Produção e Administração de Therapeutic-tronco mesenquimais / celular estromal (MSC) Spheroids condicionadas em culturas 3-D Sob Condições Xeno-livres

Resumo

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Resumo

-Tronco mesenquimais / células do estroma (MSCs) são uma grande promessa em bioengenharia e medicina regenerativa. MSCs podem ser isoladas a partir de vários tecidos adultos através da sua forte aderência ao plástico da cultura de tecidos e, em seguida, ainda mais expandidas in vitro, mais comumente utilizando soro fetal de bovino (FBS). Uma vez que as MSCs de FBS pode causar a tornar-se imunogénico, a sua presença nas culturas de MSC limita ambas as aplicações clínicas e experimentais das células. (XF) media Portanto, estudos que empregam química definida livre de xeno para culturas MSC são extremamente valiosos. Muitos efeitos benéficos do MSC têm sido atribuídos à sua capacidade para regular a inflamação e imunidade, principalmente através da secreção de factores imunomoduladores tais como necrose tumoral gene estimulada por factor de 6 (TSG6) e prostaglandina E2 (PGE2). No entanto, MSCs requer ativação para produzir esses fatores e uma vez que o efeito de MSCs é muitas vezes transitória, grande interesse surgiu para descobrir maneiras de pré-activação das células prior para a sua utilização, eliminando assim o tempo de atraso para a activação in vivo. Aqui nós apresentamos protocolos para ativar de forma eficiente ou MSCs principais em três dimensões culturas (3D) sob condições XF quimicamente definidos e para administrar esses MSCs pré-activado in vivo. Especificamente, nós primeira descrevem métodos para gerar MSC esférica micro-tecidos ou "esferóides" em gotas de suspensão utilizando meio XF e demonstrar como as esferas e meio condicionado (CM) pode ser colhida para várias aplicações. Em segundo lugar, vamos descrever telas de expressão do gene e testes funcionais in vitro para avaliar rapidamente o nível de activação MSC em esferóides, enfatizando o potencial anti-inflamatório e anti-cancro das células. Em terceiro lugar, descreve-se um novo método para injectar esferóides MSC intactas dentro da cavidade peritoneal do rato in vivo para testes de eficácia. No geral, os protocolos aqui superar grandes desafios de obtenção de MSCs pré-activado sob química definida XF concondições e proporcionar um sistema flexível para administrar esferóides MSC para as terapias.

Introdução

-Tronco mesenquimais / células do estroma (CTM) têm mostrado grande potencial para várias abordagens de medicina regenerativa. MSCs foram inicialmente isolado como um componente do estroma de medula óssea, mas uma vez que foram obtidos a partir de numerosos outros tecidos adultos, incluindo o tecido adiposo ^{1, 2, 3.} Curiosamente, o método de isolamento principal abraça a propriedade notável de MSCs de aderir firmemente ao plástico de cultura de tecidos na presença de soro fetal de bovino (FBS). Embora esta técnica de isolamento tradicional permite a expansão fácil e rápida das MSCs em bidimensional cultura (2D), é também muito artificial e ignora significado do ambiente nativo tridimensional (3D), conduzindo a potencial perda de importantes características celular ^{4, 5 , 6.} Por conseguinte, o estudo das MSCs em culturas 3D, quesão mais fisiológica do que as culturas 2D tradicionais, surgiu na pesquisa "perdidos / diminuídas" características MSC. Além disso, grande interesse tem aumentado para identificar as condições (XF) livre de xeno química definida para a cultura MSC e ativação, e, assim, tornar as células mais favorável para aplicações clínicas.

