العزلة وإثراء الكبد السلف مجموعات فرعية تم تحديدها من قبل رواية السطح علامة الجمع

Summary

ويرافق إصابات الكبد عن طريق التوسع خلية سلفية التي تمثل السكان الخلية غير المتجانسة. تصنيف رواية من هذا مقصورة الخلوية يسمح للالمميزة للمجموعات فرعية متعددة. الطريقة الموصوفة هنا يوضح تحليل التدفق الخلوي وعالية العزلة نقاء مختلف مجموعات فرعية والتي يمكن استخدامها لإجراء مزيد من الفحوص.

Abstract

خلال إصابات الكبد المزمنة، الخلايا الاصلية توسع في عملية تسمى رد فعل ductular، الذي ينطوي أيضا على ظهور ارتشاح الخلايا الالتهابية وتنشيط الخلايا الظهارية. ومعظمها تم التحقيق في عدد السكان خلية سلفية أثناء هذه التفاعلات الالتهابية باستخدام علامات سطح واحد، إما عن طريق التحليل النسيجي أو عن طريق تدفق التقنيات التي تعتمد الخلوي. ومع ذلك، علامات سطح رواية حددت مختلف مجموعات فرعية متميزة وظيفيا داخل السلف الكبد / وقف حجرة الخلية. الطريقة المعروضة هنا يصف العزلة وتدفق مفصل الخلوي تحليل مجموعات فرعية السلف باستخدام تركيبات علامة سطح الرواية. وعلاوة على ذلك، فإنه يوضح كيف يمكن أن تكون معزولة مختلف مجموعات فرعية خلية سلفية مع الأساليب القائمة على الفرز نقاء عالية باستخدام الآلي المغناطيسي ونظام مراقبة الأصول الميدانية. الأهم من ذلك، الرواية والأنزيمية مبسط تفكك الكبد يسمح لعزل هؤلاء السكان الخلية نادرة مع قابلية عاليةوهذا هو أعلى بالمقارنة مع الطرق الأخرى القائمة. هذا مهم بشكل خاص لمزيد من الدراسة الخلايا الاصلية في المختبر أو لعزل ذات جودة عالية الحمض النووي الريبي لتحليل الشخصية التعبير الجيني.

Introduction

ويرتبط تجديد الكبد في الغالب مع القدرة الذاتي تجديد خلايا الكبد. ومع ذلك، تحدث إصابات الكبد المزمنة مع تفعيل خلية سلفية والتوسع، والتي ارتبطت مع قدرتها على التمايز إلى خلايا الكبد وcholangiocytes ^{1، 2، 3، 4.} هذا مهم بشكل خاص لأنه، أثناء الإصابات المزمنة، وانتشار خلايا الكبد ليست فعالة. وعلى الرغم من الدراسات تتبع وراثية متعددة تستهدف الخلايا الاصلية، ودورها في تجديد الكبد لا تزال مثيرة للجدل ^{5، 6، 7، 8.} وعلاوة على ذلك، وقد تم ربط تنشيط الخلايا الاصلية لزيادة استجابة التليف في الكبد، مما يثير التساؤلات حول دورها المحدد خلال الإصابات ⁹، ^10.

منذ فترة طويلة واقترح الطبيعة غير المتجانسة للمقصورة خلية سلفية دراسات التعبير الجيني الذي عزل الخلايا الاولية تعبر عن علامة السطح واحدة باستخدام تسليخ مجهري أو خلية على أساس أساليب الفرز ^{1، 11.} في الواقع، في الآونة الأخيرة، رواية الجمع بين علامة السطح باستخدام gp38 (podoplanin) مرتبطة بشكل لا لبس فيه علامات واحدة السابقة الخلايا الاصلية لمختلف مجموعات فرعية ^12. الأهم من ذلك، هذه فرعية لا تختلف فقط في التعبير علامة السطح، بل أيضا عرضت التعديلات الوظيفية أثناء الإصابات ^12.

