Isolamento e Enriquecimento de fígado progenitoras Subconjuntos identificado por um marcador combinação de superfícies Novel

Resumo

lesões no figado são acompanhadas por expansão de células progenitoras que representa uma população celular heterogénea. classificação Novel deste compartimento celular permite a distinção dos vários subgrupos. O método descrito aqui ilustra a análise de citometria de fluxo e de alta pureza isolamento de vários subconjuntos que podem ser utilizadas para ensaios posteriores.

Resumo

Durante a lesões crónicas do fígado, células progenitoras expandir num processo chamado de reacção ductular, o que também implica o aparecimento de infiltrado celular inflamatório e a activação da célula epitelial. A população de células progenitoras durante essas reações inflamatórias tem sido principalmente investigado utilizando marcadores de superfície individuais, quer por análise histológica, ou por fluxo de técnicas baseadas em citometria. No entanto, os novos marcadores de superfície identificados vários subconjuntos funcionalmente distintas dentro do progenitor fígado / haste compartimento da célula. O método aqui apresentado descreve o isolamento e análise de citometria de fluxo detalhado de subconjuntos progenitoras usando combinações novo marcador de superfície. Além disso, demonstra como os vários subconjuntos de células progenitoras pode ser isolado com pureza elevada utilizando métodos automatizados magnética e separação por FACS com base em. Importante, novos e enzimática simplificado dissociação do fígado permite o isolamento destas populações de células raras com uma alta viabilidadeque é superior em comparação com outros métodos existentes. Isto é especialmente relevante para o estudo de mais células progenitoras in vitro ou para o isolamento de ARN de alta qualidade para analisar o perfil de expressão do gene.

Introdução

A regeneração hepática é geralmente associada com a capacidade de auto-renovação de hepatócitos. No entanto, as lesões crónicas do fígado ocorrem com a activação de células progenitoras e de expansão, que têm sido associadas com a sua capacidade de se diferenciar em hepatócitos e cholangiocytes ^{1, 2, 3, 4.} Isto é especialmente relevante porque, durante a lesões crónicas, a proliferação de hepatócitos não é eficaz. Apesar de vários estudos de rastreamento genético visando células progenitoras, o seu papel na regeneração hepática permanece controverso ^{5, 6, 7, 8.} Além disso, a activação de células progenitoras tem sido associada ao aumento da resposta fibrótica no fígado, o que levanta dúvidas sobre a sua função exacta durante ⁹ lesões, ^10.

A heterogeneidade do compartimento de células progenitoras tem sido sugerido por estudos de expressão gênica que isolaram células progenitoras expressam um único marcador de superfície usando microdissection ou célula métodos baseados em triagem ^{1, 11.} De fato, recentemente, uma combinação marcador de superfície utilizando gp38 novel (podoplanina) inequivocamente marcadores individuais anteriores de células progenitoras para vários subconjuntos ^12. É importante ressaltar que esses subgrupos não só diferem na sua expressão do marcador da superfície, mas também exibiram alterações funcionais durante a lesões ^12.

Vários modelos animais têm sido utilizados para investigar a activação de células progenitoras e a regeneração do fígado. Parece que os vários tipos de lesões promover a activação de diferentes subconjuntos de células progenitoras ^12. Isto pode explicar o pHdivergência enotypic da reacção ductular observada em seres humanos ^4. Assim, os fenotípicas e funcionais análises complexas de células progenitoras são fundamentais para compreender o seu papel na lesões e o verdadeiro significado da reação ductular em doenças do fígado.

Além combinações de marcadores de superfície, as diferenças cruciais em protocolos de isolamento de células complicar ainda mais as conclusões baseadas em estudos anteriores ^2. Uma quantidade substancial de estudos abordaram o papel das células progenitoras que diferem muito em sua protocolo de isolamento (por exemplo, a dissociação do fígado (combinação de enzimas e duração do processo), de média densidade e velocidade de centrifugação) ^2. Uma técnica de isolamento otimizado, proporcionando uma melhor viabilidade para populações de células raras e reflexiva da composição subconjunto, foi desenvolvido e publicado recentemente ^12. O objetivo deste artigo é fornecer uma forma mais detProtocolo ailed deste procedimento de isolamento de células do fígado e o subconjunto de análise para permitir a reprodução apropriada da técnica. Além disso, o protocolo inclui uma comparação com o método de isolamento anterior para demonstrar as diferenças em comparação com o novo protocolo.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação dos Comitês de Ética e de cuidados de animais da Universidade de Homburg Medical Center.

