cellules dans un petit volume de CCM et de compter les cellules viables en utilisant un hémocytomètre et bleu trypan.
10. Seed un nombre approprié de 150 plats mm à 100 cellules / cm ² dans 30 ml de CCM chaud et incuber les cultures jusqu'à environ 70-80% de confluence, généralement 7 jours avec le milieu change tous les 2-3 jours et 24-48 h avant la récolte.
11. Récolter les cellules comme ci-dessus avec de la trypsine / EDTA et de combiner toutes les cellules dans un tube conique unique avec le milieu approprié. Centrifuger à nouveau et remettre en suspension les cellules dans un petit volume d'un même support pour les numérations cellulaires. Utiliser CCM standard (contenant du FBS) ou différents disponibles dans le commerce formulations de milieux XF, ici dénommé XF moyen 1 (XFM-1) et XF moyen 2 (XFM-2), à la fois avec et sans sérum-albumine humaine (SAH, 13 mg / ml) supplémentation.

2. Préparation de Activé MSC Spheroids en 3-D Hanging Cultures goutte sous Conditions XF

1. Pour générer des sphéroïdes d'environ 25 000 cellules, on dilue les cellules souches mésenchymateuses récoltées en CCM, XFM-1, XFM-1 + ASH (13 mg / ml), XFM-2 ou XFM-2 + ASH (13 mg / ml) à 714 cellules / ul.
2. Pipette 35 ul / gouttes des cellules surla face inférieure d'une culture de 150 mm inversé plat couvercle. plusieurs gouttes peuvent être facilement introduits à la pipette à l'aide d'une pipette multicanaux.
   NOTE: Si sphéroïdes plus ou moins sont souhaitées, modifier la concentration cellulaire ou le volume de la goutte (25-45 pi) de manière appropriée.
3. Transférer 20 ml de la température ambiante PBS dans la base du plat et dans un mouvement continu et régulier retourner le couvercle, contenant les gouttes, de sorte que les sommets de baisse face à la baisse. Placez soigneusement le couvercle sur la base de la boîte de culture.
4. Transférer le plat dans l'incubateur pendant 3 jours sans perturber pour permettre l'assemblage de la sphère appropriée.
5. Au bout de 72 heures, la récolte commence sphéroïde en retirant le couvercle avec précaution et l'inversant de façon que les gouttes, une fois encore, orientées vers le haut.
6. Angle du couvercle à environ 10 à 20 ° et pousser les gouttes contenant les sphéroïdes, au bord de la plaque à l'aide d'un dispositif de levage de pile.
7. Transférer les sphères et le milieu dans un tube conique de 15 ml avec un tube 1000 piTTE. Utiliser la température ambiante du PBS et la pipette avec la même astuce pour laver la plaque et assurer une récupération maximale de sphéroïdes.
8. Pour les essais de PCR en temps réel (protocole 3), centrifuger la suspension de la sphère à 450 xg pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. Laver les sphéroïdes avec du PBS et répéter les deux centrifugation et aspiration étapes. Pour la livraison des animaux (protocole 8), permettent sphères de régler dans le fond du tube (~ 3-4 min) sans centrifugation.

