La reprogramación condicional de células epiteliales del esófago Pediátrico Humano para el Uso en Ingeniería de Tejidos e Investigación de Enfermedades

Resumen

Expansión de las células epiteliales del esófago pediátricos humanos que utilizan reprogramación condicional proporciona a los investigadores con una población específica del paciente de las células que puede ser utilizada para la ingeniería de las construcciones de esófago para la implantación autóloga para tratar defectos o lesiones y servir como depósito para ensayos de cribado de terapéuticas.

Resumen

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introducción

la ingeniería de tejidos del esófago y la esofagitis eosinofílica (EOE) han sido el foco de la investigación en muchos laboratorios en la última década. Los defectos congénitos, tales como la atresia esofágica, se observan en aproximadamente 1 de cada 4.000 nacidos vivos, lo que resulta en el desarrollo incompleto del esófago que lleva a la incapacidad para comer ^1. La incidencia y prevalencia de la EE han ido en aumento desde que la identificación de la entidad de la enfermedad en 1993. La incidencia de la EE varió de 0,7 como 10 / 100.000 por persona-año y la prevalencia varió de 0,2 a la 43 / 100.000 ^2. Un nuevo abordaje quirúrgico atractivo para el tratamiento de larga distancia atresia esofágica consiste en la generación de construcciones de tejido para su implantación utilizando las propias células del paciente. Estas células, en relación con el andamio sintético generarán una construcción autólogo que no requiere la supresión inmune. Algunos grupos ya han comenzado a investigar los EE.UU.e de las células madre como para ingeniería de tejido de esófago ^3, así como el uso de células epiteliales del esófago nativos para repoblar la mucosa ^4-7. Las enfermedades que están presentes en el esófago de los pacientes pediátricos son a menudo difíciles de diagnosticar o estudiar sin necesidad de intervención. Por otra parte, la utilización de modelos animales o in vitro de líneas celulares inmortalizadas modelos para enfermedades pediátricas como la EE no abarcan la patogénesis de la enfermedad exacta o diferencias específicas de cada paciente ^8. Por lo tanto, la capacidad de estudiar proceso de la enfermedad de un paciente in vitro con el fin de identificar los antígenos específicos de la enfermedad de activación, evaluar los mecanismos subyacentes e investigar los tratamientos con fármacos sería novedoso y proporcionar a los médicos con información que puede ayudar en el tratamiento del paciente.

Ha habido muchos tipos de células autólogas o específicos de los pacientes que se han propuesto para su uso en tissue ingeniería y el estudio de la patogénesis de la enfermedad humana. Sin embargo, algunos de estos tipos de células están limitados en su capacidad de generar suficientes células de un fenotipo específico a las semillas de un gran andamio o llevar a cabo un alto rendimiento en los estudios in vitro. El uso de células madre pluripotentes o multipotentes ha sido el tema de mucha discusión investigación, sin embargo, limitaciones y deficiencias para el uso de estas células han sido bien descritos ^9. El uso de células madre embrionarias humanas es muy debatido y presenta muchos problemas éticos. Más importante, estas células forman teratomas, que son similares a un tumor, si no se diferencian de su estado pluripotente antes de la entrega de ellos en un huésped vivo ^10. Además, el uso de células madre embrionarias no sería específica del paciente y podría provocar una respuesta alogénica y la necesidad de inmunosupresión ^10. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son células pluripotentes que puedense derivan de las propias células de un paciente. Las células somáticas, tales como células de la piel, pueden ser inducidos a un estado pluripotente usando una variedad de técnicas de integración y no de integración. Estas células sirven como fuentes de células específicos para cada paciente para ingeniería de tejidos o la investigación de la enfermedad. La integración de material genético no deseado en estas células es una preocupación muchos han descrito e incluso si las secuencias son completamente eliminados iPSCs parecen conservar una "memoria" epigenética hacia el tipo de célula de la que se derivaron ^11. Estas células también formarán teratomas in vivo si no diferenciadas antes del trasplante ^11. Muchos protocolos de diferenciación se han investigado centrándose en linajes epiteliales ^{12, 13, 14,} sin embargo, es muy importante tener en cuenta que los tipos de células resultantes al final de la diferenciación no son homogéneos y oólo poseen una fracción del tipo celular de interés. Esto resulta en un rendimiento bajo y la necesidad de purificar el tipo celular deseado. Aunque iPSCs son una fuente celular específica del paciente potencial, el proceso para obtener un tipo de célula de interés, ya sea para la ingeniería de tejidos o la investigación de la enfermedad es muy ineficiente.

Células epiteliales humanas se han aislado con éxito de una variedad de ambos tejidos enfermos y no enfermos en el cuerpo humano, incluyendo: pulmón ^15, pecho ^16, el intestino delgado ^17, colon ^18, la vejiga ¹⁹ y el esófago ^20. Es importante tener en cuenta que las células primarias humanas tienen un número finito de pasos en los que el fenotipo se mantiene ^{21, 22.} Desafortunadamente, esto significa que el número de células necesarias para la investigación de la enfermedad o para la siembra de un andamio de ingenieríapara la implantación no puede ser alcanzado. Por lo tanto, se necesitan nuevas técnicas para expandir las células del paciente mientras que todavía mantiene un fenotipo epitelial. Reprogramación condicional de células epiteliales normales y cancerosas utilizan células alimentadoras y inhibidor de la roca fue descrito en 2012 por Liu et al. ^{2 3.} Esta técnica se utilizó para expandir las células epiteliales cancerosas obtenidas de biopsias de cáncer de próstata y de mama utilizando células alimentadoras irradiadas, inhibidores de la ROCA y medianas reprogramación condicional. El objetivo era generar suficientes células para ensayos in vitro tales como la detección de drogas. Esta técnica es capaz de expandir las células epiteliales de forma indefinida por "reprogramación" estas células a un vástago o estado progenitor similar, que es altamente proliferativa. Se ha demostrado que estas células son no tumorigénicos y no poseen la capacidad de formar teratomas ^{23, 24.} Además, no seanomalías cromosómicas o manipulaciones genéticas estaban presentes después de pases estas células en cultivo usando esta técnica ^{23, 24.} Lo más importante, estas células sólo son capaces de diferenciarse en el tipo de célula nativa de interés. Por lo tanto, esta técnica ofrece una gran reserva de células epiteliales de pacientes específicos para la investigación de la enfermedad o la ingeniería de tejidos sin la necesidad de la inmortalización.

La obtención de tejido epitelial de un órgano específico con el fin de estudiar los procesos de enfermedad es a menudo limitado y no siempre es posible debido a riesgo del paciente. Para aquellos pacientes que sufren de enfermedad esofágica o defectos, la recuperación de biopsia endoscópica es un método mínimamente invasivo para la obtención de tejido epitelial que puede ser disociado y condicionalmente reprogramado para proporcionar una fuente de células indefinido que es específico de la mucosa del esófago de ese paciente. Esto permite entonces para estudios in vitrode las células epiteliales para evaluar los procesos de enfermedad y la pantalla para terapéuticos potenciales. Un proceso de la enfermedad que podría beneficiarse en gran medida de este enfoque es esofagitis eosinofílica, que ha sido descrito como una enfermedad alérgica del esófago ^8. Las pruebas de alergia, así como enfoques terapéuticos podrían ser evaluados in vitro usando las propias células epiteliales del paciente y estos datos pueden ser pasados al médico tratante para desarrollar planes de tratamiento individualizados. La técnica de reprogramación condicional en conjunción con la obtención de biopsias endoscópicas de pacientes pediátricos ofrece la posibilidad de expandir las células epiteliales del esófago normales indefinidamente de cualquier paciente. Por tanto, esta fuente de células podría ser asociado junto con el andamio natural o sintética para proporcionar una opción quirúrgica específica del paciente en busca de defectos, enfermedad o trauma. Tener un número indefinido de células podría ayudar a diseñar construcciones esofágicas que poseen un completo vuelven a sembrarlumen con las células epiteliales del esófago con el fin de ayudar a facilitar la regeneración de los tipos de células restantes.

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Protocolo

Se obtuvieron biopsias esofágicas tras el consentimiento informado se obtuvo de los padres / tutores de los pacientes pediátricos y de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional (IRB # 13-094).

1. Esterilización Instrumentos y gelatina Solución

1. fórceps autoclave, cuchillas de afeitar y tijeras antes de manipular el tejido para evitar la contaminación.
2. Para hacer 200 ml de solución de gelatina al 0,1%, se combinan 200 ml de agua destilada con 0,2 g de gelatina. Autoclave y enfriar antes de su uso.

2. Revestimiento de cultivo de tejidos placas

1. Aproximadamente 2 h antes del aislamiento de células, añadir una cantidad suficiente 0,1% de gelatina para cubrir una placa de cultivo tisular (100 mm) y se incuba a 37 ° C en una incubadora de cultivo celular.
   NOTA: Estas placas también se pueden hacer antes de tiempo y se mantienen en la incubadora antes de su uso.

3. Hacer Solución de Enzima para la disociación

1. Aproximadamente 30 minutos antes de aislamiento de células, pésese10 unidades de dispasa en un equilibrio basado en las unidades por miligramo de concentración en el vial. Coloque el polvo en un tubo cónico de 15 ml con 10 ml de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y se coloca en un baño de agua a 37 °.

4. Toma de célula medio de cultivo

1. Para hacer 50 ml de medio de reprogramación condicional, mezclar los siguientes ingredientes en un tubo estéril cónico: 35 ml de F12 (de Ham Medium), 11,5 ml de DMEM, 0,5 ml de L-glutamina, 0,5 ml de 100x penicilina / estreptomicina, 2,5 ml de suero bovino fetal (FBS), 250 mg de insulina humana, 500 ng del factor de crecimiento epidérmico humano (EGF).
2. Para hacer 500 ml de medio 3T3, mezclar 50 ml de FBS, 5 ml de 100x penicilina / estreptomicina y 5 ml de L-glutamina con 500 ml de DMEM.
3. Para hacer 500 ml de medio libre de suero de queratinocitos, descongelar los suplementos de extracto de pituitaria bovina (BPE) (provistos con los medios de comunicación) y EGF. Añadir los complementos de la botella ml de medio base 500 y añadir 5 ml de 100x penicilina / estreptomicina

5. El cultivo y la irradiación de las células 3T3 como fuente alimentador

1. Preparar medio 3T3, que comprende DMEM, 10% FBS, 1x penicilina / estreptomicina y 2 mM L-glutamina.
2. Cultura 3T3 células tratadas en los tejidos T-75 frascos de al menos 3 días antes de la llegada de las muestras de pacientes.
   1. Justo antes de la llegada de las muestras de pacientes, trypsinize células 3T3 utilizando 5 ml de 0,25% de tripsina-EDTA por frasco y se incuba a 37 ° C durante 5 min o hasta que la mayoría de las células están flotando
3. Añadir 5 ml de 3T3 medio para detener la reacción. Aspirar la suspensión de células y la transferencia a un tubo cónico de 15 mL. Centrifugado durante 5 min a 300 x g.
4. Aspirar el medio y volver a suspender las células en un volumen definido de Trypan azul para el recuento de células. Combinar 10 l de células con 10 l de azul de tripano para excluir las células muertas. Cargar 10 l de esta solución en un hemocitómetro para el recuento celular.
   NOTA: Para este protocol, densidad de siembra para células 3T3 irradiados es 10.900 células por cm ^2, que es igual a 600.000 células por placa de 100 mm.
5. Alícuota el número de células necesarias para la placa una placa de 100 mm por muestra del paciente y volver a suspender en 25 ml de medio 3T3 en un tubo cónico de 50 ml e irradiar con 3000 rads.
6. Después de la irradiación, las células Centrifugar durante 5 minutos a 300 xg y resuspender en medio reprogramación condicional en 5 ml por placa de 100 mm.
7. Ajuste el tubo a un lado hasta que el recubrimiento de las células del paciente se lleva a cabo más adelante en el protocolo (véase el paso 7.6).

6. La obtención, preservación y transporte de biopsias esofágicas pediátricos

1. Añadir 5 ml de medio libre de suero de queratinocitos completo con 100 mg / ml primocin a tubos cónicos de 15 ml y llevarlo al centro médico en el hielo.
   NOTA: Estos tubos de medio pueden ser almacenadas a 4 ° C durante un máximo de 2 meses.
2. Obtener aproximadamente 8 biopsias esofágicas en el time de la endoscopia y separada de la siguiente manera:
   1. Coloque seis biopsias en los 15 ml cónica que contiene un medio libre de suero de queratinocitos completa con 100 g / ml primocin y colocar en hielo húmedo.
   2. Coloque una biopsia en 5 ml de formalina tamponada y el lugar en hielo húmedo.
   3. Coloque una biopsia de una pequeña biopsia criomolde con el compuesto de temperatura óptima de corte.
      1. Inmediatamente deje caer este molde en un vaso de precipitados de isopentano colocado en nitrógeno líquido. Una vez congelado, colocar el criomolde en una bolsa de muestra y almacenar en hielo seco en un recipiente de espuma de poliestireno.
3. Colocar los tubos que contenían biopsias en medio o formalina dentro de una bolsa de cierre hermético y luego en una caja de envío contiene hielo húmedo. Sellar y etiquetar la caja con una etiqueta de riesgo biológico y lo transportan al laboratorio.
   NOTA: El recipiente que contiene el hielo seco y la biopsia congelado también se sella y se marca con un marcador de riesgo biológico.

7. TratamientoEl tejido del paciente para la Cultura y Análisis de Downstream

1. A su llegada al laboratorio, la transferencia de la biopsia por congelación en hielo seco a -80 ° C congelador para la sección aguas abajo o la extracción de RNA. Colocar la muestra en formalina. Almacenar en un refrigerador de 4 ° C y poder fijar una noche a la mañana.
2. Girar las biopsias restantes hacia abajo a 300 xg, y aspirar el medio. Añadir 10 ml de dispasa solución al tubo cónico, sello y permitir que se incuba a 37 ° C en un baño de agua durante 15 minutos.
3. Después de la incubación, girar las biopsias hacia abajo a 300 x g. Aspirar las biopsias medio y volver a suspender en 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA.
4. Transferir el 5 ml de tripsina-EDTA que contiene las biopsias a una placa estéril de 100 mm y picar las biopsias por medio de 2 hojas de afeitar esterilizadas lo más fina posible.
5. Transferir el 5 ml de tripsina-EDTA que contiene biopsias picada a un nuevo 15 ml cónico. Enjuagar la placa dos veces con un 5 ml más de 0,05% de tripsina-EDTA y añadir a la cónicatubo. Incubar el tubo durante 10 min en un baño de agua C 37 °.
6. Después de la incubación, girar las biopsias hacia abajo a 300 xg (1,4 rpm) durante 5 min y aspirar el medio. Añadir 5 ml de medio de reprogramación condicional al tubo cónico, así como el 5 mL de medio de reprogramación condicional que contiene las células de alimentación irradiadas (véase el paso 5.7).
7. Añadir inhibidor de roca (1 l / ml) a los 10 ml de suspensión de células y la placa después de aspirar la gelatina de la cápsula de cultivo de tejidos. Se incuba a 37 ° C.

8. El cultivo y las células en expansión

1. Después de aproximadamente 5 días de cultivo, aspirar el medio inicial que contiene las piezas picada-biopsia y aclarar el plato 2-3 veces con 5 ml de PBS estéril. Añadir nuevo medio a la placa que incluye inhibidor de roca en 10 mM.
2. Al llegar a 70% de confluencia, expandir las células. Añadir 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA a la placa y se incuban en una incubadora a 37ºC no más de 2,5 min para eliminar THcélulas de alimentación e. Después de que la incubación, aspirar el tripsina-EDTA y enjuagar la placa con 5 ml de PBS.
3. Aspirar el PBS y añadir 5 ml de 0,25% tripsina-EDTA a la placa y se incuba durante 5-10 minutos o hasta que las células están sueltos de la placa. Añadir cantidades iguales de medio a la placa para detener la reacción y la transferencia de todo el fluido a un tubo de 50 ml cónico y centrifugar a 300 xg durante 5 min.
4. Resuspender las células en un volumen definido de medio de reprogramación condicional y mezclar 10 l de la suspensión con 10 l de azul de tripano. Contar con un hemocitómetro para determinar el número total de células.
5. Para expandir las células, añadir 1 millón de células esofágicas humanos a una placa de 150 mm junto con 1,2 millones de células 3T3 irradiadas en un volumen total de 15 mL. Añadir inhibidor de roca fresca en 10μM y añadir la suspensión de células a una placa recubierta con gelatina 150 mm.

9. Las células congelación y la conservación de esófago humano epiteliales

1. Para hacer un medio de congelación, añadir un 10%DMSO al medio de reprogramación condicional. Después de tripsinización y contando, alícuota de las células a congelar en un nuevo tubo de 50 ml cónico y centrifugar a 300 xg durante 5 min.
2. Aspirar el medio y añadir medio de congelación en un volumen de 2 ml por criovial. Una vez que la suspensión de células es homogénea, alícuota de 10 ⁶ células en cyrovials pre-etiquetados. Colocar en un recipiente de congelación a -80 ° C durante al menos 24 h antes de mover los viales de almacenamiento de nitrógeno líquido a largo plazo.

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Resultados

Un resumen de los pasos clave en el aislamiento de células epiteliales del esófago de biopsias de pacientes se resume en la figura 1. Las colonias de células epiteliales se forman en aproximadamente 4-5 días y estará rodeado de células alimentadoras de fibroblastos (Figura 2A). A medida que estas colonias se expanden van a fusionarse con otras colonias para formar colonias grandes (Figura 2B). Una vez que las culturas se han conver...

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Discusión

Los pasos más importantes con el fin de aislar y expandir las células epiteliales del esófago de biopsias de pacientes son: 1) disociar adecuadamente tejido de biopsia con la muerte celular mínima; 2) garantizar inhibidor de la roca es añadido al medio de cultivo celular en cada cambio de medio; 3) No use más células alimentadoras que los recomendados; 4) mantener un cultivo aséptico limpio; y 5) las células de paso justo antes de llegar a la confluencia.

Debido a las diferencias re...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150 mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50 mL Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658