1. Preparação de Materiais e buffers

1. Recém preparar todos os buffers necessários para a digestão do fígado utilizando componentes estéreis e uma capa laminar para evitar a contaminação bacteriana.
2. Preparar o tampão de recolha (CB) através da mistura de 49,5 mL de meio RPMI e 0,5 mL de soro bovino fetal (FBS; baixa endotoxina, inactivado pelo calor) para conseguir uma solução a 1% (v / v). Guardar a solução em gelo até posterior utilização.
   NOTA: Cerca de 25 ml de CB é necessário para digerir um fígado inteiro.
3. Preparar o tampão de digestão (DB), utilizando os seguintes ingredientes: meio RPMI, 1% (v / v) de FBS (baixa endotoxina, inactivado pelo calor), colagenase P (0,2 mg / mL), ADNase-I (0,1 mg / ml) , e dispase (0,8 mg / mL).
   NOTA: Aproximadamente 25 ml de DB é necessário para digerir um fígado inteiro. Pré-aquecer o DB em tele 37 ° C banho de água antes do uso.
4. Reconstituir as enzimas à chegada em solução salina equilibrada de Hanks (HBSS; collagense P e dispase) ou em ADNase-I de tampão (50% (v / v) de glicerol, 1 mM de _MgCl2, e 20 mM Tris-HCl; pH 7,5) , alíquota lo e armazená-lo a -20 ° C. Armazenar a ADNase-I de tampão a 4 ° C e usá-lo dentro de dois meses.

2. Preparação de fígado de suspensão de célula única

1. Euthanize camundongos selvagens não tratados por deslocamento cervical, de acordo com a ética locais e os comités de cuidados de animais.
2. Coloque os ratos em uma placa de dissecação e molhar a pele com etanol 70%. Com uma tesoura, abrir o abdómen com uma incisão na linha média da pele, seguido por uma incisão em Y para os membros. Abra o peritônio-se ao esterno usando a tesoura. A fim de descobrir o fígado, o intestino deslocar suavemente para o lado direito utilizando um cotonete.
3. Com a ajuda de fórceps e tesouras, remover os lóbulos do fígado,deixando a vesícula biliar para trás, e evitar a contaminação com o tecido conjuntivo. Pesa-se o fígado e coloca-lo sobre gelo numa placa de Petri contendo HBSS.
4. Colocar os lóbulos do fígado em uma placa de Petri, seco e cortar o tecido hepático em cubos homogéneos cerca de 2 mm de cada lado, usando um bisturi. Transferir as peças para um tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
5. Adicionar 2,5 ml de DB para o tubo de centrífuga cónico de 15 ml, contendo os pedaços de fígado e colocá-lo num banho de água a 37 ° C para iniciar o processo de digestão (um fígado saudável leva 60-70 min e um fígado cirrótico leva 80-90 min ).
   NOTA: Se um inteiro fígado está a ser digerida, o fígado deve ser separado em dois tubos de 15 ml de centrífuga cónico para garantir uma boa viabilidade celular.
6. Prepare um novo tubo cônico de centrífuga de 15 mL para coletar células hepáticas liberadas. Coloque uma poliamida de 100 mícrons de malha de filtro na parte superior do tubo e molhar a malha com 800 ul de CB. Colocar o tubo de centrífuga cónico em gelo.
7. Misture a sampios no banho de água a 37 ° C, após 5 e 10 minutos, a fim de apoiar o processo de digestão por agitação do tubo cónico de centrifugação de 15 ml, contendo os pedaços de fígado.
8. 15 min após o início da digestão, misture delicadamente os pedaços de fígado, utilizando uma pipeta de 1000 mL com uma ponta de corte que permite que os pedaços de fígado atravessar facilmente. Colocar os tubos de volta para o banho de água e permitir que as peças para resolver durante 2 min.
9. Remover o sobrenadante contendo as células disseminadas (tipicamente 2 x 700 mL) e adicioná-lo ao tubo preparado no passo 2.6. Substitua o sobrenadante removido com DB (2x 700 mL) e colocá-lo de volta para o banho de água a 37 ° C.
10. Repetir o procedimento descrito no passo 2.8 (tipicamente a 30, 40, 50, 55, e 60 min) até cerca de 60-70 min passaram desde o início da digestão. A partir de 40 min em diante, os pedaços de fígado restantes devem ser pequenas o suficiente para passar através de um sem cortes ponta da pipeta de 1000 mL.
    NOTA: fígado saudável é Digested totalmente dentro de 60-70 min, enquanto fígado fibrótico normalmente precisa 80-90 min. Por este ponto do tempo, o tecido do fígado não deve ser visível no tubo cónico de centrifugação de 15 ml, contendo os pedaços de fígado, e todas as células libertadas deve ser transferida para dentro do tubo, preparado no passo 2.6.
11. No final do processo de digestão, recolher as células e centrifugar-los durante 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida de aceleração / desaceleração e 4/2).
12. Ressuspender o sedimento de células em 1 mL de cloreto de amónio-potássio-(ACK) de tampão de lise e incubar-lo durante 1 min à temperatura ambiente, a fim de lisar as células vermelhas do sangue. Parar a reacção por adição de 5 mL de CB, e depois centrifugar as células durante 8 minutos a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida de aceleração / desaceleração e 4/2). Ressuspender as células em 4 ml de CB e armazená-los em gelo. Contar as células, tal como descrito no passo 3.
    NOTA: O sedimento celular é solto, e, por conseguinte, o sobrenadante é pipetado distância em vez de ser decantado.