وقد استخدمت نماذج حيوانية متعددة للتحقيق في تنشيط الخلايا الاصلية وتجديد الكبد. ويبدو أن أنواع الإصابات المختلفة تعزز تفعيل مجموعات فرعية من الخلايا الاصلية ¹² اختلاف. هذا قد يفسر الرقم الهيدروجينيالاختلاف enotypic من رد فعل ductular لوحظ في البشر ^(4). وهكذا، فإن المظهرية والوظيفية التحليلات المعقدة من الخلايا الاصلية تقوم بدور محوري في فهم دورها في الإصابات والمغزى الحقيقي للتفاعل ductular في أمراض الكبد.

إلى جانب مجموعات علامة السطح، والاختلافات الجوهرية في بروتوكولات العزل الخلية يزيد من تعقيد استنتاجات تستند إلى الدراسات السابقة ^2. وهناك كمية كبيرة من الدراسات تناولت دور الخلايا الاولية التي تختلف كثيرا في بروتوكول عزلتهم (على سبيل المثال، التفكك الكبد (مزيج انزيم ومدة العملية)، متوسطة الكثافة، وسرعة الطرد المركزي) ^2. تقنية العزل الأمثل، وتوفير قابلية أفضل للسكان الخلية نادرة وتعكس تركيبة فرعية، وقد تم تطوير ونشر مؤخرا ^12. والهدف من هذه المقالة هو لتوفير المزيد من ديتبروتوكول ailed من هذا الإجراء عزل خلايا الكبد وتحليل فرعية للسماح لاستنساخ السليم لهذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن بروتوكول مقارنة مع أسلوب العزلة السابق للتدليل على الاختلافات بالمقارنة مع البروتوكول الجديد.

Protocol

وقد جرت كافة الإجراءات التجريبية بموافقة من الأخلاق ولجان الرعاية الحيوانية من المركز الطبي لجامعة هومبورغ.

1. إعداد المواد والمخازن

1. طازجة إعداد جميع المخازن اللازمة لهضم الكبد باستخدام مكونات معقمة وغطاء الصفحي لتجنب التلوث الجرثومي.
2. إعداد المخزن المؤقت جمع (CB) عن طريق خلط 49.5 مل من RPMI المتوسطة و 0.5 مل من مصل بقري جنيني (FBS، منخفضة الذيفان الداخلي، حرارة المعطل) لتحقيق حل 1٪ (ت / ت). تخزين الحل على الجليد حتى مزيد من الاستخدام.
   ملاحظة: حوالي 25 مل من CB الضروري لهضم الكبد كله واحد.
3. إعداد العازلة الهضم (DB) باستخدام المكونات التالية: RPMI المتوسطة، 1٪ (ت / ت) FBS (الذيفان الداخلي منخفضة، والمعطل الحرارة)، كولاجيناز P (0.2 ملغ / مل)، الدناز-I (0.1 ملغ / مل) وdispase (0.8 ملغ / مل).
   ملاحظة: حوالي 25 مل من DB من الضروري لهضم الكبد كله واحد. قبل تدفئة DB في تيكان 37 ° C حمام الماء قبل الاستخدام.
4. إعادة تشكيل الأنزيمات لدى وصوله في محلول ملحي متوازن هانكس "(HBSS، collagense P وdispase) أو في الدناز-I العازلة (50٪ (ت / ت) الجلسرين، 1 ملم MgCl ₂ و 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5) ، قسامة عليه، وتخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. تخزين الدناز-I العازلة عند 4 درجات مئوية واستخدامها في غضون شهرين.

