Doku Mühendisliği ve Hastalık Soruşturma Kullanılmak Üzere Pediatrik İnsan Özofagus Epitel Hücreleri koşullu yeniden programlanması

Özet

koşullu yeniden programlamayı kullanarak insan pediatrik özofagus epitel hücrelerinin genişlemesi kusurları veya yaralanma tedavi ve tedavi amaçlı testler için bir rezervuar olarak hizmet otolog implantasyon için özofagus yapıları mühendislik için kullanılabilir hücrelerin hastaya özgü nüfusa sahip araştırmacılar sağlar.

Özet

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Giriş

Özofagus doku mühendisliği ve eozinofilik özofajit (EÖ) son on yılda pek çok laboratuvarda araştırma odağı olmuştur. Böyle özofagus atrezisi gibi konjenital defektler, ¹ yemek yetersizlik önde gelen yemek borusu eksik gelişmesi ile sonuçlanır yaklaşık 1 4,000 canlı doğumda, görülür. EÖ insidans ve prevalansının 1993 yılında hastalık varlığın kimlik EÖ insidansı 10 kişi-yıl başına / 100,000 0.7 arasında değiştiği ve yaygınlık 43 / 100,000 ² 0.2 arasında değişmektedir beri artış olmuştur. çok uzun aralıklı özefagus atrezisi tedavisi için yeni bir çekici cerrahi yaklaşım hastanın kendi hücrelerini kullanarak implantasyon için doku yapıları üreten oluşur. Sentetik iskele ile bağlantılı olarak bu hücreler bağışıklık bastırma gerektirmeyen bir otolog yapı oluşturur. Bazı gruplar zaten bizi araştırmaya başlamışlardır^{7 -} özofagus doku mühendisliği ³ yanı sıra yerli özofagus epitel hücrelerinin kullanımı için kök benzeri hücreler e mukozasında ⁴ yeniden doldurmak için. pediatrik hastaların yemek borusunda mevcut hastalıklar sıklıkla teşhis ya da müdahale olmadan çalışmaya zordur. Ayrıca, kullanan hayvan modelleri ya da in vitro tam hastalık patogenezi veya hasta belirli farklılıklar ⁸ kapsayacak yok EÖ gibi pediatrik hastalıklar için hücre hattı modelleri ölümsüzleştirdi. Bu nedenle, sırayla in vitro bir hastanın hastalık sürecini incelemek için yetenek, spesifik hastalık tetikleme antijenleri tespit yatan mekanizmaları değerlendirmek ve roman ve hasta tedavisinde yardımcı olabilecek bilgiler klinisyenlere sağlayacak ilaç tedavileri araştırmak için.

Tissu'nun kullanılmak için önerilmiştir, birçok otolog veya hasta açısından spesifik hücre tipleri olmuşture mühendisliği ve insan hastalık patogenezini okuyan. Bununla birlikte, bu hücre tiplerinin, bazı büyük iskele tohum ya da in vitro çalışmalarda yüksek verim gerçekleştirmek için belirli bir fenotip yeterli hücre oluşturmak için kendi yeteneği sınırlıdır. Pluripotent veya multipotent kök hücrelerin kullanımı çok araştırma tartışma konusu olmuştur, ancak bu hücrelerin kullanımı için sınırlamalar ve eksiklikleri de ⁹ tarif edilmiştir. İnsan embriyonik kök hücrelerin kullanımı çok tartışılan ve birçok etik sorunlar karşımıza çıkar. En önemlisi, bu hücrelerin kendi pluripotent devletten önce yaşayan bir ev sahibi ¹⁰ içine sunmaya ayırt değilse, bir tümöre benzer teratom oluştururlar. Ayrıca, embriyonik kök hücrelerin kullanımı hastaya özgü olmaz ve bir allojenik tepki ve bağışıklık baskılanması ¹⁰ ihtiyacını ortaya olabilir. Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) o can pluripotent hücrelerdirhastanın kendi hücreleri elde edilebilir. örneğin deri hücreleri gibi somatik hücreler, birleştirici ve bütünleştirici olmayan çeşitli teknikler kullanılarak pluripotent duruma indüklenebilir. Bu hücreler daha sonra, doku mühendisliği ya da hastalık inceleme için hastaya özel hücre kaynakları olarak görev yapar. Bu hücrelerin içine istenmeyen genetik materyalin entegrasyonu birçok tarif var ve diziler bile tamamen kaldırıldı iPSCs onlar ¹¹ türetildikleri hücre tipine karşı bir epigenetik "hafıza" korumak için görünen bir husustur. Transplantasyon ¹¹ öncesinde farklılaşmış takdirde Bu hücreler, aynı zamanda in vivo olarak teratomlar oluşturacaktır. Bir çok farklılaşma protokolleri ancak, farklılaşma sonunda elde edilen hücre tipi homojen ve O değildir dikkat etmek önemlidir, epitel ^{soy, 12, 13, 14} odaklanan incelenmiştirnly ilgi hücre tipinin bir bölümünü sahiptirler. Bu düşük verim ve istenen hücre türü arındırmak için ihtiyacı ile sonuçlanır. iPSCs potansiyel hastaya özgü hücre kaynağı olsa da, proses doku mühendisliği veya hastalık araştırma biri için ilgi konusu bir hücre tipi çok yetersiz elde edildi.