3. A determinação do teor celular utilizando Citometria de Fluxo

NOTA: Para a determinação das contagens de células, um contador de células automatizado ou, idealmente, a quantificação das células à base de citometria de fluxo está descrito abaixo sugeridas em vez do método baseado em câmara clássica de Neubauer. A suspensão de uma única célula do fígado descrito no passo 2 contém células do parênquima e não-parenquimatosas (NPC) com muito diferentes tamanhos e granularities. A exclusão adequada de restos celulares em conjunto com o gating em dispersão para a frente, dispersão lateral (FSC-SSC) característica de NPCs quando se utiliza citometria de fluxo garante o sucesso do protocolo descrito ^12.

1. Prepara-se uma alíquota da suspensão de células do fígado (20 mL) e adicionar 174 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 6 uL de iodo de propídio (PI; concentração final de 0,375 ug / mL). Adicionar grânulos de contagem que permitem a quantificação das células.
2. Portão em SSC-A-FSC-A para evitar detritos e excluir ainda mais dupletos utilizando FSC-H e FCS-A.
   NOTA: É importante seguir a estratégia gating representada na Figura 2.
3. Portão para fora células mortas da PI-positivas, medir 30 mL de suas amostras, e gravar os eventos. Siga orientação do fabricante para calcular a contagem de células.
   NOTA: Siga as etapas 4 de citometria de fluxo de medição, as etapas 5 e 6 para o isolamento de células progenitoras com base magnética, e os passos 7 para citometria de fluxo tipo de subpopulações progenitoras.

4. A coloração da suspensão de célula única de fígado para o Fow análise de citometria de Progenitor Subconjuntos

Anticorpo	Clone	Anfitrião / Isotype	Concentração da [mg / ml]	Diluição
CD64	X54-5 / 7.1	IgG1, κ	0,5	1: 100
CD16 / 32	93	Rato IgG2a, λ	0,5	1: 100
CD45	30-F11	IgG2b de rato, κ	0,2	1: 200
CD31	MEC13.3	Rato IgG2a, κ	0,5	1: 200
ASGPR1		IgG policlonal de cabra	0,2	1: 100
podoplanina	2001/01/08	IgG hamster sírio	0,2	1: 1400
podoplanina	2001/01/08	IgG hamster sírio	0,5	1: 1400
CD133	Mb9-3G8	IgG1 de rato	0,03	3 mL
CD133	315-2C11	Ig de ratoG2a, λ	0,5	1: 100
CD34	RAM34	Rato IgG2a, κ	0,5	1: 100
CD90.2	53-2,1	Rato IgG2, κ	0,5	1: 800
CD157	BP-3	Rato IgG2b, κ	0,2	1: 600
EpCAM	G8.8	Rato IgG2a, κ	0,2	1: 100
Sca-1	D7	Rato IgG2a, κ	0,03	10 ul
Rato IgG2b, κ	MPC-11		0,2
IgG1 de rato	RTK2071		0,2
IgG2b de rato, κ	RTK4530		0,2
Rato IgG2a, κ	RTK2758		0,5
Rato IgG2a, κ	RTK2758		0,2
IgG hamster sírio	SHG-1		0,2
IgG hamster sírio	SHG-1		0,5
Controle de cabra IgG normal		IgG policlonal de cabra	1
IgG anti-cabra de burro		IgG de burro	2	1: 800
estreptavidina			1	1: 400

Tabela 1.