2. إعداد الكبد وحيدة الخلية تعليق

1. الموت ببطء غير المعالجة من النوع البري الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم وفقا لأخلاقيات المحلية ولجان رعاية الحيوان.
2. وضع الفئران على لوحة التشريح والرطب الفراء مع الايثانول 70٪. باستخدام مقص، فتح البطن مع شق خط الوسط من الجلد، تليها Y-شق نحو الأطراف. فتح الصفاق تصل إلى القص باستخدام المقص. من أجل الكشف عن الكبد وتهجير الأمعاء بلطف إلى الجانب الأيمن باستخدام قطعة من القطن.
3. مع مساعدة من مقص وملقط، إزالة فصوص الكبد،ترك المرارة وراء، وتجنب التلوث مع النسيج الضام. وزن الكبد ووضعه على الجليد في طبق بتري تحتوي HBSS.
4. وضع فصوص الكبد في طبق بتري الجاف وقطع أنسجة الكبد إلى مكعبات متجانسة حوالي 2 مم الجانب باستخدام مشرط. نقل قطع في أنبوب الطرد المركزي 15 مل المخروطية.
5. إضافة 2.5 مل من DB إلى أنبوب مخروطي الطرد المركزي 15 مل تحتوي على قطع الكبد ووضعه في حمام الماء 37 درجة مئوية لبدء عملية الهضم (كبد صحي يأخذ 60-70 دقيقة والكبد تليف يأخذ 80-90 دقيقة ).
   ملاحظة: إذا كان يتم هضمها واحد الكبد كله، يجب فصل الكبد إلى أنبوبين 15 مل المخروطية أجهزة الطرد المركزي لضمان بقاء الخلية جيدة.
6. إعداد 15 مل أنبوب مخروطي أجهزة الطرد المركزي الجديدة لجمع خلايا الكبد الافراج عنهم. وضع مادة البولي بروبيلين 100 ميكرون فلتر شبكة على رأس الأنبوب والرطب يتناغم مع 800 ميكرولتر من CB. وضع أنبوب الطرد المركزي مخروطي على الجليد.
7. مزيج سامPLES في حمام الماء 37 درجة مئوية بعد 5 و 10 دقيقة من أجل دعم عملية الهضم عن طريق هز أنبوب مخروطي الطرد المركزي 15 مل تحتوي على قطع الكبد.
8. 15 دقيقة بعد بدء عملية الهضم، وتخلط بلطف القطع الكبد باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر مع طرف قطع تمكن قطع الكبد لتمرير من خلال بسهولة. وضع أنابيب مرة أخرى في حمام مائي والسماح القطع ليستقر لمدة 2 دقيقة.
9. إزالة طاف تحتوي على خلايا نشرها (عادة 2x أخرى 700 ميكرولتر) وإضافته إلى أنبوب أعدت في الخطوة 2.6. استبدال طاف إزالتها مع DB (2X 700 ميكرولتر) ووضعه مرة أخرى في حمام ماء C 37 درجة.
10. كرر الإجراء هو موضح في الخطوة 2.8 (عادة في 30، 40، 50، 55، و 60 دقيقة) حتى مرت حوالي 60-70 دقيقة منذ بداية عملية الهضم. من 40 دقيقة فصاعدا، يجب أن يكون قطع الكبد المتبقية صغيرة بما يكفي لتمرير من خلال تقطيعه 1000 ميكرولتر ماصة.
    ملاحظة: الكبد الصحي هو DIGESTED بالكامل داخل 60-70 دقيقة، في حين كبد متليفة يحتاج عادة 80-90 دقيقة. من خلال هذه النقطة الوقت، ينبغي على أنسجة الكبد لا تكون مرئية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل مخروطي يحتوي على قطع الكبد، ويجب أن يتم نقل جميع الخلايا التي تطلق في أنبوب أعدت في الخطوة 2.6.
11. في نهاية عملية الهضم، وجمع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي لهم لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
12. resuspend الكرية خلية في 1 مل من الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) تحلل العازلة واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لليز خلايا الدم الحمراء. وقف رد الفعل بإضافة 5 مل من CB، ثم الطرد المركزي الخلايا لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2). resuspend الخلايا في 4 مل من CB وتخزينها على الجليد. عد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 3.
    ملاحظة: بيليه الخلية واهية، وبالتالي فإن طاف هو pipetted بعيدا بدلا من أن يصب.

3. تحديد عدد الخلايا باستخدام التدفق الخلوي

ملاحظة: للحصول على تحديد عدد الخلايا، ومكافحة خلية الآلي أو، من الناحية المثالية، ويقترح تدفق الكمي خلية مقرها الخلوي وصفها أدناه بدلا من الأسلوب القائم على الغرفة الكلاسيكية نويباور. تعليق الكبد وحيدة الخلية هو موضح في الخطوة 2 يحتوي على متني وغير متني الخلايا (مجلس الشعب) مع اختلاف إلى حد كبير الأحجام والحبيبات. استبعاد السليم من الحطام الخلوي جنبا إلى جنب مع على النابضة مبعثر إلى الأمام، مبعثر الجانب (FSC-SSC) سمة من سمات الشخصيات عند استخدام التدفق الخلوي يضمن نجاح بروتوكول صفها ^12.