Akciğer ^15, meme ^16, ince ^{bağırsak, 17} kolon ^18, mesane ¹⁹ ve yemek borusu ^20: insan epitelyum hücrelerinin başarılı dahil olmak üzere insan vücudunda hastalıklı olmayan hastalıklı doku hem de çeşitli izole edilmiştir. İnsan birincil hücreler fenotipik ^{21, 22} muhafaza edildiği geçitlerin sonlu sayıda olduğunu not etmek önemlidir. Ne yazık ki, bu demektir ki bir hastalık inceleme ya da bir mühendislik iskele tohumlama için gereken hücre sayısıimplantasyon için elde edilemez. Bu nedenle, yeni teknikler de epitel fenotipi muhafaza ederken, hastanın hücreleri genişletmek için ihtiyaç vardır. Besleyici hücreler ve kaya inhibitörü yararlanarak normal ve kanserli epitel hücrelerinin koşullu yeniden programlama Liu ve arkadaşları tarafından, 2012 de tarif edilmiştir. ^{2 3.} Bu teknik, ışınlanmış besleyici hücreler, ROCK önleyicisi ve koşullu yeniden programlama ortamı kullanılarak prostat ve meme kanseri biyopsilerinden elde edilen kanser epitelyal hücreleri genişletmek için kullanılmıştır. Hedefi, ilaç taraması gibi, in vitro tahliller için yeterli hücre elde etmek olmuştur. Bu teknik, yüksek proliferatif bir kök veya projenitör gibi devlet için "yeniden programlama", bu hücreler tarafından süresiz epitel hücreleri kadar esneme kabiliyetine sahiptir. Hücreler olmayan tümörijenik ve teratom ^{23, 24} oluşturmak için yeteneğine sahip olmadıklarını ortaya konmuştur. Bundan başka, herhangi birkromozomal anomali veya genetik manipülasyonlar bu tekniği ^{23, 24} kullanılarak kültürde bu hücrelerin Pasajlanması sonra hazır bulundu. En önemlisi, bu hücreler sadece ilgi yerli hücre tipine içine ayırt edebiliyoruz. Bu nedenle, bu teknik ölümsüzleşme gerek kalmadan hastalığı soruşturma ve doku mühendisliği için hastaya özgü epitel hücrelerinin büyük bir hazne bulunmaktadır.

hastalık süreçlerini araştırmak için özel bir organdan epitel dokusu elde nedeniyle hasta riskten kaynaklanabilecek olası genellikle sınırlı değil her zaman. özofagus hastalığı veya kusurları muzdarip hastalar için, endoskopik biyopsi alma ayrışmış ve şartlı o hastanın yemek borusu mukozasında özgü belirsiz bir hücre kaynağı sağlamak için yeniden olabilir epitel doku elde etmek için minimal invaziv bir yaklaşımdır. Bu, daha sonra, in vitro çalışmalar için izin verirepitel hücrelerinin potansiyel tedavi için hastalık süreçlerini ve ekrana değerlendirmek. Büyük ölçüde bu yaklaşımdan fayda olabilir Bir hastalık süreci yemek borusu ⁸ alerjik hastalık olarak tarif edilmiştir Eozinofilik Özofajit vardır. Alerji testleri yanı sıra tedavi yaklaşımları hastanın kendi epitel hücreleri kullanılarak in vitro değerlendirilebilir ve bu veriler daha sonra bireyselleştirilmiş tedavi planı geliştirmek için tedavi eden hekimin üzerine geçirilebilir. pediatrik hastalarda gelen endoskopik biyopsilerin ile birlikte koşullu yeniden programlama tekniği herhangi hastadan süresiz normal yemek borusu epitel hücreleri genişletmek için yeteneği sunar. Bu hücre kaynağı, bu nedenle kusur, hastalık ya da travma nedeniyle bir hastaya özgü cerrahi seçenek sunmakta doğal veya sentetik iskele ile birlikte takım olabilir. belirsiz hücre sayısına sahip olan tamamen reseeded sahip özofagus yapıları mühendisi yardımcı olacaksırayla özofagus epitel hücreleri ile lümen kalan hücre tipleri yenilenmesini kolaylaştırmak için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

bilgilendirilmiş onam pediatrik hastaların anne / veliler ve kurumsal inceleme kurulu (KİK # 13-094) ile uygun olarak elde edildikten sonra Özofagus biyopsiler alındı.

1. Sterilizasyon Cihazları ve Jelatin Çözümü

1. Otoklav forseps, tıraş bıçakları ve kirlenmeyi önlemek için doku taşıma öncesinde makas.
2. % 0.1 jelatin çözeltisi, 200 ml yapmak için, jelatin, 0.2 g damıtılmış su, 200 mL birleştirir. Otoklav ve serin, kullanımdan önce.

2. Kaplama doku kültürü plakaları

1. önce hücre izolasyonu yaklaşık 2 saat, bir doku kültürü çanağı (100 mm) kapak ve bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de inkübe kadar% 0.1 jelatin ekleyin.
   NOT: Bu plakalar aynı zamanda önceden yapılmıştır ve kullanım öncesi inkübatör tutulabilir.

3. Ayrışma Enzim Çözüm yapma

1. Yaklaşık hücre izolasyonu öncesinde 30 dakika dışarı tartmakşişesindeki miligram konsantrasyonu başına birimlere dayalı bir denge üzerine dispase 10 birim. 37 ° C su banyosu içinde, 10 ml Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) ve yer ile 15 ml konik bir tüp içinde bir toz yerleştirin.

4. yapma Hücre Kültürü Orta

1. F12, 35 mL (Ham orta), DMEM 11.5 mL, L-glutamin, 0.5 mi, 100x penisilin / streptomisin, 0.5 mL, 2.5 mL: steril bir konik tüp içine, aşağıdaki terkip maddelerini karıştırın, koşullu yeniden programlama ortamı 50 ml yapmak için fetal sığır serumu (FBS), insan insülin, 250 ug, insan epidermal büyüme faktörü (EGF), 500 ng.
2. 3T3 ortamı 500 mL olmak FBS, 50 mL, 100 x penisilin / streptomisin ile 5 mL DMEM 500 mL L-glutamin, 5 ml karıştırın.
3. keratinosit serumsuz ortamda 500 ml yapmak için, EGF ve (ortam ile sağlanır), sığır hipofiz özütü (BPB) takviyesi eritin. taban ortamının 500 ml şişeye takviyeleri ekleyin ve 10 5 mL0 x penisilin / streptomisin