Muitos estudos têm sido publicados demonstrando a cultura 3D de MSCs, tanto em biomateriais e como agregados esféricos ou esferóides. MSCs em biomateriais foram inicialmente concebidos para abordagens de engenharia de tecidos para substituir tecidos danificados com andaimes de células-semeado, enquanto culturas esferóides de MSCs foram vistos como uma maneira de entender o comportamento MSC in vivo após a administração das células para terapias em ensaios pré-clínicos ou clínicos ^{4, 5, 7.} Curiosamente, MSCs formulário esferóides espontaneamente quando a adesão ao plástico de cultura de tecidos não é permitido^{8, 9, 10.} Tradicionalmente, a agregação de células foi facilitada por métodos balão rotativo ou técnicas de sobreposição de líquidos, os métodos utilizados inicialmente na biologia do cancro nos esforços para tentar imitar o microambiente do tumor. Mais recentemente, métodos adicionais vieram à tona que demonstram a agregação de células em placas de cultura pré-revestidas com produtos químicos específicos para evitar a célula-a-plástico aderência ^{4, 5, 6.} Um dos métodos mais simples e mais económica de produção esferóides MSC é a cultura deles em gotas de suspensão, uma técnica que foi usado frequentemente para produzir corpos embrióides a partir de células estaminais embrionárias. Com pendurado técnica de cultura gota, a adesão de células ao plástico de cultura de tecidos é evitada suspendendo as células numa gota de meio no lado inferior de uma tampa do prato de cultura de tecidos e permitindo que a gravidade para facilitar AGGREG célulação no ápice da gota. O tamanho do esferóide pode ser facilmente manipulada alterando a concentração de células ou o volume da gota, fazendo culturas de suspensão gota particularmente fácil de controlar.

Os primeiros estudos sobre a cultura 3D de MSCs demonstraram diferenças radicais nas características das células em 3D, em comparação com os seus homólogos 2D ^{6, 8, 9.} Ao mesmo tempo, relatórios demonstraram que os efeitos benéficos de MSCs in vivo confiou na sua capacidade de se tornar activado por estímulos micro-ambientais e, em resposta, para produzir anti-inflamatória e imunomodulatória Factores ^11. Interessantemente, muitos destes factores, tais como a prostaglandina E2 (PGE2), necrose tumoral gene estimulada por factor de 6 (TSG6), e factor de crescimento de hepatócitos (HGF) foi produzido em quantidades muito maiores por esferóides MSC do que as MSCs 2D tradicionais, abrindo o caminho para a ideia deutilizando culturas 3D para activar as células ^{8, 12, 13.} Além disso, a activação de genes em culturas 3D apareceu recapitular mecanismos, pelo menos em parte, da activação das células após injecção em ratinhos ^12. Ao activar as MSCs antes da sua utilização nas experiências, os efeitos das células poderia ser prolongada e mais proeminente como o efeito MSC tradicional in vivo é frequentemente adiada e transiente, e pode ser descrito como "bater e correr". Durante os últimos anos, estudos funcionais importantes que utilizam esferóides MSC demonstraram que eles podem suprimir as respostas inflamatórias e modular a imunidade in vivo, influenciando as células efectoras, tais como macrófagos, células dendríticas, neutrófilos e células T fazendo esferóides de forma atraente de MSCs imunizadas ^{2 , 3.} Além disso, a produção de moléculas de anti-cancro, tais como interleukin-24 (IL-24) e de necrose tumoral relacionado com o factor de indução de apoptose ligando (TRAIL), são aumentados em culturas em 3D de MSC em relação a monocamada MSCs, um fenómeno que pode ser explorada para terapias direcionadas ^{8, 10, 14.}

À medida que a cultura MSC tradicional necessário não apenas a utilização de plástico de cultura de tecidos, mas também de FBS, um outro obstáculo para fazer esferóides MSC mais favorável para utilização clínica tiveram que ser superados. Para enfrentar este obstáculo, que recentemente mostrou a formação de esferóides MSC em condições específicas XF química definida e estabeleceu que os esferóides MSC resultantes foram ativados para produzirem as mesmas moléculas anti-inflamatórias e anti-câncer como os esferóides gerados em condições com FBS ^14. Aqui, estes resultados são apresentados em vários protocolos detalhados que demonstram a geração de MSCs pré-activada em culturas 3D usando XFmeios de comunicação. Além disso, os protocolos são apresentados que descrevem modos eficazes para avaliar os níveis de activação das MSCs no que diz respeito aos seus efeitos anti-inflamatório, imunomoduladores e anti-cancro, em conjunto com um método prático para entregar os esferóides intactas em ratos.

