Produzione e somministrazione di Therapeutic staminali mesenchimali / stromali cellulare (MSC) Spheroids innescato in Culture 3-D, in condizioni Xeno-free

Riepilogo

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Abstract

Mesenchimali staminali / cellule stromali (MSC) sono molto promettenti in bioingegneria e medicina rigenerativa. MSC possono essere isolate da più tessuti adulti attraverso la loro forte aderenza alla plastica coltura dei tessuti e poi ulteriormente espanse in vitro, più comunemente utilizzando siero fetale bovino (FBS). Poiché FBS può causare MSC diventare immunogeno, la sua presenza nelle culture MSC limita sia applicazioni cliniche e sperimentali delle cellule. (XF) media liberi-xeno Pertanto, gli studi impiegando chimicamente definiti per le culture MSC sono estremamente preziose. Molti effetti benefici di cellule staminali mesenchimali sono state attribuite alla loro capacità di regolare l'infiammazione e l'immunità, soprattutto attraverso la secrezione di fattori immunomodulatori come fattore di necrosi tumorale-stimolata gene 6 (TSG6) e prostaglandina E2 (PGE2). Tuttavia, MSC richiedono l'attivazione per la produzione di questi fattori e dal momento che l'effetto di MSC è spesso transitoria, grande interesse è emerso per scoprire modi di pre-attivando le cellule prior per il loro utilizzo, eliminando così il tempo di ritardo per l'attivazione in vivo. Qui vi presentiamo i protocolli per attivare in modo efficiente o MSC primi tridimensionale culture (3D) in condizioni XF chimicamente definite e per amministrare questi MSC pre-attivati in vivo. In particolare, abbiamo prima descritto metodi per generare MSC sferica micro-tessuti o "sferoidi" in gocce appesi utilizzando media XF e dimostrare come le sfere e mezzo condizionato (CM) possono essere raccolte per varie applicazioni. In secondo luogo, descriviamo schermi di espressione genica e saggi in vitro funzionali di valutare rapidamente il livello di attivazione MSC in sferoidi, sottolineando il potenziale anti-infiammatori e anti-cancro delle cellule. In terzo luogo, si descrive un nuovo metodo per iniettare sferoidi MSC intatti nel mouse cavità peritoneale in vivo prove di efficacia. Nel complesso, i protocolli qui superare le grandi sfide di ottenere cellule staminali mesenchimali pre-attivato in chimica definita XF concondizioni e offrono un sistema flessibile per amministrare sferoidi MSC per le terapie.

Introduzione

Staminali mesenchimali / cellule stromali (MSC) hanno mostrato un grande potenziale di vari approcci medicina rigenerativa. MSC sono stati inizialmente isolato come componente stromale del midollo osseo, ma da allora sono stati ottenuti da numerosi altri tessuti adulti, tra tessuto adiposo ^{1, 2, 3.} È interessante notare che il metodo di isolamento principale abbraccia la notevole proprietà di MSC di aderire saldamente plastica coltura tissutale in presenza di siero fetale bovino (FBS). Sebbene questa tecnica tradizionale isolamento consente una facile e rapida espansione delle MSC in due dimensioni (2D) cultura, è anche molto artificiale e ignora significato del ambiente nativo tridimensionale (3D) che porta alla perdita potenziale di importanti caratteristiche cellulari ^{4, 5 , 6.} Pertanto, lo studio delle MSC in colture 3D, chesono più fisiologico di culture 2D tradizionali, è emerso nella ricerca di "diminuiti perduti /" caratteristiche MSC. Inoltre, grande interesse è salito a identificare le condizioni (XF) senza xeno chimica definita per la cultura MSC e l'attivazione, e quindi rendere le cellule più suscettibili per le applicazioni cliniche.