bir besleme kaynağı 5. Kültüre ve ışınlanması 3T3 hücreleri,

1. DMEM,% 10 FBS, 1 x penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin ihtiva eden 3T3 orta hazırlayın.
2. Kültür, en az 3 gün hasta numunelerinin gelmesinden önce doku tedavi, T-75 şişelerinde 3T3 hücreleri.
   1. 5 mL'lik bir şişeye% 0.25 tripsin-EDTA kullanılarak 3T3 hücreleri, 5 dakika boyunca ya da pek çok hücre kadar 37 ° C'de inkübe hasta numunelerinin varış trypsinize hemen önce yüzer
3. Reaksiyonu durdurmak için 3T3 ortamın 5 mL ekleyin. hücre süspansiyonu aspire ve 15 ml konik tüp transfer. 300 x g, 5 dakika boyunca spin.
4. orta aspire ve hücre sayımı için tripan mavisi belirli bir hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri. ölü hücreleri hariç Tripan mavi 10 uL hücrelerin 10 uL birleştirin. hücre sayımı için bir hemasitometre Bu çözümün yük 10 mcL.
   NOT: Bu proto içincol, ışınlanmış 3T3 hücreleri için ekim yoğunluğu 100 mm plaka başına 600.000 hücrelere eşit ^cm2 başına 10.900 hücredir.
5. 50 ml konik bir tüp içinde 3T3 ortamı 25 mL hasta numunesi ve tekrar süspansiyon başına 100 mm plaka plaka 3000 rad ile ışına maruz bırakmak için gerekli olan hücre sayısını kısım.
6. Aşağıdaki ışınlama, aşağı 100 mm plaka başına 5 ml koşullu yeniden programlama ortamında 5 300 xg'de dk ve tekrar süspansiyon spin hücreleri.
7. Hasta hücrelerin kaplama protokolünde sonra gerçekleşir kadar borunun yanına (adım 7.6 bakınız).

6. Pediatrik Özofagus Biyopsisi korunması ve taşınması, alınması

1. 15 ml konik tüpe 100 ug / mL primocin tam keratinosit serumsuz ortamın 5 ml ilave edilir ve buz üzerinde tıbbi tesise getirin.
   Not: ortamın Bu tüpler kadar 2 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
2. Ti yaklaşık 8 özofagus biyopsi eldeBana şöyle endoskopi ve ayrı:
   1. ıslak buz üzerinde 100 mg / ml primocin ve yeri ile komple keratinosit serum serbest orta içeren 15 ml konik altı biyopsi yerleştirin.
   2. ıslak buz üzerinde tamponlu formalin ve yer 5 mL biyopsi yerleştirin.
   3. uygun kesme ısısı bileşiği ile cryomold küçük biyopsisinde biyopsi yerleştirin.
      1. Hemen sıvı azot içinde yerleştirilmiş izopentan, bir cam kaba bu kalıba bırakın. Bir kez donmuş, bir numune torbasına cryomold koyun ve bir polistren köpük kap içinde kuru buz üzerinde saklayın.
3. Bir yapışmalı torba içinde ve daha sonra ıslak buz içeren bir kargo kutusu içine orta veya formalin biyopsiye içeren tüpler yerleştirin. Mühür ve biyolojik tehlikeli etiketi kutuyu etiket ve laboratuvara taşıyın.
   NOT: kuru buz içeren konteyner ve dondurulmuş biyopsi de mühürlü ve biyolojik tehlikeli etiketi ile işaretlenmiştir.

7. İşlemeMansap Kültür ve Analiz Hasta Doku

1. Laboratuvarda varışta, aşağı kesit veya RNA ekstraksiyonu için ° C derin dondurucuda -80 kuru buz üzerinde donmuş biyopsi aktarın. formalin örnek yerleştirin. 4 ° C buzdolabında saklayın ve bir gecede düzeltmek için izin verir.
2. 300 xg'de kalan biyopsi aşağı Spin ve orta aspire. konik tüp, contaya dispaz çözeltisi 10 ml ilave edilir ve 15 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C'de inkübe edin.
3. inkübasyonu takiben, 300 x g biyopsi aşağı doğru döndürün. % 0.05 tripsin-EDTA, 5 mL, orta ve tekrar süspansiyon biyopsi aspire.
4. 100 mm steril plakaya biyopsileri içeren tripsin-EDTA 5 ml aktarın ve 2 sterilize Jilet mümkün olduğunca ince kullanarak biyopsi kıyma.
5. yeni bir 15 ml konik kıyılmış biyopsi içeren tripsin-EDTA 5 ml aktarın. % 0.05 tripsin-EDTA ilave bir 5 mL 'si ile iki kez plaka yıkayın ve konik ekletüp. 37 ° C su banyosu içinde 10 dakika için tüp inkübe edin.
6. inkübasyonu takiben, 5 dakika boyunca 300 xg (1.4 RPM) de biyopsi aşağı spin ve orta aspire. konik tüp gibi ışınlanmış besleyici hücreleri ihtiva eden şartlı yeniden programlama ortamı 5 mL koşullu yeniden programlama ortamı 5 mL (adım 5.7).
7. doku kültürü çanağı jelatinin aspire sonra hücre süspansiyonu ve plakanın 10 mL ROCK inhibitörü (1 ul / ml) eklenir. 37 ° C'de inkübe edin.

8. Kültüre ve Yaygınlaştırılması Hücreler

1. kültür yaklaşık 5 gün sonra, kıyılmış biyopsi parçaları içeren ilk orta aspire ve 5 ml steril PBS ile çanak 2-3 kez yıkayın. 10 uM'de ROCK inhibitörü içeren plakaya yeni orta ekleyin.
2. % 70 confluency ulaştıktan sonra, hücre genişletin. levhaya% 0.05 tripsin-EDTA, 5 ml ilave edin ve 37 ° C inkübatör th çıkarmak için en fazla 2.5 dakika kuluçkalayıne besleme hücreleri. Bu inkübasyonun ardından, tripsin-EDTA aspirat ve 5 ml PBS ile plaka yıkayın.
3. PBS aspire ve plaka% 0.25 tripsin-EDTA 5 ml ilave edilir ve 5-10 dakika için ya da hücrelerin plakasından gevşeyene kadar inkübe edilir. Reaksiyonu durdurmak ve 50 ml konik tüp sıvı nakledebilir ve 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürülür ve plakaya ortamın eşit miktarda ekleyin.
4. Koşullu yeniden programlama ortamı belirli bir hacimde yeniden süspanse hücreleri ve tripan mavisi 10 uL süspansiyonu 10 uL karıştırın. toplam hücre sayısını belirlemek için bir hemasitometre güvenin.
5. Hücreleri genişletme 1.200.000, 15 mL bir toplam hacimde 3T3 hücreleri, ışınlanmış ile 150 mm plaka 1.000.000, insan yemek borusu hücreleri ekleyin. 10 um taze ROCK inhibitörü ekleyin ve bir jelatin kaplı 150 mm çanak hücre süspansiyonu ekleyin.

9. Freeze ve Mağaza İnsan Özofagus Hücrelerine

1. orta dondurma yapmak için,% 10 ilaveKoşullu yeniden programlama ortamı DMSO. tripsinize ve sayma sonra, yeni bir 50 ml konik tüp içine dondurmak ve 5 dakika boyunca 300 xg'de aşağı spin hücreleri bölmeyin.
2. orta aspire ve cryovial başına 2 mL'lik bir hacimde orta dondurma ekleyin. Hücre süspansiyonu, homojen olduğunda, önceden etiketlenmiş cyrovials 10 ⁶ hücre kısım. Uzun süreli sıvı azot depolama şişeleri hareket önce en az 24 saat boyunca -80 ° C'de bir dondurucu bir kap içine koyun.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Hasta biyopsilerinden özofagus epitel hücreleri izole kilit adımların bir özeti Şekil 1'de özetlenmiştir. Epitel hücrelerinin kolonileri yaklaşık 4-5 gün içinde oluşturacak ve fibroblast besleyici hücreler (Şekil 2A) çevrili olacak. Bu koloniler genişletmek olarak daha büyük koloniler (Şekil 2B) oluşturmak için diğer koloniler ile birleştirilecek. Kültürler% 70 konfluent hale sonra, (Şekil 2C)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Hasta biyopsilerinden özofagus epitel hücreleri izole ve genişletmek için en önemli adımlar şunlardır: 1) yeterli minimal hücre ölümü ile biyopsi doku dissociating; 2) temin ROCK önleyicisi, her bir değiştirilen ortam hücre kültürü ortamına ilave edilir; 3) önerilenden daha fazla besleyici hücreler kullanmayın; 4) Temiz aseptik kültürünü korumak; ve 5) izdiham ulaşmadan hemen önce geçiş hücreleri.

Nedeniyle şartlı yeniden programlama için elde edilen biyops...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150 mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50 mL Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658