إعادة برمجة خلايا المشروطة للأطفال الإنسان المريء طلائي للاستخدام في هندسة الأنسجة وأمراض التحقيق

Summary

التوسع في خلايا المريء للأطفال الإنسان الظهارية باستخدام برمجة مشروطة يوفر المحققين ويبلغ عدد سكانها المريض محددة من الخلايا التي يمكن استخدامها لهندسة البنى المريء لزرع ذاتي لعلاج العيوب أو الإصابات وتكون بمثابة خزان لفحوصات الكشف العلاجية.

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

وقد هندسة الأنسجة المريء والمريء يوزيني (EOE) والتركيز على البحوث في العديد من المختبرات على مدى العقد الماضي. العيوب الخلقية، مثل رتق المريء، وينظر في ما يقرب من 1 في 4000 ولادة حية، مما يؤدي إلى تطوير ناقصة من المريء مما يؤدي إلى عدم القدرة على تناول الطعام ^1. وكانت الإصابة وانتشار EOE في الارتفاع منذ التعرف على كيان المرض في عام 1993. وقوع EOE تختلف 0،7 حتي 10 / 100،000 فرد في السنة وتراوح انتشار ،2-43 / 100000 ^2. نهج الجراحية جذابة جديدة لعلاج الفجوة الطويلة رتق المريء يتمثل في توليد بنيات الأنسجة لزرع باستخدام خلايا المريض نفسه. وهذه الخلايا بالتزامن مع السقالات الاصطناعية توليد وبناء ذاتي التي لا تتطلب قمع المناعي. وقد بدأت بعض الجماعات بالفعل للتحقيق في الولايات المتحدة(ه) من خلايا شبيهة بخلايا المنشأ لهندسة الأنسجة المريء ³ فضلا عن استخدام الخلايا الظهارية المريء الأم إلى إعادة في الغشاء المخاطي ^4-7. الأمراض التي تكون موجودة في المريء من الأطفال المرضى من الصعب تشخيص أو دراسة دون تدخل في كثير من الأحيان. وعلاوة على ذلك، النماذج الحيوانية الاستفادة أو في المختبر تخليد نماذج خط الخلية لأمراض الأطفال مثل EOE لا تشمل المرض والتسبب في الدقيق أو الاختلافات المحددة للمرضى ^8. ولذلك، فإن القدرة على دراسة عملية مرض المريض في المختبر من أجل تحديد المرض مما اثار مستضدات معينة، وتقييم الآليات الكامنة وتحقيق العلاجات الدوائية ستكون رواية وتوفير الأطباء مع المعلومات التي يمكن أن تساعد في علاج المريض.

كانت هناك العديد من أنواع الخلايا ذاتي أو المريض محددة التي تم اقتراحها لاستخدامها في TISSUالهندسة الإلكترونية ودراسة المرضية الأمراض التي تصيب البشر. ومع ذلك، تقتصر بعض هذه أنواع الخلايا في قدرتها على توليد ما يكفي من الخلايا من النمط الظاهري محدد البذور سقالة كبيرة أو أداء إنتاجية عالية في الدراسات المختبرية. وقد تم استخدام الخلايا الجذعية المحفزة أو متعددة القدرات موضوع الكثير من النقاش الأبحاث، ولكن، والقيود وأوجه القصور لاستخدام هذه الخلايا قد وصفت بشكل جيد ^9. استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وناقش غاية وتقدم العديد من القضايا الأخلاقية. الأهم من ذلك، هذه الخلايا تشكل مسخي المبيض، والتي تتشابه إلى الورم، إذا لم تكن متباينة من دولة المحفزة فيها قبل تسليمها إلى الحية المضيفة ^10. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا الجذعية الجنينية لا يكون المريض محددة، ويمكن أن يثير رد فعل الصنعية والحاجة إلى قمع المناعة ^10. الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) هي الخلايا المحفزة التي يمكن أنأن تستمد من خلايا المريض نفسه. الخلايا الجسدية، مثل خلايا الجلد، ويمكن أن يتسبب في حالة المحفزة باستخدام مجموعة متنوعة من تقنيات متكاملة وغير متكاملة. هذه الخلايا بعد ذلك بمثابة مصادر خلية المريض محددة لهندسة الأنسجة أو التحقيق المرض. دمج المادة الوراثية غير المرغوب فيها في هذه الخلايا هو مصدر قلق كثير وقد وصفت وحتى لو المتتاليات هي تماما iPSCs إزالتها تظهر للحفاظ على "الذاكرة" جينية نحو نوع من الخلايا التي كانت مستمدة ^11. هذه الخلايا أيضا ستشكل مسخي المبيض في الجسم الحي إن لم يكن يفرق قبل الزرع ^(11). وقد تم التحقيق في العديد من البروتوكولات التمايز التركيز على الأنساب الظهارية ^{12، 13، 14،} ومع ذلك، فمن المهم جدا أن نلاحظ أن أنواع الخلايا مما يؤدي في نهاية التمايز ليست متجانسة و Oنلي امتلاك جزء من نوع من الخلايا في المصالح. وهذا يؤدي إلى انخفاض المحصول والحاجة إلى تنقية نوع من الخلايا المطلوبة. على الرغم من أن iPSCs هي مصدر الخلايا المحتمل المريض محددة، وعملية للحصول على نوع من الخلايا في المصالح إما هندسة الأنسجة أو التحقيق المرض غير فعال جدا.