Molti studi sono stati pubblicati che dimostrano la cultura 3D di MSC sia in biomateriali e come aggregati sferici o sferoidi. MSC in biomateriali sono stati inizialmente progettati per tecniche di ingegneria tissutale per sostituire i tessuti danneggiati con ponteggi cellule testa di serie, mentre le culture sferoidali di cellule staminali mesenchimali sono stati visti come un modo per capire il comportamento MSC in vivo dopo la somministrazione delle cellule per le terapie in studi pre-clinici o clinici ^{4, 5, 7.} È interessante notare che, MSC formano sferoidi spontaneamente quando l'aderenza alla plastica coltura dei tessuti non è consentito^{8, 9, 10.} Tradizionalmente, l'aggregazione delle cellule è stato facilitato da metodi pallone filatore o tecniche di sovrapposizione liquidi, metodi utilizzati inizialmente nella biologia del cancro negli sforzi per cercare di imitare il microambiente tumorale. Più di recente, ulteriori metodi sono emersi che dimostrano l'aggregazione delle cellule in piatti della cultura pre-rivestito con prodotti chimici specifici per prevenire cellula-plastica adesione ^{4, 5, 6.} Uno dei metodi più semplici ed economiche per generare sferoidi MSC è loro cultura in gocce appesi, una tecnica che è stato spesso usato per produrre corpi embrionali da cellule staminali embrionali. Con appendere cultura tecnica goccia, l'adesione delle cellule alla plastica coltura tissutale è impedito sospendendo le cellule in una goccia di mezzo sul lato inferiore del coperchio coltura tissutale piatto e permettendo la gravità per facilitare AGGREG cellulezione nel vertice della goccia. La dimensione sferoide può essere facilmente manipolata cambiando la concentrazione cellulare o il volume di goccia, rendendo culture goccia pendente particolarmente facili da controllare.

I primi studi sulla cultura 3D di cellule staminali mesenchimali hanno dimostrato differenze radicali nelle caratteristiche delle cellule in 3D rispetto alle loro controparti 2D ^{6, 8, 9.} Allo stesso tempo, i rapporti hanno dimostrato che gli effetti benefici di MSC in vivo affidamento sulla loro capacità di diventare attivato da stimoli microambientali e, in risposta, per produrre anti-infiammatori e immunomodulante fattori di ^11. È interessante notare che molti di questi fattori come la prostaglandina E2 (PGE2), fattore di necrosi tumorale-stimolata gene 6 (TSG6), e il fattore di crescita degli epatociti (HGF) sono state prodotte in quantità molto più grandi da sferoidi MSC rispetto MSC tradizionali 2D spianando la strada per la idea diutilizzando colture 3D per attivare le cellule ^{8, 12, 13.} Inoltre, l'attivazione genica in colture 3D apparve ricapitolare meccanismi, almeno in parte, di attivazione delle cellule dopo l'iniezione in topi ^12. Attivando MSC prima del loro utilizzo negli esperimenti, gli effetti delle cellule potrebbero essere prolungati e più prominente come l'effetto MSC tradizionale in vivo è spesso ritardata e transitori, e può essere descritto come "mordi e fuggi". Nel corso degli ultimi anni, importanti studi funzionali utilizzando sferoidi MSC hanno dimostrato che essi possono sopprimere le risposte infiammatorie e modulare l'immunità in vivo influenzando cellule effettrici come i macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, e le cellule T che fanno sferoidi una forma interessante di MSC innescato ^{2 , 3.} Inoltre, la produzione di molecole anti-cancro, come interleukin-24 (IL-24) e fattore di necrosi tumorale-correlati indurre apoptosi-ligando (TRAIL), sono aumentati in colture 3D di MSC rispetto al monostrato MSC, un fenomeno che potrebbe essere sfruttata per terapie antitumorali mirate ^{8, 10, 14.}

Come la cultura tradizionale MSC richiesto non solo l'uso di colture di tessuto di plastica, ma anche FBS, un altro ostacolo per rendere sferoidi MSC più suscettibili per uso clinico aveva da superare. Per affrontare questo ostacolo, abbiamo recentemente dimostrato formazione di sferoidi MSC sotto specifiche condizioni XF chimicamente definite e stabilito che le sferoidi MSC risultanti sono stati attivati per produrre le stesse molecole anti-infiammatori e anti-cancro come sferoidi generati in condizioni con FBS ^14. Qui, questi risultati sono presentati in diversi protocolli dettagliati che dimostrano la generazione di cellule staminali mesenchimali pre-attivati ​​nelle culture 3D utilizzando XFmedia. Inoltre, i protocolli vengono presentati che descrivono metodi efficaci per valutare i livelli di attivazione delle cellule staminali mesenchimali per quanto riguarda le loro anti-infiammatorio, anti-cancro effetti, insieme con un metodo pratico per trasportare sferoidi intatte in topi.