1. إعداد قسامة من تعليق خلايا الكبد (20 ميكرولتر) وإضافة 174 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) و 6 ميكرولتر من اليود propidium (PI، نهاية تركيز 0.375 ميكروغرام / مل). إضافة حبات عد التي تسمح لتقدير حجم الخلايا.
2. على بوابة SSC-A-FSC-A لتجنب الحطام وزيادة استبعاد الحلل باستخدام FSC-H وFCS-A.
   ملاحظة: من المهم أن تتبع استراتيجية النابضة مبين في الشكل 2.
3. بوابة خروج الخلايا الميتة-PI إيجابي، قياس 30 ميكرولتر من العينات الخاصة بك، وتسجيل الأحداث. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لحساب عدد خلايا.
   ملاحظة: اتبع الخطوات من 4 لالتدفق الخلوي القياس، الخطوتين 5 و 6 لالمغناطيسي المعتمدة العزلة خلية سلفية، والخطوتين 7 لالتدفق الخلوي نوع من القطعان السلف.

4. تلون الكبد تعليق خلية واحدة لتحليل الخلوي FOW من السلف مجموعات فرعية

الجسم المضاد	استنساخ	المضيف / نمط إسوي	الأسهم تركيز [مغ / مل]	تخفيف
CD64	X54-5 / 7.1	ماوس IgG1، κ	0.5	1: 100
CD16 / 32	93	الفئران IgG2a، λ	0.5	1: 100
CD45	30-F11	الفئران IgG2b، κ	0.2	1: 200
CD31	MEC13.3	الفئران IgG2a، κ	0.5	1: 200
ASGPR1		بولكلونل الماعز مفتش	0.2	1: 100
Podoplanin	1/8/2001	الهامستر مفتش السوري	0.2	1: 1400
Podoplanin	1/8/2001	الهامستر مفتش السوري	0.5	1: 1400
CD133	Mb9-3G8	فأر IgG1	0.03	3 ميكرولتر
CD133	315-2C11	فأر الإيجG2A، λ	0.5	1: 100
CD34	RAM34	الفئران IgG2a، κ	0.5	1: 100
CD90.2	53-2،1	الفئران IgG2، κ	0.5	1: 800
CD157	BP-3	الماوس IgG2b، κ	0.2	1: 600
EpCAM	G8.8	الفئران IgG2a، κ	0.2	1: 100
هيئة السلع التموينية-1	D7	الفئران IgG2a، κ	0.03	10 ميكرولتر
الماوس IgG2b، κ	MPC-11		0.2
فأر IgG1	RTK2071		0.2
الفئران IgG2b، κ	RTK4530		0.2
الفئران IgG2a، κ	RTK2758		0.5
الفئران IgG2a، κ	RTK2758		0.2
الهامستر مفتش السوري	مجموعات المساعدة الذاتية-1		0.2
الهامستر مفتش السوري	مجموعات المساعدة الذاتية-1		0.5
عادي تحكم الماعز مفتش		بولكلونل الماعز مفتش	1
حمار مكافحة الماعز مفتش		حمار مفتش	2	1: 800
Streptavidin			1	1: 400

الجدول 1.

الجسم المضاد	1	2	3	4	5
CD45 APC / Cy7	الفئران IgG2b، κ 0.5 ميكرولتر	+	+	+	+
CD31 البيوتين	+	الفئران IgG2a، κ 0.5 ميكرولتر	+	+	+
ASGPR1 تنقيته	+	+	عادي تحكم الماعز مفتش 0.2 ميكرولتر	+	+
Podoplanin APC	+	+	+	الهامستر مفتش السوري 1 ميكرولتر من التخفيف 01:14	+
CD133 PE	+	+	+	+	فأر IgG1 0.45 ميكرولتر
حمار مكافحة الماعز فلور اليكسا 488	+	+	+	+	+
Streptavidin فلور اليكسا 405	+	+	+	+	+

الجدول 2.