Anticorpo	1	2	3	4	5
CD45 APC / Cy7	IgG2b de rato, κ 0,5 ul	+	+	+	+
CD31 Biotina	+	Rato IgG2a, κ 0,5 ul	+	+	+
ASGPR1 purificado	+	+	Controle de cabra IgG normal 0,2 mL	+	+
podoplanina APC	+	+	+	IgG hamster sírio 1 uL de uma diluição 1:14	+
CD133 PE	+	+	+	+	IgG1 de rato 0,45 mL
Burro anti-cabra Alexa Fluor 488	+	+	+	+	+
estreptavidina Alexa Fluor 405	+	+	+	+	+

Mesa 2.

1. Colocar uma alíquota da suspensão de células a partir do passo 2.11 para um tubo de reacção (1,5 ml) contendo 2,5 x 10 ⁵ células, determinados tal como descrito na etapa 3.
2. Centrifugar as células durante 3 min a 300 xg e 4 ° C usando uma microcentrífuga.
   NOTA: neste momento, uma bomba de vácuo pode ser utilizado para remover cuidadosamente o sobrenadante.
3. Ressuspender o sedimento de células em mistura de Fc-bloqueio e incubar durante 5 min em gelo. Prepare a mistura de Fc-bloco com um volume total de 50 L por mancha. Adicione 10 ul de reagente de FcR-bloqueio, 1 mL de anticorpos anti-CD64 (1: 100; 0,5 ug / mancha), e 40 uL de tampão de coloração (tampão de ST: HBSS, 1% (v / v) de FBS e 0,01% azida de sódio) por mancha.
   NOTA: A azida de sódio é altamente tóxico. Use equipamento de protecção individual adequado, como luvas de borracha nitrílica, um casaco de laboratório, e uma máscara facial.
4. Adicionar 50 uL de mistura de coloração das células (o volume total de células é agora de 100 uL) e incubar as células com a mistura de anticorpos, protegido da luz e de 20 min em gelo.
5. Preparar a mistura de anticorpo com um volume total de 50 L por mancha. Para 50 ul de tampão de ST, adicione os seguintes anticorpos conjugados para coloração básica: CD45 (0,5 ul; 1: 200; 0,1 g / mancha), CD31 (0,5 ul; 1: 200; 0,25 g / mancha), ASGPR1 (1 mL ; 1: 100; 0,2 ug / mancha), podoplanina (1 ul de uma diluição de 1:14; 1: 1400 de diluição final; 0,014 ug / mancha) e CD133 (3 uL; 0,09 ug / mancha).
   NOTA: Tabela1 resume os clones de anticorpos e diluições utilizadas para manchas básicas e de marcadores de superfície adicionais dos vários subgrupos. Preparar suspensões de células adicionais para a combinação de anticorpo contendo os controlos correspondentes de isotipo e / ou fluorescência menos um controlos (QOM), como representado na Tabela 2.
6. Adicionar 400 mL de tampão de ST para cada amostra e centrifuga-se as células durante 4 minutos a 300 xg e 4 ° C.Discard o sobrenadante e ressuspender as células em 100 uL de mistura de anticorpo secundário contendo 0,125 mL de IgG anti-cabra de burro (1: 800; 0,25 ug / mancha) e 0,25 ul de estreptavidina fluorescente conjugado (1: 400; 0,25 ug / mancha) em 100 mL de tampão de ST.
7. Incubar as células, enquanto protegida da luz e com a mistura de anticorpos durante 20 min em gelo. Adicionar 400 uL de tampão de ST para cada amostra e centrifuga-se as células durante 4 minutos a 300 xg e 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em 300 mL de ST lustreer contendo 0,25 ug / ml de PI.
   NOTA: A viabilidade celular das células progenitoras diminui com o tempo; Portanto, sugere-se para medir amostras frescas o mais rapidamente possível.