Protocolo

1. Isolamento MSC e Expansão

1. Obter MSCs passagem precoce do Centro para a preparação e distribuição de células estaminais adultas ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) ¹⁵ frascos como congelados. Alternativamente, isolar MSCs de aspirados de medula óssea seguindo um protocolo de rotina ¹⁴ e armazenar frascos como congelados.
2. Preparar o meio de cultura completo (CCM), que é o mínimo alfa meio essencial (aMEM) suplementado com 15-20% de FBS prémio seleccionar, 2 mM de L-glutamina, 1x penicilina e estreptomicina. Esteriliza-se o meio por filtração.
3. Colocar 30 ml de CCM para um prato de cultura de células de 150 mm, incubar a placa durante 30 minutos a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO _2.
4. Incubar o frasco congelado contendo cerca de 10 ⁶ MSCs durante 2 min num banho de água a 37 ° C.
5. Transferir o conteúdo do frasco para o prato de cultura usando uma pipeta de 5 ml serológica e lavar o frasco várias vezes com 1-2 ml de CCM a partir do prato para capturar as células residuais. Coloque a noite prato em uma incubadora apropriada.
6. Lavar cuidadosamente a cultura duas vezes com fosfato temperatura ambiente solução salina tamponada (PBS) e separar as MSCs com 3 ml de uma solução pré-aquecida de 0,25% de tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Descolamento normalmente leva cerca de 3-4 minutos na incubadora.
7. Neutraliza-se a tripsina no prato com 6 ml de CCM pré-aquecido a 37 ° C e transferir a suspensão de células para um tubo de 50 ml. Combine com lavagens de PBS para maximizar o rendimento celular.
8. Centrifugar as células (450 xg) durante 10 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante.
9. Re-suspender as células em um pequeno volume de CCM e contagem das células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro e azul de tripano.
10. Semente um número adequado de pratos de 150 mm em 100 células / cm ² em 30 ml de CCM quente e incubar as culturas até aproximadamente 70-80% confluentes, geralmente 7 dias com meio muda a cada 2-3 dias e 24-48 h antes da colheita.
11. Colher as células como anteriormente com tripsina / EDTA e combinar todas as células em um único tubo cónico com a forma apropriada. Centrifugar novamente e re-suspender as células em um pequeno volume da mesma forma para as contagens de células. Use CCM padrão (contendo FBS) ou várias formulações de meios XF disponíveis comercialmente, aqui referido como XF Meio-1 (XFM-1) e XF forma-2 (XFM-2), ambos com e sem albumina do soro humano (HSA, 13 mg / ml) a suplementação.

2. Preparação da Contato MSC Spheroids em 3-D de suspensão culturas gota sob Condições XF

1. Para gerar esferóides de cerca de 25000 células, dilui-se as MSCs colhidas em CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2, ou XFM-2 + HSA (13 mg / ml) a 714 células / ul.
2. Pipetar 35 ul / gotas das células naso lado de baixo de uma tampa de placa de cultura invertido de 150 mM. Várias gotas podem ser facilmente pipetada utilizando uma pipeta de canais múltiplos.
   NOTA: Se esferóides maiores ou menores são desejados, alterar a concentração celular ou o volume da gota (25-45 mL) de forma adequada.
3. Transferir 20 ml de PBS temperatura ambiente na base do prato e com um movimento contínuo e constante virar a tampa, contendo as gotas, de modo que os vértices virados para baixo da gota. Coloque a tampa cuidadosamente sobre a base do prato de cultura.
4. Transferir o prato na incubadora durante 3 dias sem perturbá-la para permitir a montagem esfera apropriada.
5. Após 72 horas, começam a colheita esferóide, removendo a tampa com cuidado e invertendo-lo para que as gotas, mais uma vez, viradas para cima.
6. Ângulo a tampa para aproximadamente 10-20 ° e empurrar as gotas, contendo os esferóides, para a aresta da placa através de um tirante de células.
7. Transferir as esferas e meio em um tubo cônico de 15 ml com um tubo de 1.000 lTTE. Uso temperatura ambiente PBS e a pipeta com a mesma ponta para lavar a placa e garantir a máxima recuperação de esferóides.
8. Para os ensaios de PCR em tempo real (Protocolo 3), Centrifugar a suspensão a esfera 450 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante. Lavar os esferóides com PBS e repetir os dois passos de centrifugação e aspiração. Para a entrega em animais (protocolo 8), permitirá esferas para se instalar na parte inferior do tubo (~ 3-4 min), sem centrifugação.