1. وضع قسامة لتعليق الخلية من الخطوة 2.11 في أنبوب التفاعل (1.5 مل) تحتوي على 2.5 × 10 ⁵ خلايا، والعزم كما هو موضح في الخطوة 3.
2. الطرد المركزي الخلايا لمدة 3 دقائق في 300 x ج و 4 درجات مئوية باستخدام microcentrifuge ل.
   ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن استخدام مضخة فراغ لإزالة بعناية طاف.
3. resuspend الكرية خلية في مزيج FC-كتلة واحتضان لمدة 5 دقائق على الجليد. تحضير مزيج FC-كتلة مع حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر في وصمة عار. إضافة 10 ميكرولتر من حجب FCR الكاشف، 1 ميكرولتر من تنقية مكافحة CD64 (1: 100؛ 0.5 ميكروغرام / وصمة عار)، و 40 ميكرولتر من العازلة تلطيخ (ST المخزن المؤقت: HBSS، 1٪ (ت / ت) FBS، و 0.01٪ أزيد الصوديوم) في وصمة عار.
   ملاحظة: أزيد الصوديوم عالية السمية. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة، مثل القفازات النتريل، معطف المختبر، وقناع الوجه.
4. إضافة 50 ميكرولتر من تلطيخ مزيج من الخلايا (الحجم الكلي للخلايا هو الآن 100 ميكرولتر) واحتضان الخلايا مع مزيج الأجسام المضادة، محمية من الضوء ولمدة 20 دقيقة على الجليد.
5. تحضير مزيج الأجسام المضادة مع حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر في وصمة عار. 50 ميكرولتر من ST العازلة، إضافة الأجسام المضادة التالية مترافق لتلطيخ الأساسي: CD45 (0.5 ميكرولتر، 1: 200؛ 0.1 ميكروغرام / وصمة عار)، CD31 (0.5 ميكرولتر، 1: 200، 0.25 ميكروغرام / وصمة عار)، ASGPR1 (1 ميكرولتر ، 1: 100؛ 0.2 ميكروغرام / وصمة عار)، podoplanin (1 ميكرولتر من تخفيف 01:14، 1: 1400 نهاية التخفيف؛ 0.014 ميكروغرام / وصمة عار)، وCD133 (3 ميكرولتر، 0.09 ميكروغرام / وصمة عار).
   ملاحظة: الجدول1 يلخص استنساخ الضد والتخفيفات المستخدمة للبقع الأساسية وعلامات سطح إضافية من مختلف مجموعات فرعية. إعداد تعليق خلية إضافية لمزيج الأجسام المضادة التي تحتوي على الضوابط نمط إسوي المقابلة و / أو مضان ناقص واحد الضوابط (FMOs)، كما هو مبين في الجدول رقم (2).
6. إضافة 400 ميكرولتر من العازلة ST لكل عينة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 4 دقائق في 300 x ج و 4 درجات C.Discard وطاف resuspend الخلايا في 100 ميليلتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على 0.125 ميكرولتر من حمار المضادة للماعز مفتش (1: 800؛ 0.25 ميكروغرام / وصمة عار) و 0.25 ميكرولتر من streptavidin الفلورسنت، مترافق (1: 400، 0.25 ميكروغرام / وصمة عار) في 100 ميكرولتر من العازلة ST.
7. احتضان الخلايا في حين محمية من الضوء ومع مزيج الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة على الجليد. إضافة 400 ميكرولتر من ST العازلة لكل عينة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا لمدة 4 دقائق في 300 x ج و 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 300 ميكرولتر من ST برتقاليإيه تحتوي على 0.25 ميكروغرام / مل PI.
   ملاحظة: إن بقاء الخلية من الخلايا الاصلية تتناقص مع الوقت. لذا، يقترح لقياس عينات جديدة في أقرب وقت ممكن.