3. PCR en temps réel des marqueurs anti-inflammatoires et anti-cancer

1. Utilisez le kit d'extraction d'ARN avec des colonnes homogénéisateur et RNase-Free DNase Set pour isoler l'ARN sans ADN total provenant de cellules souches mésenchymateuses monocouche (Protocole 1) et sphéroïdes MSC (protocole n ° 2) qui ont été lavés avec du PBS et centrifugés.
2. Lyser au moins 100.000 cellules souches mésenchymateuses monocouches et 20 sphéroïdes de chaque état séparé dans 15 ml tubes coniques avec du tampon RLT contenant β-mercaptoéthanol (1: 100).
3. Transfert les lysats soigneusement mélangés dans 1,5 ml tubes RNase-libres et le placer dans un congélateur (-80 ° C) pendant au moins 3 heures à l'aide dans la lyse sphéroïde.
4. Décongeler les lysats de cellules sur la glace, vortex brièvement, et suivez les instructions du fabricant pour l'isolement d'ARN en utilisant un kit disponible dans le commerce des mammifères d'isolement de l'ARN total.
5. Quantifier et évaluer la qualité de l'ARN isolé à l'aide d'un spectrophotomètre.
6. Utilisez le kit d'ADNc transcription inverse ou équivalent selon haute capacité aux instructions du fabricant pour générer l'ADNc pour la PCR en temps réel.
7. Placer les échantillons d'ADNc, des amorces de PCR en temps réel conçu dans le commerce / sondes (dosages Gene Expression) et PCR Master Mix sur la glace. Utiliser des amorces / sondes pour GAPDH (témoin), PTGS2 (COX-2, anti-inflammatoire), TNFAIP6 (TSG6, anti-inflammatoire), TRAIL (anticancéreuse), et l'IL-24 (anti-cancer).
8. Préparer les réactions de PCR en temps réel selon les instructions du fabricant pour Gene Expression Assays et rapide Universelle Master Mix.
9. Suivez les directives pour l'instrument PCR en temps réel pour générer les documents d'expérimentation et d'effectuer la course.
10. Analyser les données en utilisant la méthode ΔΔC _T en calculant la variation relative (quantité relative, RQ) dans l' expression du gène en utilisant la GAPDH comme les cellules souches mésenchymateuses de contrôle et de monocouches endogènes comme une base de référence ^{8, 14.}

4. Collection de CM pour les dosages de immunomodulateurs et anti-cancer potentiel

1. Récolter les sphéroïdes et CM comme décrit ci-dessus mais dans un tube conique de 15 ml, en utilisant un dispositif de levage de cellule et d'une pipette, ne pas laver les couvercles de plat avec du PBS, car cela va diluer le CM.
2. Centrifuger à 450 g pendant 5 min à température ambiante, recueillir soigneusement le surnageant exempt de cellules avec une pipette, et transférer le surnageant dans 1,5 ml tubes.
3. Centrifugeuse à 10.000 xg pendant 5-10 min à température ambiante, recueillir soigneusement la clCM arified avec une pipette, et transférer le CM dans de nouveaux tubes de 1,5 ml pour le stockage dans un congélateur (-80 ° C). Préparer des aliquotes du CM avant congélation lors de son utilisation pour de multiples essais.
   NOTE: Avant d'effectuer des essais en aval, la concentration de PGE2, un bon indicateur du potentiel anti-inflammatoire de la CM, peut être déterminée en utilisant un kit ELISA commercial conformément aux instructions du fabricant. La concentration TSG6 peut être déterminée à l' aide d' un protocole publié ^14.