Protocollo

1. Isolamento MSC ed espansione

1. Ottenere MSC passaggio primi dal Centro per la preparazione e distribuzione di cellule staminali adulte ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html~~number=plural ) ¹⁵ fiale come congelati. In alternativa, isolare cellule staminali mesenchimali da aspirati midollari a seguito di un protocollo di routine ¹⁴ e memorizzare fiale come congelati.
2. Preparare terreno di coltura completo (CCM), che è minima alpha mezzo essenziale (αMEM) integrato con premium 15-20% selezionare FBS, 2 mM L-glutammina, e 1x penicillina streptomicina. Sterilizzare il mezzo per filtrazione.
3. Mettere 30 ml di CCM in un piatto di coltura cellulare 150 mm e incubare il piatto per 30 minuti a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO _2.
4. Incubare la fiala congelata contenente circa 10 ⁶ cellule staminali mesenchimali per 2 minuti in un bagno d'acqua 37 ° C.
5. Trasferire il contenuto della fiala al piatto cultura con un 5 ml pipetta sierologica e lavare il flacone più volte con 1-2 ml CCM dal piatto per catturare le cellule residue. Posizionare la notte piatto in un incubatore adeguato.
6. Lavare accuratamente la cultura due volte con temperatura ambiente tampone fosfato salino (PBS) e staccare le cellule staminali mesenchimali con 3 ml di soluzione pre-riscaldato 0,25% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Il distacco di solito prende circa 3-4 minuti in incubatrice.
7. Neutralizzare il tripsina nel piatto con 6 ml CCM pre-riscaldato a 37 ° C e trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 ml. Combinate con lavaggi di PBS per massimizzare la resa delle cellule.
8. Centrifugare le cellule (450 xg) per 10 min a temperatura ambiente e aspirare il surnatante.
9. Risospendere le cellule in un piccolo volume di CCM e contare le cellule vitali mediante un emocitometro e trypan blu.
10. Seme un numero adeguato di piatti da 150 mm a 100 cellule / cm ² in 30 ml di CCM caldo e incubare le culture fino a circa il 70-80% confluenti, di solito 7 giorni con il mezzo cambia ogni 2-3 giorni e 24-48 ore prima del raccolto.
11. Raccogliere le cellule come sopra con tripsina / EDTA e combinare tutte le celle in una singola provetta conica con il mezzo appropriato. Centrifugare ancora e risospendere le cellule in un piccolo volume dello stesso mezzo per la conta delle cellule. Utilizzare CCM standard (contenente FBS) o vari disponibili in commercio XF multimediali formulazioni, qui denominato XF medio-1 (XFM-1) e XF medio-2 (XFM-2), con e senza l'albumina sierica umana (HSA, 13 mg / ml) supplementazione.

2. Preparazione di Attivato MSC Spheroids in 3-D Hanging Culture goccia sotto XF Condizioni

1. Per generare sferoidi di circa 25.000 cellule, diluire il MSC raccolti in CCM, XFM-1, XFM-1 + HSA (13 mg / ml), XFM-2, o XFM-2 + HSA (13 mg / ml) a 714 cellule / ml.
2. Pipettare 35 microlitri / gocce delle cellule sula parte inferiore di un coperchio piatto di coltura invertita 150 mm. gocce multipli possono essere facilmente pipettati usando una pipetta multicanale.
   NOTA: Se sferoidi più o meno grandi sono desiderati, modificare la concentrazione cellulare o il volume goccia (25-45 ml) in modo appropriato.
3. Trasferire 20 ml di PBS a temperatura ambiente nella base del piatto e con un movimento continuo e costante capovolgere il coperchio, contenente le gocce, in modo che gli apici goccia rivolti verso il basso. Posizionare il coperchio con attenzione sulla base del piatto cultura.
4. Trasferire il piatto in incubatore per 3 giorni senza disturbarla per consentire il montaggio sfera appropriata.
5. Dopo 72 ore, iniziare la raccolta sferoide rimuovendo accuratamente il coperchio e invertendo così che le gocce, ancora una volta, rivolte verso l'alto.
6. Angle il coperchio a circa 10-20 ° e spingere le gocce, contenente gli sferoidi, al bordo piastra con un sollevatore cella.
7. Trasferire le sfere e media in una provetta conica da 15 ml con un tubo 1.000 microlitritte. Usa temperatura ambiente PBS e la pipetta con la stessa punta di lavare il piatto e garantire il recupero massimo sferoidi.
8. Per i saggi PCR in tempo reale (protocollo 3), centrifugare la sospensione sfera a 450 xg per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. Lavare i sferoidi con PBS e ripetere entrambe le fasi di centrifugazione e aspirazione. Per la consegna in animali (protocollo 8), permettono sfere di depositarsi sul fondo della provetta (~ 3-4 min) senza centrifugazione.