5. المغناطيسي إثراء القائم على ميكروبيدات من خلايا السلف

1. نقل قسامة لتعليق الكبد وحيدة الخلية التي تحتوي على 1.5-2 × 10 ⁶ خلايا، استنادا إلى عدد خلايا تحديد كما هو موضح في الخطوة 3، إلى 15 مل أنبوب مخروطي أجهزة الطرد المركزي الجديدة.
2. الطرد المركزي الخلايا لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
   ملاحظة: عادة، واحد صحي C57BL / 6 الماوس الكبد (أو 1 غرام من أنسجة الكبد) سوف تحتاج إلى أن تكون مفصولة إلى ثلاثة 15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية.
3. Resuspend الخلايا في 400 ميليلتر من HBSS 0.5٪ (ت / ت) زلال المصل البقري (BSA) وإضافة 40 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة CD31 و 30 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة CD45. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: لا تتجاوز رانه حضانة الوقت، ونقاء الفصل ستنخفض بشكل كبير.
4. إضافة 5 مل من HBSS 0.5٪ (ت / ت) BSA للخلايا وأجهزة الطرد المركزي لهم لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
5. Resuspend وبيليه الخلية في 100 ميكرولتر من القتلى الخرز إزالة الخلايا واحتضان لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. في غضون ذلك، وإعداد عمود الفصل LS ومعايرة مع 3 مل من HBSS 0.5٪ (ت / ت) BSA.
   ملاحظة: لا تتجاوز فترة حضانة، ونقاء الفصل ستنخفض بشكل كبير.
6. إضافة 900 ميكرولتر من HBSS 0.5٪ (ت / ت) BSA إلى الخلايا، وتصفية لهم باستخدام 100 ميكرون تصفية مادة البولي أميد شبكة، وتحميلها على العمود فصل ليرة سورية.
   ملاحظة: تحميل واحد الكبد كامل على عمود الفصل LS واحد.
7. غسل العمود ثلاث مرات مع 3 مل من HBSS 0.5٪ (ت / ت) BSA وجمع من خلال تدفق.
8. أجهزة الطرد المركزي من خلال تدفق لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام انخفاض الملحقات وleration / 4 والتباطؤ / 2).
9. Resuspend وبيليه الخلية إما في الشطف عازلة (RB) (PBS و 2 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)) تحتوي على 0.5٪ (ت / ت) BSA أو عازلة ST، وهذا يتوقف على إجراء مزيد من التجارب.

الآلي تنقية خلية مقرها ميكروبيدات-6. المغناطيسي للمجموعات فرعية خلية سلفية الجامع من الأكباد متعددة

ملاحظة: منذ فرعية خلية سلفية تمثل السكان الخلية نادرة، وغالبا ما يحتاج الجمع بين الخلايا من الكبد متعددة لتحقيق أرقام خلية كافية لمزيد من التجارب. وكمثال على ذلك، CD133 ⁺ وgp38 ⁺ فصل الخلية هو موضح أدناه.