5. Magnetic enriquecimento por Microbead de células progenitoras

1. Transferir uma alíquota da suspensão de uma única célula do fígado contendo 1,5-2 x 10 ⁶ células, com base na contagem de células foi determinada como descrito no passo 3, para um novo tubo de centrífuga cónico de 15 ml.
2. Centrifugar as células durante 8 minutos a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida de aceleração / desaceleração e 4/2).
   NOTA: Tipicamente, uma C57BL / 6 de fígado de rato saudável (ou 1 g de tecido de fígado) terão de ser separados em três 15 mL tubo de centrífuga cónico.
3. Ressuspender as células em 400 uL de HBSS 0,5% (v / v) de albumina de soro bovino (BSA) e adicionar 40 ul de microesferas anti-CD31 e 30 ul de microesferas anti-CD45. Incubam-se as células durante 15 min a 4 ° C.
   NOTA: Não exceda tele tempo de incubação, como a pureza da separação será significativamente reduzido.
4. Adicionar 5 ml de HBSS 0,5% (v / v) de BSA para as células e centrifugar-los durante 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida de aceleração / desaceleração e 4/2).
5. Ressuspender o sedimento celular em 100 uL de esferas de remoção de células mortas e incubar à temperatura ambiente durante 15 min. No entanto, preparar uma coluna de separação de LS e a sua calibragem com 3 mL de HBSS 0,5% (v / v) de BSA.
   NOTA: Não exceda o tempo de incubação, como a pureza da separação será significativamente reduzido.
6. Adicionar 900 uL de HBSS 0,5% (v / v) de BSA para as células, filtrá-los usando 100 mícrons de malha de filtro de poliamida, e carregá-los na coluna de separação LS.
   NOTA: Carregue um fígado inteiro para uma coluna de separação LS.
7. Lava-se a coluna três vezes com 3 mL de HBSS 0,5% (v / v) de BSA e recolher o fluxo de passagem.
8. Centrifuga-se o fluxo de passagem de 8 min a 180 xg e 4 ° C (usando Acce reduzidaleration / 4 e desaceleração / 2).
9. Ressuspender o sedimento de células, quer em tampão de lavagem (RB) (PBS e 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)) contendo BSA a 0,5% (v / v) ou tampão de ST, dependendo do procedimento experimental ulterior.

baseada em Microbead 6. Magnetic Automated celular purificação de subconjuntos de células progenitoras combinados de múltiplas Fígados

NOTA: Uma vez que os subconjuntos de células progenitoras representam populações de células raras, combinando células de vários fígados é muitas vezes necessária para atingir o número de células suficientes para novas experiências. Como um exemplo, CD133 ⁺ e gp38 ⁺ separação de células é descrita abaixo.

1. Isolamento de células progenitoras CD133 ⁺
   1. Após o passo 5.9, a contagem das células, como descrito no passo 3, e ressuspender até 10 ⁶ células (tipicamente 4-6 agrupamento de amostras de fígado saudável) em 100 mL de RB.
   2. Adicionar anti-CD64 a 1: 100 e anti-CD16 / 32 1: 100 para as células e incubcomeu-os em gelo por 5 min. Adicionar 1: 100 de anticorpo biotinilado anti-CD133 para as células e incubar em gelo durante mais 10 min.
   3. Adicionar 5 mL de RB e centrifugar por 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida aceleração / 4 e desaceleração / 2).
   4. Ressuspender as células em 400 uL de RB e adicionar 10 ul de microesferas anti-biotina. Incubar a amostra durante 15 min a 4 ° C. Não exceda o tempo de incubação, como o que reduz a pureza das amostras.
   5. Adicionar 5 mL de RB e centrifugar por 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida aceleração / 4 e desaceleração / 2). Ressuspender o sedimento em 1 ml de RB.
2. Isolamento de GP38 ⁺ progenitores
   1. Após o passo 5.9, a contagem das células, como descrito no passo 3, e ressuspender até 10 ⁶ células (tipicamente 4-6 agrupamento de amostras de fígado saudável) em 100 mL de RB.
   2. Adicionar anti-CD64 a 1: 100 e anti-CD16 / 32 1: 100 para as células e incubar em gelo durante 5 min. Em seguida, adicione 1:100 anti-gp38 anticorpo biotinilado para as células e incubar em gelo durante mais 10 min.
   3. Adicionar 5 mL de RB e centrifugar por 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida aceleração / 4 e desaceleração / 2).
   4. Ressuspender as células em 400 uL de RB e adicionam-se 5 ul de microesferas anti-biotina. Incubar a amostra durante 15 min a 4 ° C. Não exceda o tempo de incubação, como o que reduz a pureza das amostras.
   5. Adicionar 5 mL de RB e centrifugar por 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida aceleração / 4 e desaceleração / 2).
   6. Ressuspender o sedimento celular em 1 ml de RB.
3. passos comuns após o passo 6.1 ou 6.2
   1. Colocar o tubo de centrífuga cónico de 15 ml contendo as suspensões de células marcadas magneticamente sobre uma cremalheira 5 frio com dois tubos vazios adicionais para a recolha das fracções positivas e negativas. Coloque a cremalheira frio sobre a plataforma de separação do separador.
   2. Utilize o programa de selecção positiva(Possel_d2) com um passo de lavagem extensiva entre cada amostra (opção de lavagem).
      Nota: O uso de separação manual baseado na coluna de células, em vez do separador automático irá reduzir a pureza da amostra.
   3. Recolher a fracção positiva e centrifuga-se durante 8 min a 180 xg e 4 ° C (utilizando reduzida de aceleração / desaceleração e 4/2).
   4. Ressuspender o sedimento de células, quer em tampão RB ou ST, dependendo do procedimento experimental ulterior.
   5. Para uma verificação de pureza, tomar uma alíquota das células e mancham-los conforme descrito na etapa 4.