وتم عزل الخلايا الظهارية البشرية بنجاح من مجموعة متنوعة من كل من الأنسجة المريضة وغير المريضة في الجسم البشري بما في ذلك: سرطان الرئة ^15، وسرطان الثدي ^16، الأمعاء الدقيقة ¹⁷ والقولون ^18، المثانة ¹⁹ والمريء ^20. من المهم أن نلاحظ أن الخلايا الأولية البشرية لديها عدد محدود من المقاطع التي يتم الحفاظ على النمط الظاهري ^{21، 22.} للأسف، وهذا يعني أن عدد الخلايا اللازمة لتحقيق مرض أو لبذر سقالة هندسيالزرع قد لا يتحقق. لذلك، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة لتوسيع خلايا المريض في حين لا يزال الحفاظ على النمط الظاهري الظهارية. وقد وصفت إعادة برمجة مشروطة من الخلايا الظهارية الطبيعية والسرطانية باستخدام الخلايا المغذية ومثبط ROCK في 2012 من قبل ليو وآخرون. ^{2 3.} وقد استخدمت هذه التقنية لتوسيع الخلايا الظهارية السرطانية التي تم الحصول عليها من خزعات من البروستات وسرطان الثدي باستخدام الخلايا المغذية المشع، ROCK المانع والمتوسطة برمجة المشروط. وكان الهدف هو توليد ما يكفي من الخلايا لفحوصات في المختبر مثل فحص المخدرات. هذه التقنية قادرة على توسيع الخلايا الظهارية إلى أجل غير مسمى ب "إعادة برمجة" هذه الخلايا الجذعية أو حالة تشبه السلف، وهو التكاثري للغاية. وقد ثبت أن هذه الخلايا غير قابلة للمكون للأورام ولا تمتلك القدرة على تشكيل مسخي المبيض ^{23 و 24.} وعلاوة على ذلك، لاكانت شذوذ الكروموسومات أو التلاعب الجيني الحالية بعد الركض هذه الخلايا في الثقافة باستخدام هذه التقنية ^{23، 24.} الأهم من ذلك، هذه الخلايا قادرة على التمايز إلى نوع من الخلايا الأصلية من الفائدة فقط. لذلك، هذه التقنية توفر مخزون كبير من خلايا المريض محددة الظهارية للتحقيق مرض أو هندسة الأنسجة دون الحاجة لتخليد.