3. PCR em tempo real de marcadores anti-inflamatórios e anti-cancerígenos

1. Usar o kit de extração de RNA com colunas homogeneizador e isenta de RNase DNase Conjunto para isolar RNA isento de DNA total a partir de MSCs em monocamada (Protocolo 1) e esferóides MSC (protocolo 2) que foram lavadas com PBS e centrifugadas.
2. Lyse pelo menos 100.000 MSCs em monocamada e 20 esferóides de cada condição em separado, 15 ml de tubos cónicos com tampão RLT contendo β-mercaptoetanol (1: 100).
3. transfer os lisados ​​completamente misturados em tubos de 1,5 ml de RNase e colocar num congelador (-80 ° C) durante pelo menos 3 horas para auxiliar na lise esferóide.
4. Descongelar os lisados ​​das células em gelo, vortex brevemente, e seguir as instruções do fabricante para o isolamento de ARN utilizando um kit de isolamento de ARN total de mamífero comercialmente disponível.
5. Quantificar e avaliar a qualidade do RNA isolado utilizando um espectrofotómetro.
6. Use a alta capacidade Kit cDNA transcrição reversa ou equivalente de acordo com as instruções do fabricante para gerar cDNA de PCR em tempo real.
7. Coloque amostras de cDNA, comercialmente projetados em tempo real iniciadores de PCR / sondas (ensaios Expressão genética), e PCR Master Mix no gelo. Use iniciadores / sondas para GAPDH (controlo), PTGS2 (COX-2, anti-inflamatório), TNFAIP6 (TSG6, anti-inflamatório), TRAIL (anti-cancro), e IL-24 (anti-cancro).
8. Prepare as reações de PCR em tempo real de acordo com as instruções do fabricante para Gene Expression Assays e rápido UniveRsal Mix Master.
9. Siga as orientações para o instrumento de PCR em tempo real, para gerar os documentos da experiência e realização da corrida.
10. Analisar os dados usando o método _T ΔΔC calculando as mudanças relativas (quantidade relativa, RQ) na expressão de genes, utilizando GAPDH como as MSCs de controlo e monocamadas endógenos como uma linha de base ^{8, 14.}

4. Recolha de CM para Ensaios de imunomoduladores e anti-câncer Potencial

1. Colher os esferóides e CM, tal como descrito acima para um tubo cónico de 15 ml, utilizando uma célula de tirante e uma pipeta, no entanto, não lavar as tampas prato com PBS como este irá diluir o CM.
2. Centrifugar a 450 xg durante 5 min à temperatura ambiente, recolher cuidadosamente o sobrenadante livre de células com uma pipeta, e transferir o sobrenadante para tubos de 1,5 ml.
3. Centrifugar a 10000 xg durante 5-10 min à temperatura ambiente, recolher o cuidado CLCM arified com uma pipeta, e transferir o CM em novos tubos de 1,5 ml para armazenamento num congelador (-80 ° C). Preparar alíquotas do CM antes da congelação quando usá-lo para testes múltiplos.
   NOTA: Antes de realizar ensaios a jusante, a concentração de PGE2, um bom indicador do potencial anti-inflamatório de CM, pode ser determinada utilizando um kit de ELISA comercial de acordo com as instruções do fabricante. TSG6 concentração pode ser determinada utilizando um protocolo publicado ^14.

