ティッシュ・エンジニアリングと疾病調査に使用するための小児のヒト食道上皮細胞の条件付き再プログラミング

要約

条件付き再プログラミングを利用した人の小児食道上皮細胞の拡大は、欠陥やけがを治療し、治療的スクリーニングアッセイのためのリザーバとして機能する自家移植のために食道の構築物を設計するために利用することができる細胞の患者特有の人口を持つ研究者を提供します。

要約

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

概要

食道組織工学と好酸球性食道炎（EoEのは）過去10年間で多くの研究室での研究の焦点となっています。このような食道閉鎖症などの先天性の欠陥は^、1を食べることができないことにつながる食道の不完全な開発につながる約1 4000で出生、に見られます。 EoEのの発生率と罹患率は1993年に病気のエンティティの識別EoEのの発生率は、人年あたり0.7から10 / 100,000に変化し、有病率は0.2〜43 /10万²の範囲であって以来、増加しています。長いギャップ食道閉鎖症を治療する新しい魅力的外科的アプローチは、患者自身の細胞を用いた移植のための組織構築物を生成することにあります。合成足場に関連してこれらの細胞は、免疫抑制を必要としない自己の構築物を生成します。いくつかのグループには、すでに私たちを調査し始めています^{7 -}食道組織工学³だけでなく、ネイティブの食道上皮細胞の使用のための幹細胞様細胞のeは粘膜^4を再入力します。小児患者の食道内に存在している疾患は、多くの場合、診断または介入なしで勉強するのは難しいです。また、利用する動物モデルまたはin vitroで、正確な疾患の病因または患者特異的な差異^8を包含しないEoEのような小児疾患の細胞株モデルを不死化。したがって、抗原を誘発する特定の疾患を同定する基礎となるメカニズムを評価し、薬物治療を調べるために、インビトロで患者の疾患の過程を研究する能力は、新規であると患者の治療を助けることができる情報を臨床医に提供します。

TISSUにおける使用のために提案されてきた多くの自己または患者特異的細胞型がありました電子工学およびヒト疾患の病因を研究。しかしながら、これらの細胞型のいくつかは、大きな足場をシードまたはインビトロ試験で高いスループットを実行するために特定の表現型の十分な細胞を生成する能力が限られています。多能性又は多分化能性幹細胞の使用は、多くの研究の議論の主題となっているが、これらの細胞を使用するための制限および欠点がよく^9に記載されています。ヒト胚性幹細胞の使用は非常に議論し、多くの倫理的な問題を提示されています。最も重要なことは、これらの細胞は、それらが前の生きたホスト¹⁰にそれらを提供すること、それらの多能性状態と区別されていない場合、腫瘍に類似している奇形腫を形成します。また、胚性幹細胞の使用は、患者特異的ではないであろうと、同種異系応答および免疫抑制¹⁰の必要性を誘発する可能性があります。人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、そのでき多能性細胞であります患者自身の細胞から誘導することができます。このような皮膚細胞などの体細胞は、統合および非統合の様々な技術を用いて、多能性状態に誘導することができます。次いで、これらの細胞を組織工学または疾患の研究のための患者特異的細胞源として働きます。これらの細胞内への不必要な遺伝物質の統合は、多くが記載されているとの配列が完全に除去性IPSCは、彼らが^11を誘導された細胞型に向けてエピジェネティックな「記憶」を節約するために表示されている場合でも問題です。移植¹¹の前に分化していない場合、これらの細胞は、 生体内で奇形腫を形成します。多くの分化プロトコルは、しかし、分化の終了時に得られた細胞型が均一とOではないことに注意することは非常に重要であり、上皮系統^12、13、14に着目し研究されていますNLY目的の細胞型の割合を有します。このことは、低い収率および所望の細胞型を精製する必要が生じます。 iPS細胞は、潜在的な患者特有の細胞源であるが、組織工学又は疾患の調査のどちらかのために目的の細胞型を得るためのプロセスは非常に非効率的です。