1. عزل CD133 ⁺ الأسلاف
   1. بعد الخطوة 5.9، عد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 3، و resuspend ما يصل الى 10 ⁶ خلايا (عادة تجميع 4-6 عينات الكبد السليمة) في 100 ميليلتر من RB.
   2. إضافة مكافحة CD64 1: 100 ومعاداة CD16 / 32 1: 100 إلى الخلايا وincubيأكلونها على الجليد لمدة 5 دقائق. إضافة 1: 100 المضادة CD133 الضد البيروكسيديز إلى الخلايا واحتضان لهم على الجليد لمدة 10 دقيقة أخرى.
   3. إضافة 5 مل من RB وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
   4. Resuspend الخلايا في 400 ميكرولتر من RB وإضافة 10 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة البيوتين. احتضان العينة لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. لا تتجاوز فترة حضانة، لأن هذا يقلل من نقاء العينات.
   5. إضافة 5 مل من RB وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2). resuspend الكرية في 1 مل من RB.
2. عزل gp38 ⁺ الأسلاف
   1. بعد الخطوة 5.9، عد الخلايا، كما هو موضح في الخطوة 3، و resuspend ما يصل الى 10 ⁶ خلايا (عادة تجميع 4-6 عينات الكبد السليمة) في 100 ميليلتر من RB.
   2. إضافة مكافحة CD64 1: 100 ومعاداة CD16 / 32 1: 100 إلى الخلايا واحتضان لهم على الجليد لمدة 5 دقائق. التالي، إضافة 1:100 المضادة للgp38 البيروكسيديز الأجسام المضادة للخلايا واحتضان لهم على الجليد لمدة 10 دقيقة أخرى.
   3. إضافة 5 مل من RB وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
   4. Resuspend الخلايا في 400 ميكرولتر من RB وإضافة 5 ميكرولتر من ميكروبيدات مكافحة البيوتين. احتضان العينة لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. لا تتجاوز فترة حضانة، لأن هذا يقلل من نقاء العينات.
   5. إضافة 5 مل من RB وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
   6. resuspend الكرية خلية في 1 مل من RB.
3. الخطوات المشتركة بعد خطوة 6.1 أو 6.2
   1. وضع أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل تحتوي على تعليق خلية وصفت مغناطيسيا على البرد 5 رف مع اثنين من أنابيب فارغة إضافية لجمع الكسور الإيجابية والسلبية. وضع رف البرد على منصة فصل الفاصل.
   2. استخدام برنامج اختيار إيجابي(Possel_d2) مع خطوة الغسيل واسعة بين كل (الخيار شطف) عينة.
      ملاحظة: استخدام القائمة على أعمدة يدوي فصل الخلايا بدلا من الفاصل التلقائي سوف يقلل من نقاء العينة.
   3. جمع جزء إيجابي وأجهزة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في 180 x ج و 4 درجات مئوية (باستخدام تخفيض تسارع / 4 والتباطؤ / 2).
   4. Resuspend وبيليه الخلية إما في RB أو عازلة ST، وهذا يتوقف على إجراء مزيد من التجارب.
   5. لفحص نقاء، واتخاذ قسامة من الخلايا وصمة عار لهم كما هو موضح في الخطوة 4.

7. التدفق الخلوي الفرز الخلية

ملاحظة: هناك نوع عالية النقاء من أي خلية فرعية السلف يمكن أن يتحقق مع البروتوكول هو موضح أدناه. العائد الكلي للخلايا هو أقل بكثير من تلك التي وصفها في الخطوة 6 و هو أفضل لتحليل التعبير الجيني.

معامل	ضبط
فوهة الحجم	85 ميكرون
تكرر	46،00-46،20
سعة	38،30-55،20
مرحلة	0
انخفاض تأخير	28،68-28،84
تخفيف	إيقاف
قطرة الأول	284-297
الهدف الفجوة	9. 14
الضغط	45 رطل

الجدول 3.

1. الحصول على الخلايا من تخصيب مقرها المغناطيسي (كما هو موضح في الخطوة 5)؛ الاعتماد عليها، كما هو موضح في الخطوة 3؛ وصمة عار لهم لعلامات السلف (CD133، gp38)، CD31، CD45 ASGPR1 و، كما هو موضح في الخطوة 4.
2. إعداد فرز المتوسطة (SM): الفينول الأحمر مجانا Dulbecشارك في التعديل المتوسطة النسر (DMEM) تحتوي على 0.5٪ (ت / ت) BSA و 0.01٪ (ت / ت) أزيد الصوديوم. resuspend الخلايا الملون في SM، نقلها إلى البولي بروبلين أنبوب جولة القاع، ووضعها على الجليد.
   ملاحظة: أزيد الصوديوم عالية السمية. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة، مثل القفازات النتريل، معطف المختبر، وقناع الوجه. لا تستخدم أزيد الصوديوم في حالة استخدام الخلايا مرتبة لفحوصات وظيفية.
3. استخدام البرنامج المناسب لنوع فارز تستخدم لعزل الخلايا. فتح البرنامج واتبع إرشادات الشركة المصنعة لإعداد المعلمات الفرز ومواصفات الجهاز.
   ملاحظة: يتم تلخيص مواصفات الجهاز في الجدول 3. في حين مواصفات الجهاز يمكن أن تكون مختلفة في المؤسسات المختلفة، فمن المهم الإشارة إلى أن الحد من الضغط الفرز وحجم أكبر فوهة ضروري (45 رطل وفوهة 85 ميكرون) لزيادة قابلية الخلية السلف populatأيون ونوعية الحمض النووي الريبي أعدت من الخلايا فرزها. من المهم أن استخدام الخلايا الاولية الكبد المخصب لتحديد التعويض. الكبد أو الكريات البيض الشعوب الأخرى ومختلفة لصناعة السيارات في مضان ونتيجة في قرار دون المستوى الأمثل من السكان انسجة وفي استراتيجية النابضة كاذبة.
4. معايرة الجهاز ووضع 5 مل البولي بروبلين أنبوب جولة القاع التي تحتوي على 350 ميكرولتر من SM في الجهاز جمع القبيل. بدء اكتساب العينة والنوع. جمع 1000 أحداث حيوانية ووقف تدفق العينة.
5. أن الأنبوب من جهاز فرز وقياس الخلايا التي تم فرزها على قياس التدفق الخلوي. تحديد النسبة المئوية من السكان خلية فرزها الحالي بين الخلايا الحية. هذه النسبة تعطي نقاء للخلايا فرزها.
6. إذا تجاوز نوع نقاء 95٪، وضع 5 مل البولي بروبلين أنبوب جولة القاع التي تحتوي على 350 ميكرولتر من تحلل العازلة RLT في الجهاز جمع القبيل.
7. بدء فرز وجمع 7،000-10000 الأحداث في حيوانية اللحمية.
8. نقل العازلة تحلل RLT تحتوي على خلايا مرتبة في أنبوب رد فعل DNase- وريبونوكلياز خالية وتخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل.