7. Citometria de Fluxo Seleção celular

NOTA: Uma elevada pureza tipo de qualquer subconjunto de células progenitoras pode ser obtida com o protocolo descrito abaixo. O rendimento total de células é muito inferior à que se descreveu no passo 6 e é melhor para a análise de expressão génica.

Parâmetro	Configuração
Bico Tamanho	85 uM
Freqüência	46,00-46,20
Amplitude	38,30-55,20
Estágio	0
gota Delay	28,68-28,84
Atenuação	Fora
primeiro Gota	284-297
alvo Gap	9.-14
Pressão	45 psi

Tabela 3.

1. Adquirir células do enriquecimento magnético à base de (descrito na etapa 5); contá-los, tal como descrito no passo 3; e mancham-los para os marcadores progenitoras (CD133, gp38), CD31, e CD45 ASGPR1, tal como explicado no passo 4.
2. Prepare triagem médio (SM): fenol-vermelho livre DulbecMeio de modificação co de Eagle (DMEM) contendo 0,5% (v / v) de BSA e 0,01% (v / v) de azida de sódio. Volte a suspender as células coradas em SM, transferi-los para um tubo de polipropileno de fundo redondo de, e colocá-los no gelo.
   NOTA: A azida de sódio é altamente tóxico. Use equipamento de protecção individual adequado, como luvas de borracha nitrílica, um casaco de laboratório, e uma máscara facial. Não utilizar azida de sódio se as células escolhidas são utilizadas para ensaios funcionais.
3. Usar o software apropriado para o tipo de classificador utilizado para o isolamento de células. Abra o software e seguir as instruções do fabricante para configurar os parâmetros de classificação e especificações da máquina.
   NOTA: As especificações da máquina encontram-se resumidos na Tabela 3. Apesar das especificações da máquina poderia ser diferente em diversas instituições, é importante notar que a redução de pressão de triagem e de um tamanho maior do bico é necessário (45 psi e bocal 85 uM) para aumentar a viabilidade da célula progenitora populatde iões e a qualidade do ARN preparado a partir das células separadas. É importante a utilização de células progenitoras do fígado enriquecido para definir a compensação. Outras populações de fígado ou leucócitos têm diferentes auto-fluorescência e resultado numa resolução subóptima de a população estromal e em uma estratégia gating falsa.
4. Calibrar a máquina e colocar um tubo de fundo redondo de 5 mL de polipropileno contendo 350 mL de SM no dispositivo de recolha de classificação. Comece a aquisição de amostras e classificar. Recolha 1.000 eventos da subpopulação e parar o fluxo da amostra.
5. Pegue o tubo para fora do dispositivo de classificação e medir as células ordenadas no citômetro de fluxo. Identificar a percentagem da população celular classificada presente entre as células vivas. Esta percentagem dá a pureza das células separadas.
6. Se a pureza tipo excede 95%, colocar um tubo de fundo redondo de 5 mL de polipropileno contendo 350 mL de tampão de lise RLT no dispositivo de recolha de classificação.
7. Comece o tipo e recolher 7.00010000 eventos por subpopulação estromal.
8. Transferir o tampão de lise contendo RLT as células separadas em um tubo de reacção e DNase isenta de RNase e armazenar as amostras à temperatura de -80 ° C até análise posterior.