肺^15、胸^16、小腸^17、結腸^18、膀胱¹⁹および食道^20：ヒト上皮細胞が正常に含む人体の両方の罹患および非罹患種々の組織から単離されています。ヒト初代細胞の表現型は^{、21、22を}維持する通路の有限数があることを留意することが重要です。残念ながら、このことは、疾患の研究のために又は操作足場に播種するために必要なセルの数移植のために達成されない場合があります。したがって、新たな技術が依然として上皮表現型を維持しながら、患者の細胞を拡大するために必要とされます。フィーダー細胞及びROCK阻害剤を用いた、正常および癌性上皮細胞の再プログラミング条件は、Liu らにより2012年に記載されました。 ^{2 3。}この技術は、照射されたフィーダー細胞を、ROCK阻害剤および条件付き再プログラミング媒体を使用して、前立腺癌および乳癌の生検から得られた癌性上皮細胞を拡大するために利用されました。目標は、このような薬物スクリーニングなどのin vitroアッセイのための十分な細胞を生成することでした。この技術は、幹細胞または高度に増殖性である前駆体のような状態へのこれらの細胞の「再プログラミング」によって無期限に上皮細胞を拡大することが可能です。これらの細胞は、非腫瘍形成性であり、奇形^23、24を形成する能力を有さないことが実証されています。また、無染色体異常または遺伝子操作は、この技術^23,24を用いて培養中のこれらの細胞を継代した後に存在しました。最も重要なことは、これらの細胞は、目的のネイティブな細胞型に分化することができます。したがって、この技術は不死化を必要とせずに、疾患の調査や組織工学のための患者特有の上皮細胞の大規模な貯水池を提供しています。

疾患過程を研究するために、特定の器官の上皮組織を入手することは、患者のリスクを常に頻繁に制限されないことが可能です。食道疾患や欠陥を患っている患者では、内視鏡生検の取得は解離し、条件付きでその患者の食道の粘膜に特異的である不定細胞源を提供するために再プログラムすることができ上皮組織を得るための低侵襲性アプローチです。これは、その後、in vitro試験を可能にします上皮細胞の潜在的な治療のための疾患過程と画面を評価しました。非常にこのアプローチから利益を得ることができる1つの疾患過程は、食道⁸のアレルギー性疾患として記載された好酸球性食道炎です。アレルギー試験ならびに治療的アプローチは、患者自身の上皮細胞を用いてin vitroで評価することができ、このデータは、個別の治療計画を開発するために、治療する医師に渡すことができます。小児患者からの内視鏡生検を得ることに関連して、条件付き再プログラミングの技術は、任意の患者から無期限に正常食道上皮細胞を拡張する機能を提供しています。この細胞源は、したがって、欠陥、病気や外傷のための患者固有外科的選択肢を提供するために、天然または合成の足場と一緒に組んですることができました。不定細胞数を持つことは、完全に再播種持って食道のコンストラクトを設計に役立つだろう残りの細胞タイプの再生を促進するのを助けるために、食道の上皮細胞でルーメン。

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プロトコル

インフォームドコンセントは、小児患者の両親/保護者から入手し、治験審査委員会（IRB＃13から094）に従ってた後食道生検が得られました。

1.殺菌楽器とゼラチン溶液

1. オートクレーブ鉗子、かみそりの刃及び汚染を防止するために、組織を処理する前に鋏。
2. 0.1％ゼラチン溶液200mLを作るために、ゼラチンを0.2gと蒸留水200mLを組み合わせます。使用前にオートクレーブし、冷却。

2.コーティング組織培養プレート

1. 前の細胞単離に約2時間、組織培養皿、（100 mm）をカバーし、細胞培養インキュベーター中、37℃でインキュベートするのに十分な0.1％のゼラチンを加えます。
   注：これらのプレートはまた、事前に作製し、使用する前に、インキュベーター内で維持することができます。

3.解離のための酵素溶液を作ります

1. 前細胞単離するのに約30分、秤量バイアル上ミリグラム濃度あたりの単位に基づいてバランスにディスパーゼの10単位。 37℃の水浴中で10 mLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）のと場所で15 mLコニカルチューブ内の粉末を配置します。