النتائج

الإجراء المقدمة هنا لهضم الكبد باستخدام مزيج رواية النتائج الانزيمات في تعليق وحيد الخلية التي تحتوي على متني وخلايا الكبد غير متني (الشكلان 1 و 2A). بعد ACK-الناشر خلايا الدم الحمراء، والتدفق المباشر الخلوي تحليل تعليق وحيد الخلية ه...

Discussion

التهاب الكبد والإصابة من أصول مختلفة تؤدي عمليات التجدد في الكبد التي تصاحبها التوسع خلية سلفية وتفعيل ^{2 و 3.} هذه الخلايا الاصلية الكبد تمتلك وقف خصائص الخلية، ومن المرجح تلعب دورا هاما في ميكانيكية حدوث أمراض الكبد المختلفة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Life Technologies	21875-034
phenol red free DMEM	Life Technologies	31053-028
FBS	Life Technologies	10270-106
Collagenase P	Sigma-Aldrich	11249002001
DNAse-I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dispase	Life Technologies	17105041
ACK Lysing Buffer	Life Technologies	A10492-01
HBSS	Life Technologies	14025-050
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002	Prepare 1% stock solution
10% BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	add 0.5% (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM	Sigma-Aldrich	D1145
counting Beads Count Bright	Life Technologies	C36950
PI	Miltenyi Biotec	130-093-233
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
anti-CD31 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-097-418
anti-CD45 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-301
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD64 Purified	BioLegend	139302	Dilution: 1:100
CD16/32 Purified	BioLegend	101302	Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7	BioLegend	103116	Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin	BioLegend	102504	Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified	Bio-Techne	AF2755-SP	Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC	BioLegend	127410	Dilution: 1:1,400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin	BioLegend	127404	Dilution: 1:1,400
CD133 PE	Miltenyi Biotec	130-102-210	use 3 µL, marks progenitor cells
CD133 Biotin	BioLegend	141206	Dilution: 1:100
CD34 Biotin	eBioScience	13-0341-81	Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue	BioLegend	140306	Dilution: 1:800
CD157 PE	BioLegend	140203	Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421	BioLegend	118225	Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin	Miltenyi Biotec	130-101-885	use 10 µL
Mouse IgG2b, κ PE	BioLegend	400311
Rat IgG1 PE	BioLegend	400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7	BioLegend	400624
Rat IgG2a, κ Biotin	BioLegend	400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421	BioLegend	400535
Syrian Hamster IgG APC	BioLegend	402012
Syrian Hamster IgG Biotin	BioLegend	402004
Normal Goat IgG Control Purified	Bio-Techne	AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11055	Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405	Life Technologies	S32351	Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh	A. Hartenstein	PAS3
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	130-096-343
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
FACS AriaTMIII	BD Biosciences
FACSDiva sofware	BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube	Falcon	352063
Rneasy plus mini kit	Qiagen	74134	RLT lysis buffer is included