3. Real-time PCR di marcatori anti-infiammatori e anti-cancro

1. Utilizzare il kit di estrazione di RNA con colonne omogeneizzatore e RNase-Free DNase Set per isolare senza DNA RNA totale da cellule staminali mesenchimali monostrato (protocollo 1) e sferoidi MSC (protocollo 2), che sono stati lavati con PBS e centrifugato.
2. Lyse almeno 100.000 MSC monostrato e 20 sferoidi di ogni condizione di separati 15 ml provette coniche con tampone RLT contenente β-mercaptoetanolo (1: 100).
3. Transfer lisati accuratamente miscelati in provette da 1,5 ml RNase-free e posto in un congelatore (-80 ° C) per almeno 3 ore per aiutare nella lisi sferoide.
4. Scongelare i lisati cellulari su ghiaccio, vortex brevemente, e seguire le istruzioni del produttore per l'isolamento di RNA utilizzando un kit di isolamento RNA totale dei mammiferi disponibile in commercio.
5. Quantificare e valutare la qualità del RNA isolato utilizzando uno spettrofotometro.
6. Utilizzare l'alta capacità Kit cDNA trascrizione inversa o secondo equivalente alle istruzioni del produttore per generare cDNA per PCR in tempo reale.
7. I campioni di cDNA, progettato in commercio in tempo reale primer PCR / sonde (test di espressione genica), e PCR Master Mix in ghiaccio. Utilizzare primer / sonde per la GAPDH (controllo), PTGS2 (COX-2, anti-infiammatori), TNFAIP6 (TSG6, anti-infiammatori), TRAIL (anti-cancro), e IL-24 (anti-cancro).
8. Preparare le reazioni PCR in tempo reale in base alle istruzioni del produttore per l'espressione genica Assays e veloce Universal Master Mix.
9. Seguire le linee guida per lo strumento di PCR in tempo reale per la generazione dei documenti esperimento e l'esecuzione della corsa.
10. Analizzare i dati utilizzando il metodo ΔΔC _T calcolando le variazioni relative (quantità relativa, RQ) nell'espressione genica utilizzando GAPDH come il controllo e monostrato MSC endogeni come una linea di base ^{8, 14.}

4. Raccolta di CM per saggi di immunomodulante anti-cancro Potenziale

1. Raccogliere sferoidi e CM come sopra descritto in un tubo da 15 ml, con un sollevatore cellulare e una pipetta, tuttavia, non lavare i coperchi piatto con PBS come questo diluire il CM.
2. Centrifugare a 450 xg per 5 min a temperatura ambiente, cura il supernatante privo di cellule con una pipetta, e trasferire il surnatante in provette da 1,5 ml.
3. Centrifugare a 10.000 xg per 5-10 minuti a temperatura ambiente, raccogliere con attenzione la clCM arified con una pipetta, e trasferire il CM in nuovi tubi 1,5 ml per la memorizzazione in un congelatore (-80 ° C). Preparare aliquote della CM prima del congelamento quando lo si utilizza per analisi multiple.
   NOTA: Prima di eseguire test a valle, la concentrazione PGE2, un buon indicatore del potenziale anti-infiammatorio di CM, può essere determinato utilizzando un kit commerciale ELISA secondo le istruzioni del produttore. Concentrazione TSG6 può essere determinato utilizzando un protocollo pubblicato ^14.

5. macrofagi Assay per valutare il potenziale anti-infiammatorio di MSC-CM

1. Preparare medio macrofagi, che consiste medio di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) contenente L-alanil-L-glutammina e integrato con premio del 10% FBS e selezionare 1x penicillina-streptomicina. Filtro-sterilizzare il mezzo.
2. Ottenere una fiala congelata di circa 10 ⁶ J774 macrofagi di topo e incubare la fiala per 2 minuti in un bagno d'acqua 37 ° C.
3. trasferire il contenuto della fiala in un tubo da 15 ml, aggiungere 9 ml di terreno macrofagi, e centrifugare per 5 min a 200-300 xg ea temperatura ambiente.
4. Aspirare il surnatante, sospendere i macrofagi in 1 ml di terreno macrofagi, e trasferire i macrofagi in una capsula di Petri da 150 mm contenenti 30 ml di mezzo di macrofagi.
5. Cambiare la media ogni 2 giorni e incubare le cellule nell'incubatrice fino a circa il 70-80% confluenti.
   NOTA: I macrofagi non aderiscono strettamente alla capsula di Petri, quindi occorre prestare attenzione a non perdere le cellule con mezzo di cambiamento.
6. Raccogliere i macrofagi spruzzando il mezzo macrofagi sulle cellule con una pipetta. Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 ml e centrifugare per 5 min a 200-300 xg e temperatura ambiente.
7. Aspirare il surnatante e sospendere le cellule in un piccolo volume di terreno macrofagi per la conta delle cellule con un emocitometro. Regolare la concentrazione a 200.000 cellule / ml con macrofagi meDIUM.
8. Per iniziare il set up per il test dei macrofagi, aggiungere 480 ml di mezzo di macrofagi in pozzetti di una 12-pozzetti.
9. Aggiungere 20 ml di mezzo macrofagi nei pozzetti non stimolate controllo e 20 microlitri di non condizionata o medio MSC condizionata, preparata in precedenza, in pozzi sperimentali. Mescolare il mezzo nei pozzetti toccando la piastra.
10. Trasferire 500 microlitri della sospensione cellulare macrofagi ai pozzetti non stimolate controllo macrofagi.
11. Stimolare i restanti macrofagi con aggiunta di 1: 500-1: 1000 di 0,1 mg / ml lipopolisaccaride (LPS) e incubare 5-10 minuti a temperatura ambiente.
12. Trasferire 500 ml di macrofagi stimolati nei pozzetti con mezzo non condizionata o MSC-condizionata. Mescolare i pozzi dalla costante oscillare il piatto più volte.
13. Trasferire il piatto di un incubatore per 16-18 ore.
14. Raccolto medio macrofagi condizionata e centrifugare a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente.
15. Trasferimentoil surnatante in nuovi tubi e analisi per fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e il contenuto (IL-10) interleuchina-10 per kit ELISA commerciali seguito le istruzioni del produttore.

