Reprogramação condicional de células Pediátrica Humano esofágico epiteliais para uso em Engenharia de Tecidos e Doença de Investigação

Resumo

Expansão de células epiteliais humanas esofágicas pediátricos utilizando reprogramação condicional fornece investigadores com uma população específica no paciente de células que pode ser utilizada para engenharia construções esofágicas autólogo para implantação para tratar defeitos ou ferimentos e servir como um reservatório para ensaios de pesquisa de terapêuticos.

Resumo

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introdução

engenharia de tecidos e esofagite eosinofílica (EoE) têm sido o foco de pesquisas em muitos laboratórios ao longo da última década. Defeitos congênitos, como a atresia de esôfago, são vistos em aproximadamente 1 em cada 4.000 nascidos vivos, o que resulta no desenvolvimento incompleto do esôfago levando à incapacidade de comer ^1. A incidência e prevalência de EoE têm vindo a aumentar desde a identificação da entidade doença em 1993. A incidência de EoE variou entre 0,7 a 10 / 100.000 por pessoa-ano e a prevalência variou de 0,2-43 / 100.000 ^2. Uma nova abordagem cirúrgica atraente para o tratamento de longo intervalo atresia esofágica consiste na geração de construções de tecido para implante utilizando as células do próprio paciente. Estas células em conjunto com o andaime sintético irá gerar um construto autólogo que não exige imunossupressão. Alguns grupos já começaram a investigar os EUAe de células estaminais, como para engenharia de tecido esofágico ^3, bem como a utilização de células epiteliais esofágicas nativas para repovoar a mucosa ^4-7. Doenças que estão presentes no esófago do paciente pediátrico são muitas vezes difíceis de diagnosticar ou estudar sem intervenção. Além disso, utilizando modelos animais ou in vitro imortalizado modelos da linha celular para doenças pediátricas como EoE não abranger a patogênese da doença exata ou diferenças específicas dos pacientes ^8. Portanto, a capacidade para o estudo do processo de doença de um paciente in vitro, a fim de identificar antigénios específicos de doença desencadeamento, avaliar os mecanismos subjacentes e investigar tratamentos com drogas seria novo e proporcionar aos médicos com informações que podem ajudar no tratamento do paciente.

Tem havido muitos tipos de células autólogas ou específicas do paciente que têm sido propostas para utilização em tissue engenharia e estudando patogênese da doença humana. No entanto, alguns destes tipos de células são limitados na sua capacidade para gerar células suficientes de um fenótipo específico para semear um grande andaime ou executar alto rendimento em estudos in vitro. O uso de células-tronco pluripotentes ou multipotentes tem sido o tema de muita discussão pesquisa, no entanto, limitações e insuficiências para o uso dessas células têm sido bem descrito ^9. A utilização de células estaminais embrionárias humanas é altamente debatido e apresenta muitas questões éticas. Mais importante, estas células formam teratomas, que são semelhantes a um tumor, se eles não são diferenciados a partir de seu estado pluripotentes antes de entregar os em um hospedeiro vivo ^10. Além disso, a utilização de células estaminais embrionárias não seria-específico do paciente e pode desencadear uma resposta alogénica e a necessidade para a supressão imune ^10. Induzidas células-tronco pluripotentes (iPSCs) são células pluripotentes que podemser derivado a partir de células do próprio paciente. As células somáticas, tais como as células da pele, pode ser induzido para um estado pluripotente usando uma variedade de técnicas de integração e não-integrativos. Essas células, então, servir como uma fonte de células específicas do paciente para engenharia de tecidos ou de investigação da doença. A integração de material genético indesejado para estas células é uma preocupação muitos descreveram e mesmo sequências são completamente removidos iPSCs aparecem para conservar uma "memória" epigenética para o tipo de célula a partir da qual eles foram derivados ^11. Estas células também irá formar teratomas in vivo, se não diferenciadas antes do transplante ^11. Muitos protocolos de diferenciação têm sido investigados concentrando-se em linhagens epiteliais ^{12, 13, 14,} no entanto, é muito importante notar que os tipos de células que resultam no final de diferenciação não são homogéneos e óomente possuir uma fracção do tipo de células de interesse. Isto resulta em baixo rendimento e a necessidade de purificar o tipo de célula desejado. Embora iPSCs são uma potencial fonte de células específicas do paciente, o processo para obter um tipo de células de interesse, quer para a engenharia de tecidos ou de investigação da doença é muito ineficiente.

Células epiteliais humanas foram isolados com sucesso a partir de uma variedade de ambos os tecidos doentes e não doentes no corpo humano, incluindo: ¹⁵ pulmão, de mama ^{16, 17} intestino delgado, cólon ^{18, 19} da bexiga e do esófago ^20. É importante notar que as células humanas primárias têm um número finito de passagens em que o fenótipo é mantida ^{21, 22.} Infelizmente, isto significa que o número de células necessário para a investigação da doença ou para semear um andaime engenhariapara o implante não pode ser alcançado. Portanto, as novas técnicas são necessários para expandir células do paciente enquanto ainda mantém um fenótipo epitelial. Reprogramação condicional de células epiteliais normais e cancerosos utilizando células alimentadoras e inibidor ROCHA foi descrito em 2012 por Liu et al. ^{2 3.} Esta técnica foi utilizada para expandir células epiteliais cancerosas obtidos a partir de biópsias de câncer de próstata e de mama, utilizando células de alimentação irradiadas, inibidor ROCHA e médias reprogramação condicional. O objetivo era gerar células suficientes para ensaios in vitro, como o rastreio de drogas. Esta técnica é capaz de se expandir células epiteliais indefinidamente por "reprogramar" as células para um tronco ou progenitoras estado semelhante, que é altamente proliferativo. Foi demonstrado que estas células são não-tumorigénico e não possuem a capacidade para formar teratomas ^{23, 24.} Além disso, nenhumanomalias cromossómicas ou manipulações genéticas estavam presentes após passaging estas células em cultura usando esta técnica ^{23, 24.} Mais importante ainda, essas células só são capazes de se diferenciar em células do tipo nativo de interesse. Portanto, esta técnica oferece um grande reservatório de células epiteliais específicos do paciente para investigação da doença ou engenharia de tecidos sem a necessidade de imortalização.

A obtenção de tecido epitelial de um órgão específico, a fim de estudar processos de doença é muitas vezes limitada e nem sempre é possível, devido ao risco de paciente. Para os pacientes que sofrem de doença ou defeitos esofágico, recuperação endoscópica biópsia é uma abordagem minimamente invasiva para a obtenção de tecido epitelial que podem ser dissociados e condicionalmente reprogramadas de modo a proporcionar uma fonte de células indefinida que é específico para a mucosa do esófago que do paciente. Isso, então, permite estudos in vitrodas células epiteliais para avaliar os processos de doença e tela para potenciais agentes terapêuticos. Um processo de doença que poderiam beneficiar grandemente de esta abordagem é esofagite eosinofílica, que tem sido descrita como doença alérgica do esófago ^8. Testes de alergia, bem como abordagens terapêuticas poderiam ser avaliada in vitro utilizando as próprias células epiteliais do paciente e estes dados podem então ser transmitida para o médico assistente para desenvolver planos de tratamento individualizado. A técnica de reprogramação condicional em conjunto com a obtenção de biópsias endoscópicas de pacientes pediátricos oferece a capacidade de expandir as células epiteliais do esôfago normais por tempo indeterminado a partir de qualquer paciente. Esta fonte de células poderiam, portanto, ser agrupado em conjunto com andaimes natural ou sintética para fornecer uma opção cirúrgica específica para cada paciente por defeitos, doença ou trauma. Ter um número de celular por tempo indeterminado ajudaria engenharia construções de esôfago que possuem uma completamente reseededlúmen com células epiteliais esofágicas, a fim de ajudar a facilitar a regeneração dos tipos de células restantes.

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Protocolo

biópsias esofágicas foram obtidos após consentimento informado foi obtido dos pais / responsáveis ​​dos pacientes pediátricos e de acordo com a placa de revisão institucional (IRB # 13-094).

1. esterilização de instrumentos e gelatina Solution

1. forceps autoclave, lâminas de barbear e tesouras antes de manusear do tecido para evitar a contaminação.
2. Para fazer 200 ml de solução de gelatina a 0,1%, combinar 200 mL de água destilada com 0,2 g de gelatina. Autoclave e fresco antes da utilização.

2. revestindo placas de cultura de tecidos

1. Aproximadamente 2 h antes do isolamento das células, suficiente adicionar 0,1% de gelatina, para cobrir uma placa de cultura de tecido (100 mm) e incuba-se a 37 ° C numa incubadora de cultura de células.
   NOTA: Estas placas também pode ser feita antes do tempo e mantido na incubadora antes de utilização.

3. Fazer Solução de Enzima para a dissociação

1. Aproximadamente 30 minutos antes do isolamento de células, pesar10 unidades de dispase em um equilíbrio com base nas unidades por miligrama concentração no frasco. Colocar o pó num tubo cónico de 15 mL com 10 mL de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) e colocar num banho de água a 37 ° C.

4. Fazer celular Meio de Cultura

1. Para fazer com que 50 ml de meio de reprogramação condicional, misturar os seguintes ingredientes em um tubo estéril cónico: 35 ml de F12 (Meio de Ham), 11,5 mL de DMEM, 0,5 mL de L-glutamina, 0,5 ml de 100 x penicilina / estreptomicina, 2,5 mL de soro fetal de bovino (FBS), 250 ug de insulina humana, 500 ng de factor de crescimento epidérmico humano (EGF).
2. Para tornar a 500 mL de meio de 3T3, misturar 50 mL de FBS, 5 mL de 100 x penicilina / estreptomicina e 5 mL de L-glutamina, com 500 mL de meio DMEM.
3. Para fazer 500 ml de meio isento de soro queratinócitos, descongelar suplementos extrato de pituitária bovina (BPE) (fornecidos com a mídia) EGF e. Adicionar aos complementos do mL garrafa de meio base 500 e adicionar 5 mL de 100 x penicilina / estreptomicina

5. cultura de células e irradiando 3T3 como fonte Feeder

1. Prepare forma 3T3, que compreende DMEM, FBS a 10%, 1x penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina.
2. Cultura em células 3T3 tratadas com tecido frascos T-75, pelo menos, 3 dias antes da chegada de amostras de doentes.
   1. Pouco antes da chegada das amostras dos pacientes, trypsinize 3T3 utilizando 5 mL de 0,25% de tripsina-EDTA por frasco e incubar a 37 ° C durante 5 min ou até que a maioria das células são flutuante
3. Adicionar 5 mL de 3T3 meio para parar a reacção. Aspirar a suspensão de células e transferir para um tubo cónico de 15 mL. Rotação durante 5 minutos a 300 x g.
4. Aspirar o meio e ressuspender as células em um volume definido de tripano azul para contagem das células. Combinar 10 mL de células com 10 uL de azul Tripano para excluir as células mortas. Carga de 10 uL desta solução em um hemocitómetro para contagem das células.
   NOTA: Para este protocol, densidade de sementeira de células irradiadas 3T3 é 10.900 células por ^cm2, que é igual a 600.000 células por placa de 100 mm.
5. Alíquota o número de células necessárias para chapear uma placa de 100 mm por amostra do paciente e ressuspender em 25 ml de 3T3 meio num tubo cónico de 50 mL e irradiar com 3000 rads.
6. Após a irradiação, as células de spin para baixo por 5 min a 300 x g e ressuspender em meio reprogramação condicional em 5 mL por placa de 100 mm.
7. Definir o tubo de lado até que o revestimento de células do paciente ocorre mais tarde no protocolo (ver passo 7.6).

6. Obtenção, Preservar e Transportar pediátricos esofágicas Biópsias

1. Adicionar 5 ml de meio isento de soro queratinócitos completo com 100 mcg / mL primocin 15 tubos cônicos ml e trazê-lo para o centro médico no gelo.
   NOTA: Estes tubos de meio pode ser armazenado a 4 ° C durante até 2 meses.
2. Obter aproximadamente 8 biópsias esofágicas na ti-me de endoscopia e separada como segue:
   1. Coloque seis biópsias no mL cônico de 15 contendo meio sem soro completa de queratinócitos com 100 mcg / mL primocin e colocar no gelo molhado.
   2. Coloque uma biopsia em 5 ml de formalina tamponada e colocar em gelo molhado.
   3. Coloque uma biópsia em uma pequena biópsia cryomold com o composto ideal temperatura de corte.
      1. Imediatamente diminua este molde para uma proveta de isopentano colocado em azoto líquido. Uma vez congelado, o cryomold colocar num saco de amostra e armazenar em gelo seco num recipiente de espuma de poliestireno.
3. Coloque os tubos contendo biópsias em médio ou formol dentro de um saco selado e em seguida, em uma caixa de transporte contendo gelo molhado. Selar e rotular a caixa com uma etiqueta de risco biológico e transportá-lo para o laboratório.
   NOTA: O recipiente que contém o gelo seco e congelado biópsia também é selado e etiquetado com uma etiqueta de risco biológico.