الحصول على الأنسجة الظهارية من جهاز معين لدراسة عمليات المرض غالبا ما يكون محدودا وليس من الممكن دائما بسبب خطر المريض. بالنسبة لأولئك المرضى الذين يعانون من أمراض المريء أو عيوب، بالمنظار استرجاع الخزعة هو نهج مينيملي للحصول على الأنسجة الظهارية التي يمكن فصلها وإعادة برمجتها مشروط لتوفير مصدر الخلية إلى أجل غير مسمى غير محددة في الغشاء المخاطي في المريء أن المريض. هذا ثم يسمح لفي الدراسات المختبريةمن الخلايا الظهارية لتقييم العمليات المرض والبحث عن العلاجات المحتملة. عملية مرض واحد التي يمكن أن تستفيد كثيرا من هذا النهج هو الإيزونوفيلي التهاب المريء، والتي وصفت بأنها أمراض الحساسية من المريء ^8. اختبارات الحساسية وكذلك طرق علاجية يمكن تقييمها في المختبر باستخدام خلايا الظهارية الخاصة للمريض ويمكن بعد ذلك أن يتم تمرير هذه البيانات على الطبيب المعالج لوضع خطط العلاج الفردي. تقنية إعادة البرمجة الشرطية بالتعاون مع الحصول على الخزعات بالمنظار من الأطفال المرضى وتقدم القدرة على توسيع الخلايا الظهارية المريء العادية إلى أجل غير مسمى من أي مريض. ولذلك يمكن تعاونت هذا المصدر خلية جنبا إلى جنب مع السقالات الطبيعية أو الاصطناعية لتوفير خيار المريض محددة الجراحي للعيوب أو المرض أو الصدمة. أن وجود عدد الخلايا إلى أجل غير مسمى مساعدة مهندس يبني المريء التي تمتلك reseeded تماماالتجويف مع الخلايا الظهارية المريء من أجل المساعدة في تسهيل تجديد أنواع الخلايا المتبقية.

Protocol

وقد تم الحصول على عينات للفحص المريء بعد الحصول على الموافقة المسبقة من الآباء / أولياء الأمور من الأطفال المرضى وفقا للمجلس المراجعة المؤسسية (IRB # 13-094).

1. أدوات تعقيم والجيلاتين الحل

1. ملقط الأوتوكلاف، شفرات الحلاقة ومقص قبل التعامل مع الأنسجة لمنع التلوث.
2. لجعل 200 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين، والجمع بين 200 مل من الماء المقطر مع 0.2 غرام من الجيلاتين. الأوتوكلاف وبارد قبل استخدامها.

2. طلاء لوحات زراعة الأنسجة

1. حوالي 2 ساعة قبل عزل الخلايا، إضافة ما يكفي من الجيلاتين 0.1٪ لتغطية صحن زراعة الأنسجة (100 ملم)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
   ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون هذه اللوحات في وقت سابق ويوضع في حاضنة قبل الاستخدام.

3. صنع انزيم الحل لالتفكك

1. ما يقرب من 30 دقيقة قبل عزل الخلايا، تزن خارج10 وحدات من dispase على التوازن على أساس وحدة في تركيز مليغرام في القارورة. وضع المسحوق في أنبوب مخروطي 15 مل مع 10 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) ووضعه في 37 ° C حمام الماء.

4. صنع خلية متوسطة الثقافة

1. لجعل 50 مل من المتوسط ​​برمجة المشروط، مزج المكونات التالية في أنبوب العقيمة المخروطية: 35 مل من F12 (هام والمتوسطة)، 11.5 مل من DMEM، و 0.5 مل من L-الجلوتامين، 0.5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين، 2.5 مل من مصل بقري جنيني (FBS)، 250 ميكروغرام من الأنسولين البشري، 500 نانوغرام من عامل نمو البشرة البشري (EGF).
2. لجعل 500 مل من 3T3 المتوسطة، خلط 50 مل من FBS و 5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين و 5 مل من L-الجلوتامين مع 500 مل من DMEM.
3. لجعل 500 مل من الخلايا الكيراتينية المصل خالية المتوسطة، ذوبان الجليد EGF والأبقار النخامية استخراج (BPE) المكملات الغذائية (المتوفرة مع وسائل الإعلام). إضافة ملاحق مل زجاجة 500 متوسطة أساسية وإضافة 5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين

5. التثقيف واضاءة 3T3 الخلايا كمصدر تغذية

1. إعداد 3T3 المتوسطة، التي تضم DMEM، و 10٪ FBS، 1X البنسلين / الستربتومايسين و2 مم L-الجلوتامين.
2. ثقافة 3T3 الخلايا في الأنسجة المعالجة T-75 قوارير قبل 3 أيام على الأقل من وصول عينات المرضى.
   1. قبيل وصول عينات المرضى، ويعرض للتريبسين 3T3 الخلايا باستخدام 5 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA في القارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى معظم الخلايا تطفو
3. إضافة 5 مل من 3T3 المتوسطة لوقف التفاعل. نضح تعليق الخلية ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. تدور لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
4. نضح المتوسطة و resuspend الخلايا في حجم محدد من التريبان الأزرق لعد الخلايا. الجمع بين 10 ميكرولتر من الخلايا مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق لاستبعاد الخلايا الميتة. تحميل 10 ميكرولتر من هذا الحل على عدادة الكريات لحساب الخلية.
   ملاحظة: للحصول على هذا بروتوالعقيد، كثافة البذر ل3T3 الخلايا المشع هو 10،900 الخلايا لكل سم ^2، أي ما يعادل 600000 خلايا لكل لوحة 100 ملم.
5. قسامة عدد الخلايا اللازمة لوحة لوحة 100 ملم في عينة المريض وresuspend في 25 مل من 3T3 المتوسط ​​في أنبوب مخروطي 50 مل وأشرق مع 3000 راد.
6. بعد التشعيع، وخلايا تدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 300 x ج و resuspend في المتوسط ​​برمجة مشروط في 5 مل لكل لوحة 100 ملم.
7. تعيين أنبوب جانبا حتى يأخذ الطلاء من خلايا المريض في وقت لاحق في البروتوكول (راجع الخطوة 7.6).

6. الحصول على وحفظ ونقل الأطفال المريء الخزعات

1. إضافة 5 مل من المصل خالية المتوسطة القرنية كاملة مع 100 ميكروغرام / مل primocin لأنابيب مخروطية 15 مل وإحضاره إلى منشأة طبية على الجليد.
   ملاحظة: هذه الأنابيب المتوسطة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر.
2. الحصول على ما يقرب من 8 الخزعات المريء في منظمة الشفافية الدوليةلي من التنظير ومستقل على النحو التالي:
   1. وضع ستة الخزعات في مل المخروطية 15 تحتوي على كامل القرنية المتوسطة مجانا المصل مع 100 ميكروغرام / مل primocin ومكان على الجليد الرطب.
   2. وضع خزعة واحدة في 5 مل من الفورمالين مخزنة ومكان على الجليد الرطب.
   3. وضع خزعة واحدة في خزعة صغيرة cryomold مع الأمثل مجمع درجة حرارة القطع.
      1. على الفور إسقاط هذا القالب في كوب من نظير البنتان وضعها في النيتروجين السائل. مرة واحدة المجمدة، ضع cryomold في كيس العينة وتخزينها على الثلج الجاف في وعاء رغوة البوليسترين.
3. وضع أنابيب تحتوي على الخزعات في المتوسطة أو الفورمالين داخل كيس قابل للغلق وبعد ذلك في علبة الشحن التي تحتوي على الجليد الرطب. ختم وتسمية مربع مع التسمية واقية ونقلها إلى المختبر.
   ملاحظة: الحاوية التي تحتوي على الثلج الجاف والخزعة المجمدة مختومة أيضا وصفت مع تسمية اقية.