Resultados

O procedimento aqui apresentado para a digestão do fígado utilizando uma nova mistura de enzimas resulta numa suspensão de uma única célula contendo parenquimatosa do fígado e células não-parenquimatosas (Figuras 1 e 2a). Após a lise ACK-de células vermelhas do sangue, o fluxo directo análise de citometria da suspensão de célula única é possível (Figuras 1 e 2). A estratégia envolve a propagação de exc...

Discussão

Inflamação do fígado e lesões de diferentes origens desencadear processos regenerativos no fígado que são acompanhados pela expansão de células progenitoras e ativação ^{2, 3.} Estas células progenitoras do fígado possuem características de células-tronco e provavelmente desempenham um papel importante no mecanismo patológico de várias doenças do fígado.

A heterogeneidade das células progenitoras do fígado tem sido s...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI	Life Technologies	21875-034
phenol red free DMEM	Life Technologies	31053-028
FBS	Life Technologies	10270-106
Collagenase P	Sigma-Aldrich	11249002001
DNAse-I	Sigma-Aldrich	10104159001
Dispase	Life Technologies	17105041
ACK Lysing Buffer	Life Technologies	A10492-01
HBSS	Life Technologies	14025-050
PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Sodium Azide	Sigma-Aldrich	S2002	Prepare 1% stock solution
10% BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
autoMACS Rinsing Solution	Miltenyi Biotec	130-091-222	add 0.5% (v/v) BSA and store on ice
Phenol-red free DMEM	Sigma-Aldrich	D1145
counting Beads Count Bright	Life Technologies	C36950
PI	Miltenyi Biotec	130-093-233
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	130-092-575
anti-CD31 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-097-418
anti-CD45 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-052-301
Dead Cell Removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101
anti-Biotin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD64 Purified	BioLegend	139302	Dilution: 1:100
CD16/32 Purified	BioLegend	101302	Dilution: 1:100
CD45 APC/Cy7	BioLegend	103116	Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells
CD31 Biotin	BioLegend	102504	Dilution: 1:200, marks endothelial cells
ASGPR1 Purified	Bio-Techne	AF2755-SP	Dilution: 1:100, marks hepatocytes
Podoplanin APC	BioLegend	127410	Dilution: 1:1,400, marks progenior cells
Podoplanin Biotin	BioLegend	127404	Dilution: 1:1,400
CD133 PE	Miltenyi Biotec	130-102-210	use 3 µL, marks progenitor cells
CD133 Biotin	BioLegend	141206	Dilution: 1:100
CD34 Biotin	eBioScience	13-0341-81	Dilution: 1:100
CD90.2 Pacific Blue	BioLegend	140306	Dilution: 1:800
CD157 PE	BioLegend	140203	Dilution: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421	BioLegend	118225	Dilution: 1:100
Sca-1 Biotin	Miltenyi Biotec	130-101-885	use 10 µL
Mouse IgG2b, κ PE	BioLegend	400311
Rat IgG1 PE	BioLegend	400407
Rat IgG2b, κ APC/Cy7	BioLegend	400624
Rat IgG2a, κ Biotin	BioLegend	400504
Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421	BioLegend	400535
Syrian Hamster IgG APC	BioLegend	402012
Syrian Hamster IgG Biotin	BioLegend	402004
Normal Goat IgG Control Purified	Bio-Techne	AB-108-C
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11055	Dilution: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405	Life Technologies	S32351	Dilution: 1:400
100 µm Filter mesh	A. Hartenstein	PAS3
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
MACSQuant Analyzer 10	Miltenyi Biotec	130-096-343
AutoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
FACS AriaTMIII	BD Biosciences
FACSDiva sofware	BD Biosciences
Polypropylene Round bottom tube	Falcon	352063
Rneasy plus mini kit	Qiagen	74134	RLT lysis buffer is included