5. macrófagos Ensaio para avaliar o potencial anti-inflamatório do MSC-CM

1. Preparar o meio de macrófagos, o qual consiste em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) contendo L-alanil-L-glutamina e suplementadas com 10% de FBS e seleccionar prémio 1x penicilina-estreptomicina. Filtrar-esterilizar o meio.
2. Obter um frasco congelado de macrófagos de ratinho, aproximadamente 10 ⁶ J774 e incubar o frasco durante 2 minutos num banho de água a 37 ° C.
3. Transferir o conteúdo do frasco para um tubo cónico de 15 ml, adicionar 9 ml de meio de macrófagos, e centrifugar durante 5 minutos a 200-300 x g e à temperatura ambiente.
4. Aspirar o sobrenadante, suspender os macrófagos em 1 ml de meio de macrófagos, e os macrófagos transferir para uma placa de petri de 150 mm contendo 30 ml de meio de macrófagos.
5. Mudar o meio a cada 2 dias e incubar as células na incubadora até cerca de 70-80% confluentes.
   NOTA: Os macrófagos não aderem firmemente à placa de Petri, portanto, deve ser tomado cuidado para não perder as células com alteração do meio.
6. Colher os macrófagos por pulverização a forma dos macrófagos sobre as células com uma pipeta. Transferir as células num tubo cónico de 50 ml e centrifugar durante 5 minutos a 200-300 x g e à temperatura ambiente.
7. Aspirar o sobrenadante e suspender as células num pequeno volume de meio de macrófagos para a contagem de células com um hemocitómetro. Ajustar a concentração de 200.000 células / ml com macrófagos medium.
8. Para iniciar o estabelecido para o ensaio de macrófagos, adicionar 480 uL de meio de macrófagos em poços de uma placa de 12 poços.
9. Adicionar 20 ul de meio de macrófagos nos poços de controlo não estimuladas e 20 ul de não-condicionado ou meio condicionado MSC, preparado acima, em poços experimentais. Misturar o meio nos poços por batidas suaves da placa.
10. Transferir 500 ul da suspensão de células de macrófagos para os poços de controlo não estimuladas macrófagos.
11. Estimular os macrófagos restantes com adição de 1: 500-1: 1000 de 0,1 mg / ml de lipopolissacárido (LPS) e incubar 5-10 min à temperatura ambiente.
12. Transferir 500 ul de macrófagos estimulados nas cavidades com meio não condicionado ou MSC-condicionado. Misture os poços de forma constante balançar a placa várias vezes.
13. Transferir a placa para uma incubadora durante 16-18 hr.
14. Colher o meio e centrifuga-se condicionado por macrófagos a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
15. Transferiro sobrenadante para novos tubos de ensaio e de factor de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e o conteúdo (IL-10) de interleucina-10 por kits ELISA comerciais seguindo as instruções do fabricante.

6. esplen�ito Ensaio para avaliar o potencial imunomoduladora de Spheroid-CM

1. Preparar o meio de esplenócitos completa, que consiste em Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 meio suplementado com FBS inactivado por calor a 10%, 1x penicilina-estreptomicina, e 2-mercaptoetanol. Filtrar-esterilizar o meio.
2. Baços colheita de-macho sacrificados camundongos BALB / c através de uma incisão preparado no lado esquerdo do abdómen sobre o baço, aproximadamente a meio caminho entre a pernas dianteiras e traseiras ^14. Transferir o baço de um filtro celular de 70 uM para isolar os esplenócitos ^14.
3. Isolar os esplenócitos / linfócitos, empurrando os baços através do filtro 70 mm em uma usin placa de Petri estérilg o fim de borracha macia / plástico de um êmbolo de um 2-3 ml em seringa ^14. Use um movimento circular de moagem para dissociar os baços.
4. Lavar o filtro de células várias vezes com PBS frio e transferir as células a partir da placa de petri em um tubo de 50 ml. Encher o tubo com PBS frio e centrifugação (500 xg) a 4 ° C durante 10 min.
5. Aspirar o sobrenadante e limpar as células de eritrócitos de incubação com 5-10 ml solução lise de glóbulos vermelhos no sangue (por baço) durante 5-10 min.
6. Pare a lise por adição de PBS frio para o tubo e centrifuga-se durante 5-10 minutos a 500 x g e a 4 ° C.
7. Suspender as células isoladas em meio esplen�ito completa, filtrar através de um filtro de 40 mm, e contar as células utilizando um hemocitómetro. Adicionar meio de esplenócitos para a suspensão de células para se conseguir uma concentração celular final de 10 ⁶ células / ml
   NOTA: Esta técnica normalmente produz aproximadamente 3 x 10 ⁷ esplenócitos por baço mouse.
8. Estimular o número apropriado de esplenócitos com 2 ug / mL de anticorpo anti-CD3e durante 5 min.
   NOTA: A quantidade de esplenócitos necessária depende do número de condições experimentais, tal como determinado pelo investigador (ver passo 6.9). Para cada amostra experimental / poço, 10 ⁶ esplenócitos são necessários.
9. Transferir 10 ⁶ esplenócitos (estimuladas ou não estimuladas) em poços de uma placa de 12 poços e adicionar não-condicionada (controlos) ou MSC-CM em poços a diluição final de 1: 10-1: 20.
10. Recolher as CM esplenócitos após 24 horas e centrifugar a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
11. Transferir o sobrenadante para novos tubos de ensaio e para o interferão gama (IFN-γ) conteúdo por kit de ELISA comercial seguindo as instruções do fabricante.

7. O cancro da próstata Ensaio para avaliar o potencial anti-câncer do Spheroid-CM

1. Preparar o meio de crescimento de RPMI completo, que é meio RPMI-1640 suplementado com 10% de FBS, 1x penicilina-estreptomicina.
2. Obter um frasco congelado de células de cancro da próstata LNCaP e incubar o frasco durante 2 minutos num banho de água a 37 ° C.
3. Transferir o conteúdo do frasco para um prato de cultura contendo 30 ml de meio de crescimento RPMI completo usando uma pipeta motorizada e 5 ml de uma pipeta serológica. Lavar o frasco várias vezes com a forma de prato e a colocar o prato para a incubadora.
4. Pouco antes de as células atingem a confluência, lava-se a cultura duas vezes com PBS temperatura ambiente e separar as células LNCaP com 3 ml de uma solução pré-aquecida de 0,25% de tripsina / EDTA.
5. Neutraliza-se a tripsina no prato com o meio de crescimento de RPMI completo e transferir as células juntamente com lavagens para um tubo cónico de 50 ml.
6. Centrifugar as células a 450 xg durante 10 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante.
7. Re-suspender as células em pequeno volume de meio de crescimento de RPMI completo, e contar as células cancerosas utilizando um hemocitómetro.
8. Transferência de células de LNCaP em um prato de 96 poços a 5000 células / poço em 120 ul de meio de crescimento RPMI completo contendo 25% de não-condicionado ou esferóide-CM. Incubar na incubadora durante 72 h.
9. Para realizar um ensaio de crescimento celular utilizando um estojo de ensaio de proliferação celular, aspirar o meio a partir de poços e transferir a placa para um congelador (-80 ° C) durante pelo menos 3 h.
   1. Descongelar a placa e lisar as células em cada poço pela adição de 100 ul de reagente de lise celular contendo NaCl 180 mM, EDTA 1 mM e 0,2 mg / ml de RNase A.
   2. Para obter uma curva padrão, quantidades conhecidas de lisar células LNCaP como descrito acima.
   3. Após 1 h, adicionar 100 ul de 1x tampão de lise celular contendo diluição 1: 100 de reagente de ensaio de proliferação celular e medir a fluorescência em cada poço, para determinar a quantidade de células.

8. Entrega intraperitoneal de esferóides intactos

1. Preparar as MSCs de esferóide conforme descrito acima (protocolo 2) e ressuspender tele esferas em Solução Salina Equilibrada de Hank estéril de (HBSS) suplementada com 0,2-0,5% de HSA para manter as condições XF. HSA na solução ajuda a prevenir a adesão de esfera de plástico durante a injecção.
2. Transferir 40-120 esferóides em tubos de 15 mL cónicos e lavar as células por adição de 6 ml de HBSS / HSA para os tubos. Permitir 3-4 min para esferas a descer. Preparar um tubo cónico de esferóides independentes para cada animal. Além disso, preparar tubos adicionais de esferóides para ensaios que determinam a retenção esferóide (ver 8.18 abaixo) e produção de fatores terapêuticos após a transferência (ver 8.19 abaixo), se desejar.
3. Aspirar o sobrenadante, sobrepor os esferóides com 100-200 ul de HBSS estéril suplementado com 0,2-0,5% de HSA, e coloque os tubos em gelo.
4. Resumidamente anestesiar os animais com 2% de isoflurano em 100% de oxigénio até ao desaparecimento do reflexo pitada-dedo do pé durante aproximadamente 2 minutos na câmara de indução.
5. Colocar o animal dentro da BSL-2 gabinete, aspe dorsalct baixo (lado ventral para cima), com o fluxo contínuo de mistura de isoflurano / oxigénio de 1,5% através de um cone de nariz.
6. Limpe a parte inferior do abdome do rato com um álcool anti-séptico, como 70%.
7. Remover a tampa do 20 L por via intravenosa (IV) e realizar o cateter de injecção intraperitoneal com o conjunto de cateter-agulha. Use uma mão para segurar a pele do rato e outra para realizar a injeção. Localize o ponto de injecção aproximadamente no meio de uma linha artificial ligar um joelho flexionado área conjunta e genital com a ponta da agulha apontando para a linha média.
   NOTA: O conjunto de cateter-estilete tem uma resistência maior do que uma agulha regular, portanto, o cuidado deve ser tomado para não injetar a agulha muito profundamente no abdômen, o que poderia resultar em lesão de órgãos internos. A penetração na pele e, em seguida, músculos / membrana peritoneal podem ser sentidas durante a colocação do cateter.
8. Remova cuidadosamente o metal stiletto / agulha do conjunto de cateter-estilete. Check o estilete para o sangue, urina e fezes e descartá-lo. Sangue na agulha indica perfuração de órgãos internos (s).
9. Segurar o cateter de plástico na posição vertical durante as injecções para permitir o fluxo de fluido.
10. Confirmar o posicionamento apropriado do cateter de plástico por injecção de aproximadamente 100 ul de HBSS estéril / HSA através do cateter, utilizando uma pipeta com uma ponta de 100-200 ul. Coloque a extremidade da ponta da pipeta dentro do adaptador de cateter seringa formar um vedante apertado. Lentamente injectar o fluido no interior da cavidade peritoneal.
    NOTA: O fluido de um cateter posicionado correctamente irá fluir livremente dentro da cavidade peritoneal com apenas pequeno ajustamento do cateter. A colocação imprópria do cateter (por via subcutânea ou intra-intestinal, ou se a ponta da agulha ferido peritoneais órgãos como os rins) irá aumentar a resistência e reduzir o fluxo. colocação subcutânea resultará a formação de uma "bolha" óbvio sob a pele.
11. Recolha tele MSC esferóides, preparados em 100-200 ul de HBSS / HSA (passo 8.3), utilizando uma ponta de pipeta de 200 uL, e transferir a totalidade do volume de esferas (40-120 esferas) para dentro da cavidade peritoneal através do cateter, como descrito acima.
12. Lavar o tubo contendo as esferas com 100 ul de HBSS / HSA utilizando a mesma ponta como acima, para recolher quaisquer esferóides residuais e injecta-se na cavidade peritoneal.
13. (Opcional) Injectar um adicional de 100 ul de HBSS / HSA para dentro da cavidade peritoneal para lavar o cateter.
14. Coloque a compressa de gaze embebida em anti-séptico sobre o cateter e, lentamente, remover o cateter a partir da cavidade peritoneal e descartá-lo.
15. Massageie suavemente na cavidade peritoneal com os dedos para assegurar uma distribuição uniforme dos esferóides.
16. Deixe o animal se recuperar sob rigorosa vigilância e assistir a hemorragia no local da injecção.
17. Inspecionar o cateter e tubo de 15 ml por quaisquer esferóides restantes. É normal observar algumas esferas docateter / tubo.
    NOTA: A técnica descrita para entrega esferóide MSC pode ser adoptado para uso em animais normais ou numa variedade de modelos de lesão. Esta técnica tem sido utilizada com sucesso para injectar esferóides em lesão da córnea do rato e modelos de endotoxemia, bem como num modelo de peritonite induzida por zimosan ^8.
18. Para quantificar o número de esferóides retidos (opcional), use um baseada em DNA número de células quantificação kit / reagente. Segurar o cateter utilizado ao longo do tubo de 15 ml e vigorosamente dispensar HBSS / HSA através do cateter para forçar todos os restantes esferas de volta para o tubo de 15 ml.
    1. Centrifuga-se o tubo de 15 ml a 500 xg durante 5 min à temperatura ambiente e aspirar o sobrenadante. Transferir o tubo contendo o sedimento esferóide em um congelador (-80 ° C) durante pelo menos 3 h.
    2. Descongelar o tubo e lisar as esferas através da adição de 500 ul de reagente de lise celular contendo NaCl 180 mM, EDTA 1 mM e 0,2 mg / ml de RNase A.
    3. Para um controle, freEze e lise uma quantidade conhecida de esferóides (de um modo preferido equivalente ao número de esferóides preparadas para uma única injecção) como descrito acima.
    4. Após 1 h, transferir 100 ul do ligado de células, em duplicado, para uma microplaca de 96 cavidades e adicionar a cada cavidade 100 ul de 1x tampão de lise de células contendo uma diluição de 1:50 do reagente de ensaio de proliferação de células do kit. Após 10 min, medir a fluorescência em cada poço, para determinar o número de esferas que não foram injectados pela comparação da amostra experimental (s) com a amostra de controlo.
19. Avaliar o nível de ativação de esferóides preparados para injecção (opcional), medindo a concentração de PGE2 e TSG6 produzido por esferas transferidos. Transferência 40-120 esferas através do cateter, como descrito acima, em uma placa de 12 poços ou de 6 poços contendo 1 ou 2 ml de aMEM suplementado com 2% de FBS e 1x penicilina / estreptomicina. Colocar as placas na incubadora durante 6 h.
    1. Transferir a forma deos poços após 6 horas em 1,5 ou tubos de 15 ml e centrifugar os tubos a 450 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    2. Transferir o sobrenadante isento de células frescas em tubos de 1,5 ml usando uma pipeta e centrifugar a 10000 xg durante 5-10 min à temperatura ambiente.
    3. Transferir o CM clarificado (sobrenadante) para novos tubos de 1,5 ml e a concentração do ensaio para PGE2 (bom indicador do potencial anti-inflamatório de CM) utilizando um kit de ELISA comercial de acordo com as instruções do fabricante. TSG6 concentração pode ser determinada utilizando um protocolo publicado ^14.

Resultados

No trabalho atual, penduradas culturas gota foram empregadas para gerar micro-tecidos esféricas compactas ou "esferóides" de MSCs activado nas condições XF. O roteiro de investigação na Figura 1 mostra que MSCs são encorajados a auto-montar em esferóides quando suspensas em pendurar gotas durante 72 horas, após o que os esferóides, ou o CM carregado com fatores terapêuticos derivados da esfera, pode ser recolhida e potencialmente utilizado em ambos p...

Discussão

O MSC ideal para uso em algumas aplicações de pesquisa e clínicos devem ser altamente activado para maximizar o seu benefício, e, preferencialmente, preparados em condições XF quimicamente definidos para minimizar a entrega de antígenos potenciais de componentes do meio xenog�icas como FBS. Nos protocolos descritos aqui, têm demonstrado que os métodos para 1) activar as MSCs em cultura 3D por formação de esferóides, 2) atingir a activação 3D das MSCs em condições XF, 3) avaliar os níveis de activa?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling