La riprogrammazione di cellule condizionale Pediatric umana esofageo epiteliali per l'uso in ingegneria dei tessuti e la malattia Investigation

Riepilogo

L'espansione del pediatrici cellule epiteliali umane esofagee che utilizzano riprogrammazione condizionale fornisce gli investigatori con una popolazione paziente-specifici di cellule che possono essere utilizzati per l'ingegneria costrutti esofagei per l'impianto autologo per il trattamento di difetti o lesioni e di fungere da serbatoio per test di screening terapeutici.

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduzione

ingegneria dei tessuti dell'esofago e esofagite eosinofila (EoE) sono stati al centro della ricerca in molti laboratori nel corso dell'ultimo decennio. Difetti congeniti, come atresia esofagea, si osservano in circa 1 su 4000 nati vivi, che si traduce nello sviluppo incompleto dell'esofago porta alla incapacità di mangiare ^1. L'incidenza e la prevalenza di EoE sono in aumento da quando l'identificazione del soggetto malattia nel 1993. L'incidenza di EoE varia 0,7-10 / 100.000 a persona-anno e la prevalenza variava 0,2-43 / 100.000 ^2. Un nuovo approccio chirurgico interessante per il trattamento a lungo divario atresia esofagea consiste nel generare costrutti di tessuto per l'impianto che utilizza le cellule del paziente. Queste cellule in combinazione con impalcature sintetica genera un costrutto autologo che non richiede immunosoppressione. Alcuni gruppi hanno già iniziato ad indagare negli Stati Unitie di cellule staminali-simili per l'ingegneria tissutale esofageo ³ nonché l'uso di cellule epiteliali dell'esofago nativi per ripopolare mucosa ^{4 - 7.} Malattie che sono presenti in esofago di pazienti pediatrici sono spesso difficili da diagnosticare o studiare senza intervento. Inoltre, utilizzando modelli animali o in vitro immortalati modelli di linee cellulari per le malattie pediatriche come EoE non comprendere l'esatta patogenesi della malattia o differenze specifiche del paziente ^8. Pertanto, la capacità di studiare processo patologico di un paziente in vitro per identificare specifici innescare malattie antigeni, valutare meccanismi sottostanti e indagare trattamenti farmacologici sarebbe romanzo e fornire ai medici informazioni che possono aiutare nel trattamento del paziente.

Ci sono stati molti tipi di cellule autologhe o paziente-specifici che sono stati proposti per l'uso in tissue di ingegneria e studiare la patogenesi delle malattie umane. Tuttavia, alcuni di questi tipi cellulari sono limitati nella loro capacità di generare abbastanza cellule di un fenotipo specifico per inizializzare una grande impalcatura o eseguire high throughput studi in vitro. L'utilizzo di cellule staminali pluripotenti o multipotenti è stato l'argomento di discussione di ricerca molto, tuttavia, i limiti e le lacune per l'utilizzo di queste cellule sono stati ben descritti ^9. L'uso di cellule staminali embrionali umane è molto dibattuto e presenta molti problemi etici. Soprattutto, queste cellule formano teratomi, che sono simili a un tumore, se non sono differenziati dal loro stato pluripotente prima trasporto loro in un ospite vivente ^10. Inoltre, l'uso di cellule staminali embrionali non sarebbe paziente-specifico e potrebbe provocare una risposta allogenico e la necessità di soppressione immunitaria ^10. Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) sono cellule pluripotenti che possonoessere derivato dalle cellule di un paziente. cellule somatiche, come le cellule della pelle, possono essere indotte a uno stato pluripotente utilizzando una varietà di tecniche integrative e non integrative. Queste cellule poi servire come un paziente-specifici fonti di cellule per l'ingegneria tissutale o indagine malattia. L'integrazione di materiale genetico indesiderato in queste cellule è una preoccupazione molti hanno descritto ed anche se le sequenze sono completamente rimossi iPSCs apparire per preservare una "memoria" epigenetica verso il tipo di cellula da cui sono stati ricavati ^11. Queste cellule anche formeranno teratomi in vivo se non differenziati prima del trapianto ^11. Molti protocolli di differenziazione sono stati indagati concentrandosi su linee dell'epitelio ^{12, 13, 14,} tuttavia, è molto importante notare che i tipi cellulari risultanti alla fine di differenziazione non sono omogenei e oolo possiede una frazione del tipo cellulare di interesse. Questo si traduce in bassa resa e la necessità di purificare il tipo cellulare desiderato. Anche se iPSCs sono una potenziale fonte di cellule specifiche del paziente, il processo per ottenere un tipo di cellula di interesse sia per l'ingegneria dei tessuti o indagine malattia è molto inefficiente.

Cellule epiteliali umane sono state isolate con successo da una varietà sia di tessuti malati e non malati nel corpo umano, inclusi: polmone ^15, seno ^16, intestino tenue ^17, colon ^18, vescica ¹⁹ e dell'esofago ^20. È importante notare che le cellule primarie umane hanno un numero finito di passi in cui il fenotipo viene mantenuta ^{21, 22.} Sfortunatamente, questo significa che il numero di cellule necessarie per indagini di malattia o per la semina un'impalcatura ingegnerizzatoper l'impianto non può essere raggiunto. Pertanto, sono necessarie nuove tecniche per espandere le cellule dei pazienti, pur mantenendo un fenotipo epiteliale. Riprogrammazione condizionale di normali e tumorali cellule epiteliali che utilizzano cellule di alimentazione e inibitore ROCK è stato descritto nel 2012 da Liu et al. ^{2 3.} Questa tecnica è stata utilizzata per espandere le cellule epiteliali cancerose ottenuti da biopsie di cancro alla prostata e al seno utilizzando cellule di alimentazione irradiati, inibitore ROCK e medie riprogrammazione condizionale. L'obiettivo era di generare abbastanza cellule per test in vitro, come lo screening di stupefacenti. Questa tecnica è in grado di espandere cellule epiteliali indefinitamente "riprogrammazione" queste cellule a uno stelo o stato progenitore simile, che è altamente proliferativo. È stato dimostrato che queste cellule sono non tumorigeniche e non possiedono la capacità di formare teratomi ^{23, 24.} Inoltre, nessunanomalie cromosomiche o manipolazioni genetiche erano presenti dopo passaging queste cellule in coltura con questa tecnica ^{23, 24.} Ancora più importante, queste cellule sono in grado di differenziarsi in cellule del tipo nativo di interesse. Pertanto, questa tecnica offre un grande serbatoio di cellule epiteliali paziente-specifiche per le indagini malattie o ingegneria dei tessuti senza necessità di immortalizzazione.

Ottenere tessuto epiteliale da un organo specifico, al fine di studiare i processi di malattia è spesso limitata e non sempre è possibile a causa del rischio del paziente. Per quei pazienti affetti da malattia esofagea o difetti, endoscopica recupero biopsia è un approccio minimamente invasivo per ottenere il tessuto epiteliale che può essere dissociato e condizionatamente riprogrammato per fornire una fonte di cellule indefinita che è specifico per la mucosa dell'esofago che del paziente. Questo permette quindi per gli studi in vitrodelle cellule epiteliali per valutare processi di malattia e lo schermo per potenziali terapie. Un processo di malattia che potrebbero notevolmente beneficiare di questo approccio è esofagite eosinofila, che è stato descritto come malattia allergica dell'esofago ^8. Prove allergiche e approcci terapeutici potrebbero essere valutati in vitro utilizzando cellule epiteliali del paziente e questi dati possono poi essere trasmessi al medico curante di sviluppare piani di trattamento individualizzato. La tecnica di riprogrammazione condizionale unitamente ottenere biopsie endoscopiche da pazienti pediatrici offre la possibilità di espandere normali cellule epiteliali dell'esofago indefinitamente da qualsiasi paziente. Questa fonte di cellule potrebbe quindi essere abbinato insieme con l'armatura naturale o sintetica per fornire un paziente-specifica opzione chirurgica dei difetti, malattie o traumi. Avere un numero di cellulare indefinito aiuterebbe ingegnere costrutti esofagee che possiedono una struttura completamente reseededlumen con le cellule epiteliali dell'esofago al fine di contribuire a facilitare la rigenerazione dei tipi di cellule rimanenti.

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Protocollo

biopsie esofagee sono stati ottenuti dopo il consenso informato è stato ottenuto dai genitori / tutori dei pazienti pediatrici e in conformità con la scheda di revisione istituzionale (IRB # 13-094).

1. sterilizzazione di strumenti e la gelatina Soluzione

1. forcipe autoclave, lame di rasoio e forbici prima di maneggiare il tessuto per evitare la contaminazione.
2. Per 200 ml di soluzione di gelatina 0,1%, unire 200 mL di acqua distillata con 0,2 g di gelatina. Autoclavare e fresco prima dell'uso.

2. Rivestimento Piastre Tissue Culture

1. Circa 2 h prima di isolare cellule, aggiungere abbastanza 0,1% di gelatina per coprire un piatto di coltura di tessuti (100 mm) e incubare a 37 ° C in un incubatore di coltura cellulare.
   NOTA: Queste piastre possono anche essere effettuate in anticipo e tenute in incubatrice prima dell'uso.

3. Fare Soluzione Enzimatica per la dissociazione

1. Circa 30 minuti prima di isolare cellule, pesare10 unità di dispasi su un bilancio basato sulle unità per milligrammo concentrazione dei flaconi. Posizionare la polvere in un tubo da 15 ml con 10 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) e posto in un bagno d'acqua a 37 ° C.