6. splenocyte test per valutare il potenziale immunomodulante di Spheroid-CM

1. Preparare medio splenocyte completo, che consiste di Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 mezzo supplementato con 10% FBS inattivato al calore, 1x penicillina streptomicina, e 2-mercaptoetanolo. Filtro-sterilizzare il mezzo.
2. Milza Harvest da eutanasia-topi maschi BALB / c attraverso un'incisione preparata sul lato sinistro dell'addome sopra la milza, circa a metà strada tra il arti anteriori e posteriori ^14. Trasferire la milza di un colino cella di 70 micron per isolare gli splenociti ^14.
3. Isolare i splenociti / linfociti spingendo la milza attraverso il filtro 70 micron in una sterile usin capsula di Petrig la gomma morbida / fine di plastica di un pistone da un 2-3 ml Siringhe ^14. Utilizzare un movimento circolare di rettifica per dissociare la milza.
4. Lavare il filtro cella più volte con PBS freddo e trasferire le cellule dalla capsula di Petri in una provetta conica da 50 ml. Riempire il tubo con PBS freddo e centrifugare (500 xg) a 4 ° C per 10 min.
5. Aspirare il surnatante e cancellare le cellule da eritrociti da incubazione con 5-10 ml di soluzione rosso lisi delle cellule del sangue (per milza) per 5-10 min.
6. Arrestare la lisi con l'aggiunta di PBS freddo al tubo e centrifugare per 5-10 minuti a 500 xg ed a 4 ° C.
7. Sospendere le cellule isolate in media splenocyte completo, filtrare con un colino 40 micron, e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Aggiungere mezzo splenocyte alla sospensione cellulare per ottenere una concentrazione cellulare finale di 10 ⁶ cellule / ml
   NOTA: Questa tecnica produce tipicamente circa 3 x 10 ⁷ splenociti per milza mouse.
8. Stimolare il numero appropriato di splenociti con 2 mg / ml di anticorpo anti-CD3e per 5 min.
   NOTA: La quantità di splenociti richiesto dipende dal numero di condizioni sperimentali come determinato dal ricercatore (vedi punto 6.9). Per ogni campione sperimentale / bene, sono necessari 10 ⁶ splenociti.
9. Trasferire 10 ⁶ splenociti (stimolato o non-stimolata) in pozzetti di una 12-pozzetti e aggiungere non condizionata (controlli) o MSC-CM in pozzi a diluizione finale di 1: 10-1: 20.
10. Raccogliere il CM splenocyte dopo 24 ore e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
11. Trasferire il surnatante in nuovi tubi e test per l'interferone gamma (IFN-γ) i contenuti di kit ELISA commerciale seguendo le istruzioni del produttore.

7. cancro alla prostata test per valutare il potenziale anti-cancro di Spheroid-CM

1. Preparare completo terreno di coltura RPMI che è di media RPMI-1640 integrato con 10% FBS, 1x penicillina-streptomicina.
2. Ottenere una fiala congelata di cellule tumorali della prostata LNCaP e incubare la fiala per 2 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C.
3. Trasferire il contenuto del flacone in un piatto di coltura contenente 30 ml di completo terreno di coltura RPMI utilizzando una pipetta motorizzato e un 5 ml pipetta sierologica. Lavare più volte il flacone con il supporto dal piatto e mettere il piatto in incubatrice.
4. Poco prima che le cellule raggiungono la confluenza, lavare la cultura due volte con PBS a temperatura ambiente e staccare le cellule LNCaP con 3 ml di soluzione di pre-riscaldato 0,25% tripsina / EDTA.
5. Neutralizzare il tripsina nel piatto con mezzo completo RPMI crescita e trasferire le cellule insieme con lavaggi in una provetta conica da 50 ml.
6. Centrifugare le cellule a 450 xg per 10 min a temperatura ambiente e aspirare il surnatante.
7. Risospendere le cellule in piccolo volume del terreno completo di crescita RPMI e contare le cellule tumorali con un emocitometro.
8. Trasferimento cellule LNCaP in un piatto da 96 pozzetti a 5.000 cellule / pozzetto in 120 ml di terreno di coltura RPMI completo contenente il 25% di non condizionata o sferoide-CM. Incubare in incubatrice per 72 ore.
9. Per eseguire un saggio di crescita cellulare utilizzando un kit di saggio di proliferazione cellulare, aspirare il terreno dai pozzi e trasferire la piastra in un congelatore (-80 ° C) per almeno 3 ore.
   1. Scongelare la piastra e lisare le cellule in ciascun pozzetto aggiungendo 100 ml di reagente di lisi cellulare contenente 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, e 0,2 mg / ml RNasi A.
   2. Per una curva standard, quantità note di lisare cellule LNCaP come descritto sopra.
   3. Dopo 1 ora, aggiungere 100 ml di tampone di lisi cellulare 1x contenente diluizione 1: 100 di proliferazione cellulare reagenti del dosaggio e misurare la fluorescenza in ciascun pozzetto per determinare la quantità di cellule.

8. Consegna intraperitoneale di Spheroids Intact

1. Preparare MSC sferoidali come descritto in precedenza (protocollo 2) e risospendere tegli sfere in soluzione sterile di Hank salina bilanciata (HBSS) supplementato con 0,2-0,5% HSA per mantenere condizioni XF. HSA nella soluzione consente di evitare l'adesione sfera in plastica durante l'iniezione.
2. Trasferire 40-120 sferoidi in 15 ml provette coniche e lavare le cellule con l'aggiunta di 6 ml HBSS / HSA ai tubi. Lasciare 3-4 minuti per le sfere a scendere. Preparare un tubo conico indipendente sferoidi per ciascun animale. Inoltre, preparare ulteriori tubi di sferoidi per le analisi che determinano ritenzione sferoide (vedi 8.18 sotto) e la produzione di fattori terapeutici dopo il trasferimento (vedi 8.19 sotto) se lo si desidera.
3. Aspirare il surnatante, sovrapporre le sferoidi con 100-200 ml di sterile HBSS integrato con 0,2-0,5% HSA, e posizionare i tubi in ghiaccio.
4. Brevemente anestetizzare gli animali con 2% isoflurano in ossigeno al 100% fino alla scomparsa del riflesso pinch-punta per circa 2 min nella camera di induzione.
5. Posto l'animale all'interno della BSL-2 gabinetto, aspe dorsalect giù (lato ventrale rivolto verso l'alto), con il flusso continuo di miscela isoflurano / ossigeno 1,5% con un cono.
6. Pulire l'addome del mouse inferiore con un antisettico alcol, come 70%.
7. Togliere il tappo del 20 G per via endovenosa (IV) del catetere ed eseguire l'iniezione intraperitoneale con il complesso di catetere-stiletto. Con una mano tenere la pelle mouse e un'altra per eseguire l'iniezione. Individuare il punto di iniezione circa a metà di una linea artificiale che collega una zona comune e genitale ginocchio flesso con la punta dell'ago rivolta verso la linea mediana.
   NOTA: Il complesso di catetere-stiletto ha una resistenza superiore a quella di un ago normale, quindi, la cura deve essere presa per non iniettare l'ago troppo in profondità nell'addome, che potrebbe causare lesioni agli organi interni. La penetrazione della pelle e quindi i muscoli / membrana peritoneale può essere sentito durante il posizionamento del catetere.
8. Rimuovere delicatamente il metallo stiletto / ago dal complesso di catetere-stiletto. check lo stiletto di sangue, urine e feci ed eliminarla. Sangue sulla ago indica la perforazione di organi interni (s).
9. Tenere il catetere di plastica in posizione verticale durante le iniezioni per permettere il flusso del fluido.
10. Verificare il corretto posizionamento del catetere di plastica iniettando circa 100 ml di sterile HBSS / HSA attraverso il catetere con una pipetta con una punta di 100-200 ml. Posizionare l'estremità del puntale all'interno dell'adattatore del catetere siringa formare una tenuta ermetica. Lentamente iniettare il fluido all'interno della cavità peritoneale.
    NOTA: Il fluido in un catetere posizionato correttamente sarà circolare liberamente all'interno della cavità peritoneale con solo piccole regolazioni del catetere. scorretto posizionamento del catetere (sottocutanea o intra-intestinale, o se la punta dell'ago feriti organi peritoneali come reni) aumenta la resistenza e ridurre il flusso. posizionamento sottocutaneo si tradurrà in una formazione di una "bolla" ovvio sotto la pelle.
11. raccogliere tha MSC sferoidi, preparati in 100-200 ml di HBSS / HSA (passo 8.3), utilizzando un puntale 200 microlitri, e trasferire l'intero volume di sfere (40-120 sfere) nella cavità peritoneale attraverso il catetere come descritto sopra.
12. Lavare il tubo contenente sfere con 100 ml di HBSS / HSA utilizzando la stessa punta come sopra per raccogliere eventuali residui sferoidi e iniettare nella cavità peritoneale.
13. (Opzionale) Iniettare ulteriori 100 ml di HBSS / HSA nella cavità peritoneale per lavare il catetere.
14. Posizionare la garza imbevuta di antisettico sopra il catetere e rimuovere lentamente il catetere dalla cavità peritoneale e scartarla.
15. massaggiare delicatamente la cavità peritoneale con le dita per assicurare una distribuzione uniforme degli sferoidi.
16. Lasciate che l'animale recuperare sotto stretta sorveglianza e guardare per sanguinamento dal sito di iniezione.
17. Ispezionare il catetere e tubo da 15 ml per i restanti sferoidi. È normale osservare alcune sfere dellacatetere / tubo.
    NOTA: La tecnica descritta per MSC consegna sferoide può essere adottata per l'utilizzo in animali normali o in una varietà di modelli di pregiudizio. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per iniettare sferoidi in topo lesione corneale e modelli endotossemia, così come in un modello di peritonite zymosan indotta ^8.
18. Per quantificare il numero di sferoidi portati a nuovo (opzionali), utilizzare un numero di cellulare di quantificazione kit / reattivo basato sul DNA. Tenere il catetere utilizzato il tubo da 15 ml e vigorosamente erogare HBSS / HSA attraverso il catetere per costringere i restanti sfere di nuovo nel tubo da 15 ml.
    1. Centrifugare la provetta 15 ml a 500 xg per 5 min a temperatura ambiente e aspirare il surnatante. Trasferire la provetta contenente il pellet sferoide in un congelatore (-80 ° C) per almeno 3 ore.
    2. Scongelare il tubo e lisare le sfere aggiungendo 500 ml di reagente di lisi cellulare contenente 180 mM NaCl, 1 mM EDTA, e 0,2 mg / ml RNasi A.
    3. Per un controllo, freeze e lisare una quantità nota di sferoidi (preferibilmente pari al numero di sferoidi preparate per una singola iniezione) come sopra descritto.
    4. Dopo 1 ora, trasferire 100 ml di lisato cellulare, in duplice copia, in una micropiastra a 96 pozzetti e aggiungere in ogni pozzetto 100 ml di buffer di lisi cellulare 1x contenente una diluizione 1:50 della proliferazione cellulare reattivo Reazione dal kit. Dopo 10 minuti, misurare la fluorescenza in ciascun pozzetto per determinare il numero di sfere che non sono stati iniettati confrontando il campione sperimentale (s) con il campione di controllo.
19. Valutare il livello di attivazione di sferoidi preparati per l'iniezione (opzionale), misurando la concentrazione di PGE2 e TSG6 prodotto da sfere trasferiti. Trasferimento 40-120 sfere attraverso il catetere, come descritto sopra, in un 12-pozzetti o 6 pozzetti contenenti 1 o 2 ml αMEM addizionato con 2% FBS e 1x penicillina / streptomicina. Posizionare le piastre in incubatrice per 6 ore.
    1. Trasferire il supporto dali pozzi dopo 6 ore in 1,5 o provette da 15 ml e centrifugare le provette a 450 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Trasferire il surnatante acellulare in freschi provette da 1,5 ml con una pipetta e centrifugare a 10.000 xg per 5-10 minuti a temperatura ambiente.
    3. Trasferire il CM chiarito (surnatante) in nuove provette da 1,5 ml e test per la concentrazione PGE2 (buon indicatore del potenziale anti-infiammatorio di CM) utilizzando un kit commerciale ELISA secondo le istruzioni del produttore. Concentrazione TSG6 può essere determinato utilizzando un protocollo pubblicato ^14.