5. Macrophage Assay pour évaluer le potentiel anti-inflammatoire du CSM-CM

1. Préparer le milieu macrophage, qui se compose de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant de la L-alanyl-L-glutamine et supplémenté avec 10% de FBS et sélectionner prime 1x pénicilline-streptomycine. Filtre-stériliser le milieu.
2. Obtenir un flacon congelé de macrophages de souris d' environ 10 ⁶ J774 et laisser incuber le flacon pendant 2 minutes dans un bain - marie à 37 °.
3. Transférer le contenu du flacon dans un tube conique de 15 ml, ajouter 9 ml de milieu macrophage, et centrifuger pendant 5 min à 200-300 xg et à température ambiante.
4. Aspirer le surnageant, suspendre les macrophages dans 1 ml de milieu macrophage, et transférer les macrophages dans une boîte de Pétri de 150 mm contenant 30 ml de milieu macrophage.
5. Changer le milieu tous les 2 jours et on incube les cellules dans l'incubateur jusqu'à ce qu'environ 70-80% de confluence.
   NOTE: Les macrophages n'adhèrent pas étroitement à la boîte de Pétri, donc il faut prendre soin de ne pas perdre des cellules avec changement de milieu.
6. Récolter les macrophages en pulvérisant le milieu sur les cellules macrophages avec une pipette. Transférer les cellules dans un tube conique de 50 ml et on centrifuge pendant 5 minutes à 200-300 x g et à température ambiante.
7. Aspirer le surnageant et les cellules en suspension dans un petit volume de milieu macrophage pour le nombre de cellules avec un hémocytomètre. Ajuster la concentration de 200.000 cellules / ml avec macrophage medium.
8. Pour commencer la mise en place pour le dosage de macrophage, ajouter 480 ul de milieu macrophage dans des puits d'une plaque de 12 puits.
9. Ajouter 20 pi de milieu macrophage dans des puits non stimulées contrôle et 20 pi de non-conditionné ou moyen MSC-conditionné, préparé ci-dessus, dans les puits expérimentaux. Mélanger le milieu dans les puits en tapant sur la plaque.
10. Transférer 500 pi de la suspension cellulaire de macrophages dans les puits témoins non stimulés par des macrophages.
11. Stimule les macrophages restants avec addition de 1: 500-1: 1000 de 0,1 mg / ml de lipopolysaccharide (LPS) et incuber 5-10 min à température ambiante.
12. Transférer 500 ul des macrophages stimulés dans les puits avec un milieu non conditionné ou MSC-conditionné. Mélanger les puits en basculant régulièrement la plaque à plusieurs reprises.
13. Transférer la plaque dans un incubateur pour 16-18 h.
14. Récolter le moyen et centrifuger macrophage conditionné à 500 xg pendant 5 min à température ambiante.
15. Transfertle surnageant dans des tubes neufs et de dosage pour facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et (IL-10), le contenu de l'interleukine-10 par des kits commerciaux ELISA suivant les instructions du fabricant.

6. splénocytes Assay pour évaluer le potentiel immunomodulateur de Spheroid-CM

1. Préparer le milieu de splénocytes complet, qui se compose de Rosewell Memorial Institute Park (RPMI) -1640 du milieu supplémenté avec 10% de FBS inactivé à la chaleur, 1 x pénicilline-streptomycine, et 2-mercaptoéthanol. Filtre-stériliser le milieu.
2. Rates de récolte provenant de souris BALB / c euthanasiés-mâle par l' intermédiaire d' une incision préparée sur le côté gauche de l'abdomen sur la rate, environ à mi-chemin entre l'avant et les pattes arrière ^14. Transférer la rate pour une cellule crépine 70 um pour isoler les splénocytes ^14.
3. Isoler les splénocytes / lymphocytes en poussant la rate à travers le tamis de 70 um dans une boîte de Pétri stérile using du caoutchouc mou fin / plastique d'un piston d'une seringue 2-3 ml ^14. Utilisez un mouvement circulaire de broyage de dissocier les rates.
4. Laver le tamis cellulaire à plusieurs reprises avec du PBS froid et le transfert des cellules à partir de la boîte de Pétri dans un tube conique de 50 ml. Remplir le tube avec du PBS froid et centrifugation (500 x g) à 4 ° C pendant 10 min.
5. Aspirer le surnageant et effacer les cellules des globules rouges par incubation avec 5 à 10 ml de solution de lyse des globules rouges (par rate) pendant 5 à 10 min.
6. Arrêtez la lyse en ajoutant du PBS froid dans le tube et centrifuger pendant 5-10 min à 500 g et à 4 ° C.
7. Suspendre les cellules isolées en milieu de splénocytes complète, filtrer à travers un tamis de 40 um, et compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Ajouter du milieu de splénocytes à la suspension cellulaire pour obtenir une concentration cellulaire finale de 10 ⁶ cellules / ml
   NOTE: Cette technique donne généralement environ 3 x 10 ⁷ splénocytes par rate de souris.
8. Stimuler le nombre approprié de splénocytes avec 2 pg / ml d'anticorps anti-CD3e pendant 5 min.
   NOTE: La quantité de splénocytes nécessaire dépend du nombre de conditions expérimentales telles que déterminées par l'enquêteur (voir étape 6.9). Pour chaque échantillon expérimental / puits, 10 ⁶ splénocytes sont nécessaires.
9. Transférer 10 ⁶ splénocytes (stimulées ou non stimulées) dans les puits d'une plaque à 12 puits et on ajoute non conditionné (contrôle) ou MSC-CM dans les puits à une dilution finale de 1: 10-1: 20.
10. Récolter les splénocytes CM après 24 h et centrifuger à 500 g pendant 5 min à température ambiante.
11. Transférer le surnageant dans de nouveaux tubes et dosage pour l'interféron gamma (IFN-γ) contenu par kit commercial ELISA suivant les instructions du fabricant.

7. cancer de la prostate Assay pour évaluer le potentiel anti-cancer du Spheroid-CM

1. Préparer un milieu de croissance RPMI complet qui est un milieu RPMI-1640 complété avec 10% FBS, 1x pénicilline-streptomycine.
2. Obtenir un flacon congelé des cellules cancéreuses de la prostate LNCaP et incuber le flacon pendant 2 min dans un bain d'eau à 37 ° C.
3. Transférer le contenu du flacon dans une boîte de culture contenant 30 ml de milieu de croissance RPMI complet à l'aide d'une pipette motorisée et un 5 ml pipettes sérologiques. Laver le flacon plusieurs fois avec le milieu de la boîte et placez le plat dans l'incubateur.
4. Juste avant que les cellules atteignent la confluence, laver la culture deux fois avec la température ambiante du PBS et détacher les cellules LNCaP avec 3 ml de solution préchauffée 0,25% de trypsine / EDTA.
5. Neutraliser la trypsine dans le récipient avec le milieu de croissance complet RPMI et transférer les cellules avec des lavages dans un tube conique de 50 ml.
6. Centrifuger les cellules à 450 xg pendant 10 min à température ambiante et à aspirer le surnageant.
7. Remettre en suspension les cellules dans un petit volume du milieu de croissance complet RPMI et compter les cellules cancéreuses à l'aide d'un hémocytomètre.
8. Transfert des cellules LNCaP dans un plat à 96 puits à 5000 cellules / puits dans 120 ul de milieu de croissance RPMI complet contenant 25% de non-conditionné ou sphéroïde-CM. Incuber dans l'incubateur pendant 72 heures.
9. Pour effectuer un test de croissance cellulaire en utilisant un kit de dosage de la prolifération cellulaire, Aspirer le milieu des puits, et transférer la plaque dans un congélateur (-80 ° C) pendant au moins 3 h.
   1. Décongeler la plaque et lyser les cellules dans chaque puits en ajoutant 100 ul de réactif de lyse cellulaire contenant 180 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA et 0,2 mg / ml de RNase A.
   2. Pour obtenir une courbe d'étalonnage, des quantités connues de lyser les cellules LNCaP comme décrit ci-dessus.
   3. Au bout de 1 h, ajouter 100 ul de 1 x tampon de lyse cellulaire contenant dilution 1: 100 de la prolifération cellulaire réactif d'essai et mesurer la fluorescence dans chaque puits pour déterminer la quantité de cellules.

8. Livraison intrapéritonéale de Spheroids Intact

1. Préparer MSCs sphéroïde comme décrit ci-dessus (protocole 2) et resuspendre til en microbilles dans une solution saline équilibrée de Hank stérile (HBSS) additionnée de 0,2 au 0,5% de HSA pour maintenir des conditions XF. HSA dans la solution contribue à empêcher l'adhésion sphère en plastique lors de l'injection.
2. Transférer 40-120 sphéroïdes dans 15 ml tubes coniques et laver les cellules par addition de 6 ml de HBSS / HSA aux tubes. Autoriser 3-4 min pour les sphères de descendre. Préparer un tube conique de sphéroïdes indépendants pour chaque animal. En outre, de préparer des tubes supplémentaires de sphéroïdes pour les essais de détermination de la rétention d'sphéroïde (voir 8.18 ci-dessous) et la production de facteurs thérapeutiques après le transfert (voir 8.19 ci-dessous) si vous le souhaitez.
3. Aspirer le surnageant, superposer les sphéroïdes avec 100-200 pi de HBSS stérile additionné de 0,2-0,5% HSA, et placer les tubes sur la glace.
4. En bref anesthésier les animaux avec 2% d'isoflurane dans 100% d'oxygène jusqu'à la disparition du réflexe de pincement orteil pendant environ 2 min dans la chambre d'induction.
5. Placez l'animal à l'intérieur du BSL-2 cabinet, dorsale aspect vers le bas (face ventrale vers le haut), avec le flux continu d'un mélange isoflurane / oxygène de 1,5% au moyen d'un cône de nez.
6. Nettoyez l'abdomen de la souris inférieure avec un antiseptique tel que 70% d'alcool.
7. Retirer le bouchon du 20 G intraveineuse (iv) cathéter et effectuer l'injection intrapéritonéale avec l'ensemble cathéter-aiguille. Utilisez une main pour tenir la peau de la souris et un autre pour effectuer l'injection. Localisez le point d'injection à peu près au milieu d'une ligne artificielle reliant une zone commune et génitale genou fléchi à la pointe de l'aiguille pointant vers la ligne médiane.
   NOTE: L'ensemble cathéter-aiguille a une résistance supérieure à celle d'une aiguille ordinaire, le soin doit donc être considéré comme ne pas injecter l'aiguille trop profondément dans l'abdomen, ce qui pourrait entraîner des blessures aux organes internes. La pénétration de la peau, puis les muscles / membrane péritonéale peuvent être ressentis lors de la pose du cathéter.
8. Retirez délicatement le stylet métallique / aiguille de l'ensemble cathéter-aiguille. Check le stylet pour le sang, l'urine et les matières fécales et le jeter. Du sang sur l'aiguille indique la ponction d'organe (s) interne.
9. Maintenir le cathéter en matière plastique dans une position verticale lors de l'injection pour permettre l'écoulement du fluide.
10. Confirmer le placement correct du cathéter en plastique par injection d'environ 100 pi de HBSS stérile / HSA par le cathéter à l'aide d'une pipette avec une pointe 100-200 pi. Placer l'extrémité de la pointe de la pipette à l'intérieur de l'adaptateur de seringue pour un cathéter formant un joint étanche. Injecter lentement le liquide dans la cavité péritonéale.
    REMARQUE: le fluide dans un cathéter est correctement positionné va circuler librement à l'intérieur de la cavité peritoneale avec seulement des ajustements mineurs du cathéter. Mauvais placement du cathéter (sous-cutanée ou intra-intestinale, ou si la pointe de l'aiguille blessés organes tels que les reins péritonéale) va augmenter la résistance et réduire le débit. le placement sous-cutanée se traduira par une formation d'une «bulle» évidente sous la peau.
11. Collecter til MSC sphéroïdes, préparés dans 100-200 ul de HBSS / HSA (étape 8.3), en utilisant une pointe de pipette 200 pi, et de transférer la totalité du volume de sphères (40-120 sphères) dans la cavité péritonéale à travers le cathéter comme décrit ci-dessus.
12. Laver le tube contenant des sphères avec 100 pi de HBSS / HSA en utilisant la même astuce que ci-dessus pour recueillir des sphéroïdes résiduelles et les injecter dans la cavité péritonéale.
13. (Facultatif) Injecter un 100 pi supplémentaires de HBSS / HSA dans la cavité péritonéale pour laver le cathéter.
14. Placez le tampon de gaze trempé dans un antiseptique sur le cathéter et retirer lentement le cathéter dans la cavité péritonéale et le jeter.
15. Massez doucement la cavité péritonéale avec les doigts pour assurer une distribution uniforme des sphéroïdes.
16. Laissez l'animal récupérer sous la surveillance étroite et de regarder pour des saignements du site d'injection.
17. Inspecter le cathéter et le tube de 15 ml pour toutes les sphéroïdes restantes. Il est normal d'observer quelques sphères de lacathéter / tube.
    NOTE: La technique décrite pour la livraison sphéroïde MSC peut être adopté pour une utilisation chez les animaux normaux ou dans une variété de modèles de lésion. Cette technique a été utilisée avec succès pour injecter des sphéroïdes lésion de la cornée de la souris et des modèles de endotoxémie, ainsi que dans un modèle de péritonite induite par le zymosan ^8.
18. Pour quantifier le nombre de sphéroïdes retenues (en option), utiliser une base d'ADN nombre de cellules quantification kit / réactif. Maintenir le cathéter utilisé dans le tube de 15 ml et distribuer vigoureusement HBSS / HSA à travers le cathéter pour forcer toutes les billes restantes dans le tube de 15 ml.
    1. Centrifuger le tube de 15 ml à 500 g pendant 5 min à température ambiante et à aspirer le surnageant. Transférer le tube contenant le culot sphéroïde dans un congélateur (-80 ° C) pendant au moins 3 h.
    2. Décongeler le tube et lyser les sphères en ajoutant 500 ul de réactif de lyse cellulaire contenant 180 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA et 0,2 mg / ml de RNase A.
    3. Pour un contrôle, freeze et lysent une quantité connue de sphéroïdes (de préférence égal au nombre de sphéroïdes préparés pour une seule injection), comme décrit ci-dessus.
    4. Au bout de 1 h, transférer 100 pl du lysat cellulaire, en double exemplaire, dans une microplaque à 96 puits et on ajoute à chaque puits 100 ul de 1 x tampon de lyse cellulaire contenant une dilution au 1:50 de la prolifération cellulaire réactif de dosage dans le kit. Au bout de 10 min, de mesurer la fluorescence dans chaque puits pour déterminer le nombre de domaines qui ne sont pas injectés en comparant l'échantillon expérimental (s) avec l'échantillon témoin.
19. Évaluer le niveau de sphéroïdes préparés pour injection (en option) en mesurant la concentration de PGE2 et TSG6 produite par des sphères transférés activation. Transfert 40-120 sphères à travers le cathéter, comme décrit ci-dessus, dans une plaque de 12 puits ou de 6 puits contenant 1 ou 2 ml d'aMEM additionné de 2% de FBS et 1 x pénicilline / streptomycine. Placer les plaques dans l'incubateur pendant 6 heures.
    1. Transférez le moyen deles puits après 6 h en 1,5 ou 15 ml tubes et centrifuger les tubes à 450 g pendant 5 min à température ambiante.
    2. Transférer le surnageant exempt de cellules dans 1,5 ml de nouveaux tubes à l'aide d'une pipette et centrifuger à 10 000 xg pendant 5 à 10 min à température ambiante.
    3. Transférer le CM clarifié (surnageant de) dans de nouveaux tubes de 1,5 ml et analyse pour la concentration de PGE2 (bon indicateur du potentiel anti-inflammatoire de la CM) en utilisant un kit ELISA commercial conformément aux instructions du fabricant. La concentration TSG6 peut être déterminée à l' aide d' un protocole publié ^14.

Résultats

Dans les travaux en cours, suspendus cultures de chute ont été utilisées pour générer des micro-tissus sphériques compacts ou «sphéroïdes» de MSCs activées dans des conditions XF. La feuille de route d' investigation sur la figure 1 montre que les CSM sont encouragés à auto-assembler en sphéroïdes lorsqu'il est suspendu dans la pendaison gouttes pendant 72 heures, après quoi les sphéroïdes, ou le CM chargés de facteurs thérapeutiques sphère d...

Discussion

Le MSC optimal pour une utilisation dans des applications cliniques et de recherche devrait être très active pour maximiser leur profit, et préférentiellement préparé dans des conditions XF chimiquement définis pour réduire au minimum la fourniture d'antigènes potentiels de moyenne composants xénogéniques tels que FBS. Dans les protocoles décrits ici, nous avons montré des méthodes pour 1) activer MSCs en culture en 3D par la formation de sphéroïdes, 2) réaliser l'activation 3D des cellules souc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling