תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל ושט האדם Pediatric לשימוש בהנדסת רקמות וחקירת מחלות

Summary

הרחבת תאי אפיתל ושט ילדים אנושיים ניצול תכנות מחדש מותנה מספקת חוקרים עם אוכלוסיית חולים ספציפיים של תאים שיכולים להיות מנוצלת עבור הנדסת בונת ושט להשתלה אוטולוגית לטיפול פגמים או פציעה ומגיש כמאגר מבחני מיון טיפוליים.

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient's symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

הנדסת רקמות בושט דלקת ושט אאוזינופילית (EOE) הייתה במוקד המחקר במעבדות רבות בעשור האחרון. מומים מולדים, כגון atresia ושט, נראים כ 1 ב -4,000 לידה חייה, שתוצאתה הפיתוח השלם של הוושט המוביל את חוסר היכולת לאכול ^1. שכיחות ושכיחות EOE היו במגמת עלייה מאז זיהוי של הישות המחלה בשנת 1993. תחולת EOE נע בין 0.7 כדי 10 / 100,000 לנפש שנים והשכיחות נע מ -0.2 כדי 43 / 100,000 ^2. גישה כירורגית אטרקטיבית חדשה בטיפול atresia ושט פער ארוך מורכבת ביצירת מבני רקמות להשתלת ניצול התא של החולה עצמו. תאים אלה בשיתוף עם פיגומים סינטטיים יפיקו מבנה עצמי שאינו דורש דיכוי מערכת חיסוני. חלק מהקבוצות כבר החלו לחקור את לנודואר של תאים דמויי גזע עבור הנדסת רקמות ושט ³ וכן שימוש בתאי אפיתל ושט יליד לאכלס מחדש את הרירית ^{4 - 7.} מחלות שנמצאים הוושט של מטופלים ילדים הם לעתים קרובות קשה לאבחן או ללמוד ללא התערבות. יתר על כן, מודלים של בעלי חיים תוך ניצול או במבחנה הנציחו מודלי שורת תאים למחל ילדים כמו EOE לא להקיף את בהיווצרות המחלה המדויקת או הבדלים מסוימים חולה ^8. לכן, היכולת ללמוד תהליך מחלתו של מטופל במבחנה כדי לזהות אנטיגנים מפעילים מחלה ספציפי, להעריך מנגנונים ולחקור טיפולים תרופתיים יהיה רומן ולספק לרופאים עם מידע שיכול לסייע בטיפול בחולה.

היו הרבה סוגי תאים עצמיים או חולה ספציפי כי הוצעו לשימוש tissuהנדסת דואר ולומד בהיווצרות מחלה אנושית. עם זאת, חלק של סוגי תאים אלו מוגבלים ביכולת שלהם לייצר מספיק תאים של פנוטיפ ספציפי זרע פיגום גדול או לבצע העברת נתונים גבוהות במבחנה. השימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים או מולטיפוטנטיים כבר נושא לדיון מחקר רב, עם זאת, מגבלות וליקויים עבור באמצעות תאים אלה כבר היטיב לתאר ^9. השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים הוא התווכח מאוד ומציג שאלות אתיות רבות. והחשוב מכל, תאים אלה יוצרים teratomas, דומי גידול, אם הם אינם מובחנים מן פלוריפוטנטיים מדינתם לפני מתן אותם שורת חיים ^10. יתר על כן, השימוש בתאי גזע עובריים לא יהיה חולה ספציפי ויכול לעורר תגובה אלוגנאית וצורך דיכוי מערכת חיסוני ^10. תאי גזע מושרים (iPSCs) הם תאים פלוריפוטנטיים שיכולהלהיות שמקורם בתאים עצמו חולה. תאים סומטיים, כגון תאי עור, יכולים להיגרם למדינה פלוריפוטנטיים תוך שימוש במגוון של טכניקות אינטגרטיבית בלתי משתלבות. תאים אלה לשמש מקורות תא ספציפי לחולה עבור הנדסת רקמות או חקירת מחלה. השילוב של חומר גנטי לא רצוי לתוך התאים אלה הוא דאגה רבה תארה וגם אם רצפים הם הוסרו לחלוטין iPSCs להופיע לשמר אפיגנטיים "זיכרון" לקראת סוג התא שממנו הם נגזרו ^11. תאים אלה גם יהוו teratomas in vivo אם לא הבדיל לפני ההשתלה ^11. פרוטוקולי בידול רבים נחקרו התמקדות שושלות אפיתל ^{12, 13, 14,} לעומת זאת, חשוב מאוד לציין כי סוגי התא וכתוצאה מכך בסוף הבידול אינם עשויים מקשה אחת ו- Only להחזיק חלק מן סוג התא של עניין. התוצאה היא תשואה נמוכה והצורך לטהר את סוג התא הרצוי. למרות iPSCs הוא מקור תא חולה ספציפי פוטנציאל, התהליך כדי לקבל סוג תא של עניין עבור הנדסה או רקמות או חקירת מחלה הוא מאוד לא יעיל.

תאי אפיתל אדם בודדו בהצלחת ממגוון הוא לרקמות חולות ולא חולה בגוף האדם כולל: ריאות ^15, שד ^16, מעי דק ^17, מעי גס ^18, שלפוחית שתן ¹⁹ ו ^-20 ושט. חשוב לציין כי תאים ראשוניים אדם יש מספר סופי של הקטעים שבהם הפנוטיפ נשמר ^{21, 22.} למרבה הצער, זה אומר כי מספר התאים הדרושים לחקירת מחלה או זריעת פיגום מהונדסלהשתלה לא יכול להיות מושגת. לכן, טכניקות חדשות נדרשות להרחיב תאי מטופל, תוך שמירה על פנוטיפ אפיתל. תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל תקינים ותאי סרטן ניצול מזין תאים ו מעכב ROCK תוארה בשנת 2012 על ידי Liu et al. ^{2 3.} טכניקה זו נוצלה כדי להרחיב לתאי האפיתל סרטניים המתקבלים ביופסיות של סרטן הערמונית וסרטן השד באמצעות תאי מזין מוקרנים, מעכב ROCK ובינוני תכנות מחדש על תנאי. המטרה היתה לייצר תאים מספיק עבור מבחני חוץ גופית כגון הקרנת סמים. טכניקה זו מסוגלת הרחבת תאי אפיתל ללא הגבלת זמן על ידי "תכנות מחדש" של תאים אלה גבעול או המדינה- כמו אבי, שהוא שגשוג מאוד. הוכח כי התאים האלה הם בלתי tumorigenic ואינם בעלי יכולת לגבש teratomas ^{23, 24.} יתר על כן, לאפגמים בכרומוזומים או מניפולציות גנטיות נכחו לאחר passaging תאים אלה בתרבות באמצעות טכניקה זו ^{23, 24.} והחשוב מכל, תאים אלה הם רק מסוגלים להתמיין לסוג תא יליד העניין. לכן, טכניקה זו מציעה מאגר גדול של תאי אפיתל מטופל ספציפי לחקירת מחלה או הנדסת רקמות ללא צורך הנצחה.

קבלת רקמות אפיתל מאיבר מסוים על מנת ללמוד תהליכי מחלה עשויה להיות מצומצמת ולא תמיד אפשרית בשל סיכון מטופל. עבור אותם חולים הסובלים ממחלת ושט או פגמים, תחזור ביופסיה אנדוסקופית היא גישה פולשנית להשגת רקמת אפיתל שניתן ניתקת לתכנות מחדש על התנאי לספק מקור תא מוגדר ספציפי הרירי של אותו הוושט חולה. אז זה מאפשר ללימודי חוץ גופיתשל תאי אפיתל להעריך תהליכי מחלה ומסך עבור הרפוי פוטנציאלי. תהליך המחלה אחד שיכול להפיק תועלת רבה מן גישה זו היא דלקת ושט אאוזינופילית, אשר תוארה מחלות אלרגיות של הוושט ^8. בדיקות אלרגיה כמו גם גישות טיפוליות ניתן היה להעריך במבחנה תוך שימוש בתאי האפיתל של החולה עצמו ונתונים אלה לאחר מכן ניתן עברו על הרופא המטפל לפתח תוכניות טיפול אישיות. הטכניקה של תכנות מחדש מותנה בשיתוף עם קבלת ביופסיות אנדוסקופיות מחולי ילדים מציעה את היכולת להרחיב את תאי אפיתל ושט נורמלים ללא הגבלה זמן מכל חולה. מקור תא זה יכול אפוא להיות חבריו בפיגום טבעי או סינטטי לספק אפשרות כירורגית מטופל ספציפי עבור פגמים, מחלה או טראומה. לאחר מספר תאים בלתי מוגדר יעזור להנדס בונת ושט המשתלטת על reseeded לחלוטיןלומן עם תאי אפיתל הוושט כדי לעזור להקל על התחדשות של תאים מסוגים הנותרים.

Protocol

ביופסיות ושט התקבלו לאחר הסכמה מהדעת התקבלה ההורים / אפוטרופוסים של מטופלי ילדים ובהתאם לוח הסקירה מוסדי (IRB # 13-094).

פתרון 1. מכשירי חיטוי לטין

1. מלקחי חיטוי, סכיני גילוח ומספרי לפני טיפול רקמות על מנת למנוע זיהום.
2. כדי להפוך 200 מ"ל של תמיסת הג'לטין 0.1%, לשלב 200 מ"ל מים מזוקקים עם 0.2 גרם של ג'לטין. חיטוי וקריר לפני שימוש.

2. תרבות צלחות רקמות ציפוי

1. כ 2 שעות לפני בידוד תא, להוסיף מספיק 0.1% ג'לטין לכסות צלחת בתרבית רקמה (100 מ"מ) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה תרבית תאים.
   הערה: אלה צלחות יכולות גם להתבצע מראש והמשיכו בחממה לפני השימוש.

3. ביצוע פתרון אנזימים עבור דיסוציאציה

1. כ -30 דקות לפני בידוד תא, לשקול את10 יחידות של dispase על איזון על בסיס יחידות לכל ריכוז מיליגרם על הבקבוקון. מניחים את אבקת צינור חרוטי 15 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ומניחים באמבט מים C ° 37.

4. Cell ביצוע בינוני תרבות

1. כדי להפוך 50 מ"ל של מדיום תכנות מחדש מותנה, לערבב את החומרים הבאים לתוך צינור חרוטי סטרילי: 35 מ"ל של F12 (בינוני של Ham), 11.5 מ"ל של DMEM, 0.5 מ"ל של L- גלוטמין, 0.5 מ"ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין, 2.5 מ"ל של בסרום שור העובר (FBS), 250 מיקרוגרם של אינסולין אנושי, 500 ננוגרם של גורם הגדילה באפידרמיס האדם (EGF).
2. כדי להפוך 500 מ"ל של 3T3 בינוני, לערבב 50 מ"ל של FBS, 5 מ"ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין ו 5 מ"ל של L- גלוטמין עם 500 מ"ל של DMEM.
3. כדי להפוך 500 מ"ל של מדיום סרום ללא keratinocyte, להפשיר EGF ותמצית יותרת המוח שור (BPE) תוספי מזון (מסופק עם התקשורת). מוסיפים את ונספחי בקבוק מ"ל 500 של המדיום בסיס ולהוסיף 5 מ"ל של 10פניצילין 0x / סטרפטומיצין

5. Culturing ו irradiating 3T3 תאים כמקור מזין

1. הכן בינוני 3T3, המהווים DMEM, 10% FBS, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 מ"מ L- גלוטמין.
2. תרבות 3T3 תאי צלוחיות רקמות שטופלו T-75 לפחות 3 ימים לפני ההגעה של דגימות חולות.
   1. זמן קצר לפני הגעתו של דגימות חולות, trypsinize 3T3 תאים באמצעות 5 מיליליטר של 0.25% טריפסין- EDTA לכל בקבוק לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד שרוב התאים צפו
3. הוסף 5 מ"ל של 3T3 בינוני כדי לעצור את התגובה. לשאוב את ההשעיה תא ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין במשך 5 דקות ב g 300 x.
4. לשאוב הבינוני resuspend תאים בנפח מוגדר של כחול Trypan עבור ספירת תאים. שלב 10 μL של תאים עם 10 μL של Trypan כחול להוציא תאים מתים. טען 10 μL של פתרון זה על hemocytometer עבור ספירת תאים.
   הערה: לקבלת פרוטו זהcol, צפיפות זריעה עבור 3T3 תאים מוקרן הוא 10,900 תאים לס"מ ^2, אשר שווה 600,000 תאים לכל צלחת 100 מ"מ.
5. Aliquot את מספר התאים הדרושים צלחת צלחת 100 מ"מ לדגימה המטופל resuspend ב 25 מ"ל של 3T3 בינוניים צינור חרוטי 50 מ"ל ו מקרינים עם 3000 rads.
6. בעקבות הקרנה, ספין התאים למשך 5 דקות ב 300 XG ו resuspend במדיום תכנות מחדש מותנה ב 5 מ"ל לכל 100 צלחת מ"מ.
7. הגדר את צינור הצידה עד הציפוי של תאי חולה מתרחש מאוחר יותר בפרוטוקול (ראה שלב 7.6).

6. קבלה, שימור הובלת ביופסיות Pediatric ושט

1. הוסף 5 מ"ל של סרום ללא בינוני keratinocyte להשלים עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​primocin עד 15 צינורות חרוטי מ"ל ולהביא אותו למוקד רפואי על הקרח.
   הערה: אלה צינורות של המדיום יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד 2 חודשים.
2. השג כ 8 ביופסיות הוושט בבית tiלי אנדוסקופיה ונפרד כדלקמן:
   1. מניחים שש ביופסיות של חרוטי 15 מ"ל המכיל בינוני חופשי בסרום keratinocyte להשלים עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​primocin ומניחים על קרח רטוב.
   2. מניח ביופסיה אחד ב 5 מיליליטר של פורמלין שנאגר ומניחים על קרח רטוב.
   3. מניח ביופסיה אחת ביופסיה קטנה cryomold עם מתחם טמפרטורת חיתוך אופטימלי.
      1. מיד טיפה עובש זה לתוך מבחנה של איזופנטאן להציב בחנקן נוזלי. לאחר קפוא, למקם את cryomold בשקית הדגימה ולאחסן על קרח יבש במיכל קצף פוליסטירן.
3. מניחים את צינורות המכילים ביופסיות במדיום או פורמלין בתוך שקית סגר ולאחר מכן לתוך קופסת משלוח המכיל קרח רטוב. חותם תווית בתיבה עם תווית Biohazard ולהעביר אותה למעבדה.
   הערה: המכל המכיל את הקרח היבש הביופסיה קפוא הוא חתום גם ומסומן עם תווית Biohazard.

עיבוד 7.רקמות חולות לתרבות ניתוח Downstream

1. בהגיעם במעבדה, להעביר הביופסיה קפוא על קרח יבש כדי מקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך חתך במורד הזרם או מיצוי RNA. מניחים את המדגם בפורמלין. אחסן במקרר 4 ° C ולאפשר לתקן לילה.
2. ספין הביופסיות הנותרים למטה ב 300 XG, לשאוב את המדיום. הוסף 10 מיליליטר של dispase פתרון הצינור, חותם חרוטים ולאפשר לו לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 15 דקות.
3. לאחר הדגירה, לסובב את הביופסיות ב g 300 x. לשאוב ביופסיות בינוני ו resuspend ב 5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA.
4. מעבירים את 5 מ"ל של-EDTA טריפסין המכיל הביופסיות לצלחת 100 מ"מ סטרילית לרכך את ביופסיות באמצעות 2 סכיני גילוח מעוקרים כמו קנס ככל האפשר.
5. מעבירים את 5 מ"ל של-EDTA טריפסין המכיל ביופסיות טחון חרוטי 15 מ"ל חדש. יש לשטוף את הצלחת פעמים עם 5 מיליליטר נוסף של 0.05% טריפסין- EDTA ומוסיף החרוטיםצינור. דגירה הצינור במשך 10 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
6. לאחר הדגירה, לסובב את הביופסיות למטה XG ב 300 (1.4 סל"ד) במשך 5 דקות ו לשאוב את המדיום. הוסף 5 מ"ל של מדיום תכנות מחדש מותנה צינור חרוטי וכן 5 מ"ל של מדיום תכנות מחדש מותנה המכיל את התאים מזין מוקרן (ראה שלב 5.7).
7. הוסף מעכב ROCK (1 μL / מ"ל) אל 10 מ"ל של השעיה תא צלחת לאחר aspirating את הג'לטין מצלחת בתרבית רקמה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס.

Culturing 8. תאי הרחבה

1. לאחר כ 5 ימים של תרבות, לשאוב את המדיום הראשוני המכיל את חתיכות טחון-ביופסיה ולשטוף את צלחת 2-3 פעמים עם 5 מ"ל PBS סטרילית. הוסף בינוני חדש לצלחת כולל מעכבי ROCK ב 10 מיקרומטר.
2. בהגיעם 70% confluency, להרחיב את התאים. הוסף 5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA לצלחת דגירה של 37 מעלות צלזיוס חממה לא יותר מ -2.5 דקות כדי להסיר התאי מזין דואר. לאחר דגירה כי, לשאוב טריפסין-EDTA ולשטוף את צלחת עם 5 מ"ל של PBS.
3. לשאוב PBS ולהוסיף 5 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA לצלחת דגירה במשך 5-10 דקות או עד שהתאים רופפים מהצלחת. להוסיף כמויות שווות של מדיום לצלחת כדי לעצור את התגובה ולהעביר את כל הנוזל לצינור 50 מיליליטר חרוטים והמסובב ב XG 300 במשך 5 דקות.
4. תאים Resuspend בנפח מוגדר בינוני תכנות מחדש מותנה ומערבבים 10 μL של ההשעיה עם 10 μL של trypan כחול. סמוך על hemocytometer לקבוע מספר תא הכולל.
5. כדי להרחיב את התאים, להוסיף 1 מיליון תאים אנושיים הוושט לצלחת 150 מ"מ יחד עם 1.2 מיליון מוקרן 3T3 תאים בנפח כולל של 15 מ"ל. הוסף מעכב ROCK הטרי 10μM ולהוסיף את השעית התא בצלחת ג'לטין צופה 150 מ"מ.

9. להקפיא חנות אדם תאי הוושט אפיתל

1. כדי להפוך הקפאה בינונית, מוסיף 10%DMSO עד בינוני תכנות מחדש על תנאי. לאחר trypsinizing ועוד היד נטויה, aliquot התאים להקפיא לתוך צינור 50 מ"ל חרוטי חדש ומסובב ב XG 300 במשך 5 דקות.
2. לשאוב הבינוני ומוסיף הקפאה בינונית בהיקף של 2 מיליליטר לכל cryovial. לאחר ההשעיה התא הוא הומוגני, aliquot 10 ⁶ תאים cyrovials מראש שכותרתו. מקום במיכל הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות לפני הזזת צלוחיות אחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך.

תוצאות

סיכום של צעדי מפתח לבודד תאי אפיתל ושט ביופסיות חולה מסוכם באיור 1. מושבות של תאי אפיתל תהווינה כ 4-5 ימים ויהיו מוקפות תאי מזין פיברובלסטים (איור 2 א). כמו מושבות אלה להרחיב הם יתמזגו עם מושבות אחרות כדי ליצור מושבות גדולות יותר

Discussion

הצעדים החשובים ביותר על מנת לבודד להרחיב בתאי אפיתל הוושט ביופסיות המטופל הם: 1) כראוי מתנער הדגימה יחד מוות של תאים מינימלי; 2) להבטיח מעכב ROCK מתווסף בינוני תרבית תאים בכל החלפה בינונית; 3) אין להשתמש תאים מזינים יותר ממומלץ; 4) לשמור על תרבות מזוהמת נקיה; ו -5) תאים מעבר ר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15 mL Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150 mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50 mL Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25 mL Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658