Reprogrammation conditionnelle de cellules Pediatric Human oesophagien épithéliales pour utilisation en génie tissulaire et recherche sur les maladies

Résumé

Expansion des cellules épithéliales humaines oesophagiennes pédiatriques en utilisant la reprogrammation conditionnelle fournit aux enquêteurs avec une population spécifique au patient des cellules qui peuvent être utilisées pour l'ingénierie des constructions oesophagiennes pour l'implantation autologue pour traiter des défauts ou des blessures et servir de réservoir pour des essais de criblage thérapeutique.

Résumé

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

ingénierie tissulaire oesophagien et éosinophiles oesophagite (EoE) ont fait l'objet de la recherche dans de nombreux laboratoires au cours de la dernière décennie. Malformations congénitales, telles que atrésie de l' œsophage, sont observés chez environ 1 sur 4000 naissances vivantes, ce qui se traduit dans le développement incomplet de l'oesophage menant à l'incapacité de manger ^1. L'incidence et la prévalence de EoE ont été à la hausse depuis l'identification de l'entité de la maladie en 1993. L'incidence de EoE variait de 0,7 à 10 / 100.000 par année-personne et la prévalence variait de 0,2 à 43 / 100.000

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Protocole

biopsies oesophagiennes ont été obtenus après le consentement éclairé a été obtenu à partir des parents / tuteurs des patients pédiatriques et en conformité avec comité d'examen institutionnel (IRB # 13-094).

1. Instruments stérilisant et Gélatine Solution

1. forceps autoclaves, lames de rasoir et des ciseaux avant tissus de manutention pour éviter la contamination.
2. Pour 200 ml de solution de gélatine à 0,1%, mélanger 200 ml d'eau distillée avec 0,2 g de gélatine. Autoclave et refroidir avant de l'utiliser.

2. Coating Tissue Culture Plaques

1. Environ 2 h avant l'isolement des cellul....

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Résultats

Un résumé des principales étapes de l' isolement des cellules épithéliales de l' œsophage de biopsies de patients est résumée à la figure 1. Les colonies de cellules épithéliales se formeront dans environ 4-5 jours et seront entourés par des cellules nourricières de fibroblastes (figure 2A). Etant donné que ces colonies élargissent leur fusion avec les autres pour former des colonies plus grandes colonies (figure 2B).

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Discussion

Les étapes les plus importantes dans le but d'isoler et d'étendre les cellules épithéliales de l'œsophage à partir de biopsies de patients sont: 1) dissociant de manière adéquate le tissu biopsie à la mort cellulaire minimale; 2) assurer un inhibiteur de roche est ajouté au milieu de culture cellulaire à chaque changement de milieu; 3) Ne pas utiliser plus de cellules nourricières que recommandé; 4) maintenir une culture aseptique propre; et 5) les cellules de passage juste avant d'atteindre.......

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150 mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50 mL Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658