7. معالجةالأنسجة للمريض للثقافة وتحليل المصب

1. لدى وصوله الى المختبر، ونقل خزعة المجمدة على الثلج الجاف إلى -80 درجة مئوية الفريزر لباجتزاء المصب أو استخراج الحمض النووي الريبي. وضع العينة في الفورمالين. تخزين في 4 درجات مئوية الثلاجة والسماح لإصلاح بين عشية وضحاها.
2. تدور الخزعات المتبقية إلى أسفل في 300 x ج، ونضح المتوسطة. إضافة 10 مل من dispase حل للأنبوب مخروطي الشكل، وختم والسماح لها لاحتضان عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة.
3. بعد الحضانة، وتدور الخزعات إلى أسفل في 300 × ز. نضح الخزعات المتوسطة و resuspend في 5 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA.
4. نقل 5 مل من التربسين-EDTA تحتوي على خزعات لوحة معقمة 100 ملم واللحم المفروم الخزعات باستخدام 2 شفرات الحلاقة معقمة كما غرامة ممكن.
5. نقل 5 مل من التربسين-EDTA تحتوي على الخزعات المفروم إلى جديد 15 مل المخروطية. شطف لوحة مرتين مع 5 مل إضافية من 0.05٪ التربسين-EDTA وإضافة إلى المخروطيةالة النفخ. احتضان الأنبوب لمدة 10 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
6. بعد الحضانة، وتدور الخزعات إلى أسفل في 300 x ج (1.4 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق، ونضح المتوسط. إضافة 5 مل من المتوسط ​​برمجة مشروط لأنبوب مخروطي الشكل وكذلك 5 مل من المتوسط ​​برمجة المشروط الذي يحتوي على الخلايا المغذية المشع (راجع الخطوة 5.7).
7. إضافة ROCK المانع (1 ميكرولتر / مل) إلى 10 مل من تعليق خلية ولوحة بعد الشفط الجيلاتين من صحن زراعة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية.

8. التثقيف وخلايا التوسع

1. بعد حوالي 5 أيام من الثقافة، نضح في والمتوسطة الأولي التي تحتوي على قطع مفروم-الخزعة وشطف طبق 2-3 مرات مع 5 مل برنامج تلفزيوني العقيمة. إضافة سيلة جديدة لوحة بما في ذلك المانع ROCK في 10 ميكرومتر.
2. عند الوصول إلى 70٪ confluency، توسيع الخلايا. إضافة 5 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA لوحة واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية أي أكثر من 2.5 دقيقة لإزالة الالخلايا المغذية ه. وبعد أن الحضانة، ونضح التربسين-EDTA وشطف لوحة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
3. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 5 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA لوحة واحتضان لمدة 5-10 دقائق أو حتى الخلايا هي فضفاضة من لوحة. إضافة كميات متساوية من متوسطة إلى لوحة لوقف التفاعل ونقل جميع السوائل إلى أنبوب 50 مل المخروطية وتدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
4. Resuspend الخلايا في حجم محدد من المتوسطة برمجة المشروط ومزيج 10 ميكرولتر من تعليق مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق. الاعتماد على عدادة الكريات لتحديد إجمالي عدد الخلايا.
5. لتوسيع الخلايا، إضافة 1 مليون خلية المريء الإنسان إلى لوحة 150 ملم مع 1.2 مليون المشع 3T3 الخلايا في الحجم الكلي لل15 مل. إضافة ROCK المانع جديدة على 10μM وإضافة تعليق الخلية على طبق الجيلاتين المغلفة 150 ملم.

9. خلايا تجميد وتخزين الإنسان المريء طلائي

1. لجعل تجميد المتوسطة، إضافة 10٪DMSO إلى متوسطة برمجة المشروط. بعد trypsinizing والعد، قسامة الخلايا لتجميد في أنبوب 50 مل المخروطية جديد وتدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
2. نضح المتوسطة وإضافة تجميد المتوسطة في حجم 2 مل لكل cryovial. مرة واحدة تعليق خلية متجانسة، قسامة 10 ⁶ خلايا في cyrovials المسمى مسبقا. مكان في وعاء التجميد في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل قبل تحريك قارورة لتخزين الطويل الأجل النيتروجين السائل.

النتائج

وتتلخص ملخص من الخطوات الرئيسية في عزل الخلايا الظهارية المريء من الخزعات المريض في الشكل 1. سوف مستعمرات الخلايا الظهارية تشكل في حوالي 4-5 أيام، وسوف تكون محاطة الخلايا الليفية التغذية (الشكل 2A). ومع توسع هذه المستعمرات أنها سو...

Discussion

أهم الخطوات من أجل عزل وتوسيع الخلايا الظهارية المريء من الخزعات المريض هي: 1) عدم الربط على نحو كاف الأنسجة الخزعة مع الحد الأدنى من موت الخلايا. يضاف 2) ضمان المانع ROCK إلى مستنبت الخلية في كل تغيير المتوسط؛ 3) لا تستخدم أكثر من الخلايا المغذية من الموصى بها. 4) الحفاظ عل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150 mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50 mL Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658