4.メイキング細胞培養培地

1. F12の35ミリリットル（ハム培地）、DMEMの11.5 mLを、L-グルタミンの0.5 mLを、100×ペニシリン/ストレプトマイシンの0.5 mLを、2.5mLの：無菌コニカルチューブに以下の成分を混ぜて、条件付き再プログラミング媒体の50mLのを作るために、ウシ胎児血清（FBS）の、ヒトインスリンの250μgのヒト上皮成長因子（EGF）の500 ngの。
2. 3T3培地の500ミリリットルを作るために、FBSの50ミリリットル、100×ペニシリン/ストレプトマイシン及びDMEM 500mLのとL-グルタミンの5 mLを5 mLのを混ぜます。
3. ケラチノサイト無血清培地の500ミリリットルを作成するには、EGF及び（メディアで提供）は、ウシ下垂体抽出物（BPE）のサプリメントを解凍。基本培地の500ミリリットルボトルにサプリメントを追加し、10の5 mLを加え0xのペニシリン/ストレプトマイシン

フィーダーソースとして5.培養し、照射3T3細胞

1. DMEM、10％FBS、1×ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミンを含む、3T3培地を準備します。
2. 文化少なくとも3日間患者サンプルの到着前組織で処理されたT-75フラスコ中の3T3細胞。
   1. 前患者サンプルの到着、フラスコ当たり0.25％トリプシンEDTA 5mLのを使用してトリプシン処理3T3細胞へと5分間、またはほとんどの細胞が浮遊するまで37℃でインキュベートするだけ
3. 反応を停止さ3T3培地の5ミリリットルを追加します。細胞懸濁液を吸引し、15 mLコニカルチューブに移します。 300×gで5分間スピン。
4. 培地を吸引し、細胞計数のためにトリパンブルーの定義された量で細胞を再懸濁します。死細胞を排除するためにトリパンブルーの10μLで細胞の10μLを兼ね備えています。細胞計数のための血球計数器の負荷、この溶液10μLを。
   注：このプロトについてcolが、照射された3T3細胞のための播種密度は100ミリメートルプレート60万の細胞に等しい、1cm ²当たり10,900細胞です。
5. 50 mLコニカルチューブに3T3培地25mLに患者サンプルを再懸濁当たりの100mmプレートにプレートし、3000ラドで照射するのに必要な細胞の数をアリコート。
6. 照射後、100ミリメートルのプレートあたり5 mLで条件付き再プログラミング培地で300×gで再懸濁で5分間細胞をスピンダウン。
7. 患者の細胞のメッキは、プロトコルの後半に行われるまで脇にチューブを設定し（ステップ7.6を参照してください）。

6.小児食道生検の保存や輸送、入手方法

1. コニカルチューブ15 mLに100μg/ mLのprimocinとの完全なケラチノサイト無血清培地5 mLを加え、氷上で医療施設にそれを持って来ます。
   注：媒体のこれらの管は、最大2ヶ月間4℃で保存することができます。
2. TIで約8食道生検を取得内視鏡検査の私と、以下のように区切ります。
   1. 100μg/ mLのprimocinと濡れた氷の上の場所との完全なケラチノサイト無血清培地を含む15 mLコニカルに6生検を置きます。
   2. 濡れた氷の上に緩衝ホルマリンと場所の5mLに1生検を置きます。
   3. 最適切削温度化合物とcryomold小さな生検で1生検を置きます。
      1. 直ちに液体窒素中に配置されたイソペンタンのビーカーに、この金型をドロップします。いったん凍結し、標本袋にcryomoldを置き、発泡スチロール容器内のドライアイス上で保存します。
3. 密封可能な袋の内側とウェット氷を含む輸送用ボックスに培地またはホルマリンで生検を含むチューブを置きます。密封し、バイオハザードラベルと箱にラベルを付け、実験室に運びます。
   注：ドライアイスを含むコンテナおよび冷凍生検はまた、密封し、バイオハザード標識で標識されています。