4. cellulare fare cultura medio

1. Per fare 50 ml di mezzo riprogrammazione condizionale, mescolare i seguenti ingredienti in una provetta sterile conica: 35 ml di F12 (Ham media), 11,5 ml di DMEM, 0,5 ml di L-glutammina, 0,5 ml di 100x di penicillina / streptomicina, 2,5 ml di siero fetale bovino (FBS), 250 mg di insulina umana, 500 ng del fattore di crescita epidermico umano (EGF).
2. Per fare 500 ml di 3T3 media, mescolare 50 ml di FBS, 5 ml di 100x penicillina / streptomicina e 5 ml di L-glutammina con 500 ml di DMEM.
3. Per fare 500 ml di cheratinociti mezzo privo di siero, scongelare integratori estratto pituitario bovina (BPE) (forniti con i media) EGF e. Aggiungere i supplementi per la bottiglia di terreno di base da 500 ml e aggiungere 5 ml di 100x penicillina / streptomicina

5. Le cellule la coltura e irradiante 3T3 come fonte alimentatore

1. Preparare medio 3T3, comprendente DMEM, 10% FBS, 1x penicillina / streptomicina e 2 mM L-glutammina.
2. Cultura 3T3 nel tessuto trattato con T-75 fiaschi almeno 3 giorni prima dell'arrivo dei campioni dei pazienti.
   1. Poco prima dell'arrivo dei campioni dei pazienti, trypsinize 3T3 con 5 ml di 0,25% tripsina-EDTA per bombola e incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando la maggior parte delle cellule sono galleggianti
3. Aggiungere 5 ml di 3T3 mezzo per fermare la reazione. Aspirare la sospensione cellulare e trasferire ad un tubo da 15 ml. Spin per 5 min a 300 x g.
4. Aspirare il medio e risospendere le cellule in un determinato volume di Trypan blu per il conteggio delle cellule. Unire 10 ml di cellule con 10 ml di Trypan blu di escludere le cellule morte. Carico 10 ml di questa soluzione in un emocitometro per il conteggio delle cellule.
   NOTA: Per questo protocol, densità di semina per irradiati 3T3 è 10.900 cellule per cm ^2, che è pari a 600.000 cellule per piastra a 100 mm.
5. Aliquota del numero di cellule necessarie al piatto un piatto 100 millimetri per campione del paziente e risospendere in 25 ml di 3T3 media in una provetta da 50 ml e irradiare con 3000 rad.
6. A seguito di irraggiamento, le cellule spin down per 5 min a 300 xg e risospendere in media riprogrammazione condizionale a 5 ml per piastra a 100 mm.
7. Impostare il tubo da parte fino al rivestimento delle cellule del paziente avviene successivamente nel protocollo (vedi punto 7.6).

6. Ottenere, conservare e trasportare pediatrici esofagee biopsie

1. Aggiungere 5 ml di completo mezzo privo di siero dei cheratinociti con 100 mg / ml primocin a 15 ml provette coniche e portarlo al centro medico sul ghiaccio.
   NOTA: Questi tubi di media possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 2 mesi.
2. Ottenere circa 8 biopsie esofagee in TIme di endoscopia e separato come segue:
   1. Mettere sei biopsie nel conica da 15 ml contenente completa di siero cheratinociti medie libero con 100 mg / ml primocin e posto sul ghiaccio bagnato.
   2. Mettere una biopsia in 5 ml di formalina tamponata e posto sul ghiaccio bagnato.
   3. Mettere una biopsia in una piccola biopsia cryomold con mescola ottimale temperatura di taglio.
      1. goccia Immediatamente questo stampo in un becher di isopentano collocato in azoto liquido. Una volta congelato, collocare il cryomold in un sacchetto campione e memorizzare sul ghiaccio secco in un contenitore di polistirolo espanso.
3. Mettere le provette contenenti biopsie a medio o formalina all'interno di un sacchetto sigillato e poi in una scatola di spedizione contiene ghiaccio umido. Sigillare ed etichettare la scatola con un'etichetta di rischio biologico e trasportarla al laboratorio.
   NOTA: Il contenitore che contiene il ghiaccio secco e la biopsia congelata è anche sigillato ed etichettato con un'etichetta rischio biologico.

7. ProcessingTessuto del paziente per la Cultura a valle e analisi

1. All'arrivo presso il laboratorio, trasferire la biopsia congelato in ghiaccio secco a -80 ° C freezer per il sezionamento a valle o estrazione di RNA. Mettere il campione in formalina. Conservare in frigorifero C 4 ° e permettono di risolvere durante la notte.
2. Spin i restanti biopsie giù a 300 xg, e aspirare il terreno. Aggiungere 10 ml di dispasi soluzione al tubo conico, guarnizione e lasciarla incubare a 37 ° C a bagnomaria per 15 minuti.
3. Dopo l'incubazione, girare le biopsie giù a 300 x g. Aspirare biopsie medio e risospendere in 5 ml di 0,05% tripsina-EDTA.
4. Trasferire il 5 ml di tripsina-EDTA contenente le biopsie ad una piastra sterile 100 mm e sminuzzare biopsie con 2 lamette sterilizzati più sottile possibile.
5. Trasferire il 5 ml di tripsina-EDTA contenente biopsie macinate in un 15 mL conica. Sciacquare la piastra due volte con un ulteriore 5 ml di 0,05% tripsina-EDTA e aggiungere alla conicatubo. Incubare la provetta per 10 minuti in un bagno d'acqua 37 ° C.
6. Dopo l'incubazione, girare le biopsie giù a 300 xg (1,4 rpm) per 5 min e aspirare il terreno. Aggiungere 5 ml di terreno riprogrammazione condizionale per il tubo conico, nonché il 5 ml di terreno di riprogrammazione condizionale che contiene le cellule di alimentazione irradiate (vedi punto 5.7).
7. Aggiungere inibitore ROCK (1 ml / mL) al 10 ml di sospensione cellulare e piatto dopo aspirando la gelatina dal piatto di coltura tissutale. Incubare a 37 ° C.

8. Coltura e cellule espansione

1. Dopo circa 5 giorni di coltura, aspirare il terreno iniziale contenente i pezzi tritato-biopsia e sciacquare il piatto 2-3 volte con 5 ml di PBS sterile. Aggiungere nuovo mezzo alla piastra compreso inibitore ROCK a 10 micron.
2. Giunti 70% di confluenza, espandere le cellule. Aggiungere 5 ml di 0,05% tripsina-EDTA alla piastra e incubare in un incubatore a 37 ° non più di 2,5 minuti per rimuovere °cellule di alimentazione e. Dopo che l'incubazione, aspirare il tripsina-EDTA e sciacquare la piastra con 5 ml di PBS.
3. Aspirare il PBS e aggiungere 5 ml di 0,25% tripsina-EDTA alla piastra e incubare per 5-10 minuti o fino a quando le cellule sono sciolti dalla piastra. Aggiungere quantità uguali di mezzo alla piastra per bloccare la reazione e trasferire tutto il fluido in un tubo da 50 ml conica e centrifugare a 300 xg per 5 min.
4. Risospendere le cellule in un volume definito di media riprogrammazione condizionale e mescolare 10 ml di sospensione con 10 ml di trypan blu. Contare su un emocitometro per determinare il numero totale delle cellule.
5. Per espandere cellule, aggiungere 1 milione di cellule umane esofagee ad una piastra 150 millimetri insieme con 1,2 milioni irradiato 3T3 in un volume totale di 15 ml. Aggiungere inibitore ROCK fresco a 10 micron e aggiungere la sospensione cellulare in un piatto di gelatina rivestita 150 mm.

9. Le cellule congelare e conservare umano esofageo epiteliali

1. Per rendere media di congelamento, aggiungere il 10%DMSO medio riprogrammazione condizionale. Dopo trypsinizing e conteggio, un'aliquota le cellule di congelare in un nuovo tubo 50 ml conica e centrifugare a 300 xg per 5 min.
2. Aspirare il medio e aggiungete il congelamento di media ad un volume di 2 ml per esageratamente. Una volta che la sospensione cellulare è omogenea, un'aliquota da 10 ⁶ cellule in cyrovials pre-etichettato. Mettere in un contenitore di congelamento a -80 ° C per almeno 24 h prima di spostare le fiale di conservazione in azoto liquido a lungo termine.

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Risultati

Una sintesi dei passaggi chiave nel isolare cellule epiteliali esofagee da biopsie di pazienti è riassunto nella figura 1. Le colonie di cellule epiteliali formeranno in circa 4-5 giorni e sarà circondato da cellule di alimentazione dei fibroblasti (Figura 2A). Poiché queste colonie si espandono che si fonderanno con altre colonie di formare colonie più grandi (Figura 2b). Una volta che le culture sono diventate confluenti 70%, devon...

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Discussione

I passi più importanti al fine di isolare ed espandere cellule epiteliali dell'esofago da biopsie di pazienti sono: 1) adeguatamente dissociare biopsia del tessuto con la morte delle cellule minimo; 2) garantire inibitore ROCK viene aggiunto al mezzo di coltura cellulare ad ogni cambio medio; 3) Non utilizzare più cellule di alimentazione di quanto raccomandato; 4) mantenere una cultura asettica pulito; e 5) le cellule di passaggio appena prima di raggiungere confluenza.

A causa delle ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150 mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50 mL Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658