7. ProcessamentoTecido do paciente para a Cultura e Análise Downstream

1. À chegada ao laboratório, transferir a biópsia de congelação em gelo seco a -80 ° C congelador por corte a jusante ou a extração de RNA. Colocar a amostra em formalina. Armazenar em um C geladeira 4 ° e permitir corrigir durante a noite.
2. Girar as biópsias restantes para baixo a 300 xg, e aspirar o meio. Adicionar 10 mL de solução de dispase ao tubo cónico, vedação e permitir que a incubar a 37 ° C num banho de água durante 15 min.
3. Após a incubação, as biópsias girar para baixo a 300 x g. Aspirar as biópsias médio e ressuspender em 5 mL de 0,05% de tripsina-EDTA.
4. Transferir a 5 mL de tripsina-EDTA contendo as biópsias para uma placa de 100 mm e estéril mediu as biópsias utilizando 2 lâminas de barbear esterilizados tão fina quanto possível.
5. Transferir a 5 mL de tripsina-EDTA contendo biópsias picadas para um novo 15 mL cónico. Lavar a placa duas vezes com um adicional de 5 mL de 0,05% de tripsina-EDTA e adicionar ao cónicatubo. Incubar o tubo durante 10 minutos num banho de água a 37 ° C.
6. Após a incubação, as biópsias girar para baixo a 300 xg (1,4 rpm) durante 5 min e aspirar o meio. Adicionar 5 mL de meio de reprogramação condicional para o tubo cônico, bem como a 5 mL de meio de reprogramação condicional contendo as células de alimentação irradiadas (veja o passo 5.7).
7. Adicionar inibidor de rocha (1 mL / mL) ao 10 mL de suspensão de células e aspiração do prato depois de gelatina do prato de cultura de tecidos. Incubar a 37 ° C.

8. A cultura e Células de Expansão

1. Depois de aproximadamente 5 dias de cultura, aspirar o médio inicial contendo os pedaços picados por biópsia e lave o prato 2-3 vezes com 5 mL de PBS estéril. Adicionar novo meio para a placa incluindo inibidor ROCHA em 10? M.
2. Ao atingir 70% de confluência, expandir as células. Adicionar 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para a placa e incubar numa incubadora a 37 ° C não superior a 2,5 min para remover the células alimentadoras. Na sequência desta incubação, aspirar a tripsina-EDTA e lavar a placa com 5 ml de PBS.
3. Aspirar o PBS e adicionar 5 mL de 0,25% de tripsina-EDTA para a placa e incubar durante 5-10 minutos ou até que as células estão soltas a partir da placa. Adicionar quantidades iguais de forma que a placa para parar a reacção e transferir todo o fluido para um tubo cónico de 50 mL e girar a 300 xg durante 5 min.
4. Ressuspender as células num volume definido de forma condicional reprogramação e misturar 10 ul da suspensão com 10 mL de azul de tripano. Contar com um hemocitômetro para determinar o número total de células.
5. Para expandir células, adicionar 1 milhão de células esofágicas humanos para uma placa de 150 mm ao longo com 1,2 milhões de células irradiadas 3T3 num volume total de 15 mL. Adicionar inibidor ROCHA fresco a 10 uM e adicionar a suspensão de células para uma placa revestida de gelatina de 150 mM.

9. As células congelar e armazenar Humano esofágico epiteliais

1. Para tornar meio de congelamento, adicionar 10%DMSO a médio reprogramação condicional. Após trypsinizing e contagem, as células alíquota para congelar para um novo tubo de 50 mL cónico e girar a 300 xg durante 5 min.
2. Aspirar o meio e adicionar meio de congelação a um volume de 2 ml por frasco de congelação. Uma vez que a suspensão de células é homogéneo, uma alíquota de 10 ⁶ células em cyrovials pré-rotulados. Introduzem-se num recipiente de congelação a -80 ° C durante pelo menos 24 h antes de se mudar os frascos para armazenamento em azoto líquido a longo prazo.

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Resultados

Um resumo das principais etapas isolar células epiteliais do esôfago de biópsias de pacientes estão resumidos na Figura 1. As colónias de células epiteliais vai formar em cerca de 4-5 dias e vai ser rodeado por células de alimentação de fibroblastos (Figura 2A). À medida que essas colônias expandir eles vão fundir-se com outras colónias para formar grandes colônias (Figura 2B). Uma vez que as culturas se tornaram 70% conflu...

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Discussão

Os passos mais importantes, a fim de isolar e expandir células epiteliais esofágicas a partir de biópsias de pacientes são: 1) dissociação adequadamente tecido de biopsia com a morte celular mínima; 2) assegurar ROCHA inibidor é adicionado ao meio de cultura de células em cada mudança de meio; 3) Não use mais células alimentadoras do que o recomendado; 4) manter uma cultura asséptica limpo; e 5) células de passagem apenas antes de atingir a confluência.

Devido às diferenças ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150 mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50 mL Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658