7.処理ダウンストリーム文化と分析のために、患者の組織

1. 実験室に到着すると、下流の切片またはRNA抽出のためのCの冷凍庫-80にドライアイス上で凍結した生検を転送します。ホルマリンにサンプルを置きます。 4℃の冷蔵庫に保管し、一晩固定することができます。
2. 300×gで、残りの生検をスピンダウンし、培地を吸引除去します。円錐管、シールのディスパーゼ溶液10mlを加え、それを15分間、水浴中で37℃でインキュベートすることを可能にします。
3. インキュベーション後、300×gで生検をスピンダウン。 0.05％トリプシンEDTA 5mLの培地を再懸濁生検を吸引します。
4. 100ミリメートル滅菌プレートに生検を含むトリプシンEDTA 5mLのを転送し、可能な限り細かいとして2滅菌カミソリの刃を使用して生検をミンチ。
5. 新しい15 mLコニカルにみじん切りの生検を含むトリプシンEDTA 5mLのを転送します。 0.05％トリプシンEDTAの追加5 mLでプレートを2回すすぎ、円錐に追加チューブ。 37℃の水浴中で10分間チューブをインキュベートします。
6. インキュベーション後、5分間300×gで（1.4 RPM）で生検をスピンダウンし、培地を吸引除去します。円錐管だけでなく、放射線照射フィーダー細胞を含む条件付き再プログラミング培地5 mLに条件付き再プログラミング媒体の5 mLを加え（ステップ5.7を参照してください）。
7. 組織培養皿からゼラチンを吸引した後、細胞懸濁液とプレートの10 mLにROCK阻害剤（1μL/ mLで）を追加します。 37℃でインキュベートします。

8.細胞を培養すると拡大

1. 文化の約5日後、刻んだ生検断片を含む初期培地を吸引し、5mLの滅菌PBSでシャーレに2-3回すすいでください。 10μMでのROCK阻害剤を含むプレートに新しいメディアを追加します。
2. 70％の密集度に到達すると、細胞を拡大。プレートに0.05％トリプシンEDTA 5mLのに加え、37℃のインキュベーターに目を削除するには、no以上2.5分間インキュベートEフィーダー細胞。そのインキュベーション後、トリプシンEDTAを吸引し、PBS 5mLでプレートをすすぎます。
3. PBSを吸引し、プレートに0.25％トリプシンEDTA 5mLのを追加し、5〜10分間、または細胞がプレートからルーズになるまでインキュベートします。反応を停止し、50 mLコニカルチューブに流体のすべてを譲渡し、5分間、300×gでスピンダウンするプレートに培地の等量を追加します。
4. 条件付き再プログラミング媒体の定義された量で細胞を再懸濁し、トリパンブルーの10μLとサスペンションの10μLを混合します。総細胞数を決定するために、血球計数器でカウントします。
5. 、細胞を拡大120万と一緒に150ミリメートルプレートに100万人の食道細胞を追加するには15ミリリットルの全容量で3T3細胞を照射しました。 10μMで新鮮なROCK阻害剤を追加し、ゼラチンコートした150ミリメートル皿に細胞懸濁液を追加します。

9.フリーズおよびストアヒト食道上皮細胞

1. 凍結培地にするために、10％を追加条件付き再プログラミング媒体にDMSO。トリプシン処理し、計数した後、新しい50 mLコニカルチューブに凍結し、5分間、300×gでスピンダウンする細胞を分取。
2. 培地を吸引し、クリオバイアル当たり2ミリリットルで培地を凍結追加します。細胞懸濁液が均質になったら、前標識されたcyrovials 10 ⁶細胞のアリコート。長期液体窒素貯蔵にバイアルを移動する前に、少なくとも24時間、-80℃で凍結容器内に配置します。

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結果

患者の生検から食道上皮細胞を単離における重要なステップの概要を図1に要約されています。上皮細胞のコロニーは約4-5日で形成され、線維芽細胞フィーダー細胞（ 図2A）に囲まれます。これらのコロニーが拡大するにつれ、彼らはより大きなコロニー（ 図2B）を形成するために他のコロニーと合併します。培養物が70％コンフ?...

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ディスカッション

患者の生検から食道上皮細胞を分離し、拡大するために最も重要な手順は次のとおりです。1）適切最小限の細胞死と生検組織を解離させます。 2）ROCK阻害剤は、すべての培地交換で細胞培養培地に添加されていることを確認します。 3）推奨よりも多くのフィーダー細胞を使用しないでください。 4）クリーンな無菌の文化を維持します。 5）コンフルエンスに到達する直前に継代細胞。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150 mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50 mL Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658