Risultati

Nel lavoro attuale, appesi culture goccia sono stati impiegati per generare compatte micro-tessuti sferiche o "sferoidi" di MSC attivati ​​in condizioni XF. La tabella di marcia in fase di sperimentazione in figura 1 illustra che le MSC sono incoraggiati a auto-assemblarsi in sferoidi quando sospeso in appeso gocce per 72 ore, dopo di che gli sferoidi, o la CM carichi di fattori terapeutici sfera-derivati, possono essere raccolti e potenzialmente utilizzati...

Discussione

La MSC ottimale per l'uso in alcune applicazioni di ricerca e clinica deve essere altamente attivato per massimizzare il loro vantaggio, e preferibilmente prodotta in condizioni XF chimicamente definite per ridurre al minimo la consegna dei potenziali antigeni dai componenti di media xenogene quali FBS. Nei protocolli descritti qui, abbiamo dimostrato metodi a 1) attivare MSC nella cultura 3D dalla formazione di sferoidi, 2) ottenere l'attivazione 3D di cellule staminali mesenchimali in condizioni XF, 3) valutar...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM-α (minimal essential medium alpha)	ThermoFisher/Gibco	12561049; 12561056; 12561072	minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select	Atlanta Biologicals	S11595; S11510; S11550; S11595-24	component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine	ThermoFisher/Gibco	25030081; 25030149; 25030164	component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher/Gibco	15070063	component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane	MilliporeSigma	SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE	media sterilization
150 mm cell culture dish	Nunc	D8554 SIGMA	cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator	Thermo Fisher	Model 3110	incubation of cultured cells
Early passage MCSs	Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White	NA	preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath	VWR	89501-468	warming media to 37 °C
Pipettes	Eppendorf	492000904	manual liquid handling
Pipete-Aid	Drummond Scientific Company	4-000-300	handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml)	Corning	4487; 4101; 4251; 4490	liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4	ThermoFisher/Gibco	10010023; 10010072; 10010031; 10010049	cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution	ThermoFisher/Gibco	25200056; 25200072; 25200114	lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352097	cell centrifugation
50 ml conical tube	Corning/BD Falcon	352098	cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge	Eppendorf/Fisher Scientific	Model 5810R	cell centrifugation
hemocytometer	Fisher Scientific	26716	cell counting
trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154 SIGMA	dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)	ThermoFisher/Gibco	A1067501	Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2)	Stem Cell Technologies	5420	Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin)	Gemini	800-120	Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin)	Sigma-Aldrich	A9731 SIGMA	Component of xeno-free MSC media
Total RNA isolation Mini Kit	Qiagen	74104	Total RNA extraction
Qiashredder	Qiagen	79654	Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set	Qiagen	79254	On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250 ALDRICH	inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex	VWR	97043-562	mixing sample
Spectrophotometer	Biorad	NA	RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit	ThermoFisher/Applied Biosystems	4368814	transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays	ThermoFisher/Applied Biosystems	varies	primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix	ThermoFisher/Applied Biosystems	4352042; 4364103; 4366073; 4367846	master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)	ABI Prizm	NA	real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube	Eppendorf	22364111	cell centrifugation, sample collection and storage
(-80 °C) freezer	Thermo Fisher	Model Thermo Forma 8695	sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit	R&D Systems	KGE004B	estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium)	ThermoFisher/Gibco	10566-016; 10566-024;10566-032	macrophage culture media
J774 mouse macrophages	ATCC	TIB-67	mouse macrophage cell line
12-well plate	Corning	3513	in vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide)	Sigma-aldrich	L4130	in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit	R&D Systems	MTA00B	estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit	R&D Systems	M1000B	estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium	ThermoFisher/Gibco	11875-085	splenocyte culture media
BALB/c mice	The Jackson Laboratory	651	in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified	eBioscience	145-2C11	in vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer	Corning	352350	Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x)	Affymetrix eBioscience	00-4333	removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit	R&D Systems	MIF 00	estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells	ATCC	CRL-1740	study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit	ThermoFisher	C7026	cell number measurement based on DNA content
NaCl	Sigma-Aldrich	S5150	component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	ThermoFisher	FERR1021	calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A	Qiagen	19101	RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader	BMG Technology	NA	Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher/Gibco	14175079	resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane	MWI Vet Supply	502017	Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas	Praxair	NA	For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet	Thermo Fisher	Model 1385	Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch	Terumo	SR*FNP2025	Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips	Eppendorf	varies	liquid/cells handling